Summary
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט המאפשר הערכה חוץ גופית של שפע המיקרו-רנ"א המסומן באופן פלואורסצנטי כדי לחקור את הדינמיקה של אריזות מיקרו-רנ"א ולייצא לשלפוחיות חוץ-תאיות (EV).
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מתווכות חשובות של תקשורת תאית המופרשות על-ידי מגוון תאים שונים. כלי רכב חשמליים אלה מעבירים מולקולות ביו-אקטיביות, כולל חלבונים, שומנים וחומצות גרעין (דנ"א, mRNAs, מיקרו-רנ"א ורנ"א לא מקודד אחר), מתא אחד למשנהו, מה שמוביל לתוצאות פנוטיפיות בתאים המקבלים. מכל מטעני הרכב החשמליים השונים, מיקרו-רנ"א (miRNAs) זכו לתשומת לב רבה בשל תפקידם בעיצוב המיקרו-סביבה ובחינוך התאים המקבלים בשל חוסר הוויסות הברור שלהם והשפע שלהם ברכב חשמלי. נתונים נוספים מצביעים על כך שהרבה miRNA נטענים באופן פעיל לתוך כלי רכב חשמליים. למרות ראיות ברורות אלה, המחקר על הדינמיקה של הייצוא ומנגנוני מיון miRNA מוגבל. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה של EV-miRNA שניתן להשתמש בו כדי להבין את הדינמיקה של טעינת EV-miRNA ולזהות את המכונות המעורבות בייצוא miRNA. בפרוטוקול זה, miRNA שנקבע מראש כי הוא מועשר ברכבים חשמליים ומדולדל מתאי התורם מצומד לפלואורופור ומוזרם לתאי התורם. לאחר מכן, ה-miRNA המתויגים באופן פלואורסצנטי מאומתים לטעינה לרכבים חשמליים ולהתרוקנות מתאים באמצעות qRT-PCR. הן כבקרת טרנספקציה והן ככלי לנטרול אוכלוסיית התאים הנגועים, נכלל רנ"א תאי עם תווית פלואורסצנטית (תאים שמורים ומרוקנים מ-EV). תאים הנגועים הן ב-EV-miRNA והן ב-miRNA שנשמר בתאים מוערכים לאותות פלואורסצנטיים במהלך 72 שעות. עוצמת האות הפלואורסצנטי הספציפית ל-EV-miRNA פוחתת במהירות בהשוואה ל-miRNA השמור בתאים. באמצעות פרוטוקול פשוט זה, ניתן כעת להעריך את הדינמיקה של טעינת miRNA ולזהות גורמים שונים האחראים לטעינת miRNA לתוך כלי רכב חשמליים.
Introduction
מיקרו-רנ"א (miRNAs) הוא אחת מתת-הקבוצות המאופיינות ביותר של רנ"א קטן שאינו מקודד, הידועות בתפקידן הקריטי בוויסות גנים לאחר שעתוק. הביטוי והביוגנזה של רוב ה-miRNAs עוקבים אחר סדרה מתואמת של אירועים שמתחילה בשעתוק של ה-miRNA הראשוני (pri-miRNAs) בגרעין. לאחר עיבוד גרעיני על ידי קומפלקס המיקרו-מעבדים לתוך precursor-miRNA (pre-miRNAs), pre-miRNAs מיוצאים לציטופלסמה, שם הם עוברים עיבוד נוסף על ידי אנדונוקלאז RNase III, dicer לתוך 21-23 נוקלאוטיד בוגר miRNA דופלקסים1. אחד הגדילים של ה-miRNA הבוגר המעובד נקשר ל-mRNA שליח המטרה (mRNAs), מה שמוביל לפירוק או לדיכוי תרגומי של המטרות2. בהתבסס על התפקיד הפליוטרופי של miRNAs בוויסות סימולטני של מספר mRNA מטרות מגוונות, אין זה מפתיע שביטוי miRNA מווסת היטב3. אכן, ביטוי לא הולם תורם למצבי מחלה שונים, במיוחד בסרטן. הביטוי החריג של miRNAs לא רק מייצג חתימה ספציפית למחלה, אלא גם התגלה כיעד לפוטנציאל פרוגנוסטי וטיפולי 4,5,6. בנוסף לתפקידים התוך-תאיים שלהם, ל-miRNA יש גם תפקידים לא אוטונומיים. לדוגמה, miRNA יכול להיות ארוז באופן סלקטיבי לתוך EVs על ידי תאים תורמים ולייצא לאתרים מושתלים, שם הם מעוררים תגובות פנוטיפיות מגוונות בפיזיולוגיה נורמלית ומחלות 7,8,9.
למרות ראיות ברורות לכך ש-miRNA הקשור לרכב חשמלי הוא ביומולקולות פונקציונליות, לא לגמרי מובן כיצד תת-קבוצות ספציפיות של miRNA אינן מווסתות במצבי מחלה כגון סרטן, וכיצד מנגנון תאי בוחר וממיין miRNA ל-Evs10,11. בהתחשב בתפקיד הפוטנציאלי של EV-miRNA בוויסות המיקרו-סביבה, חיוני לזהות את המנגנונים המעורבים בייצוא miRNA נבחרים כדי להבהיר באופן מלא את תפקידם של כלי רכב חשמליים בתקשורת בין-תאית ובפתוגנזה של מחלות. הבנת תהליך שחרור miRNA לרכבים חשמליים לא רק תדגיש מתווכים חשובים של ייצוא miRNA, אלא גם יכולה לספק תובנות לגבי טיפולים פוטנציאליים. כדי להשיג רמה זו של ידע, יש להתאים כלים כדי לענות נאמנה על שאלות ניסוייות חדשות אלה. ואכן, מחקרים המעריכים כלי רכב חשמליים גדלים באופן אקספוננציאלי עקב הכנסת טכניקות ובקרות חדשות12,13. ביחס להערכת השפע של miRNA מיוצא לכלי רכב חשמליים, ריצוף הדור הבא ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (qRT-PCR) היו הכלים הסטנדרטיים הנוכחיים. בעוד שכלים אלה שימושיים להערכת שפע ה-miRNA ברכבים חשמליים, יש מגבלות לרגישות ולספציפיות שלהם, והשימוש בגישות סטטיות אלה להערכת דינמיקה אינו מספיק. הגדרת הדינמיקה של ייצוא miRNA לרכבים חשמליים דורשת שילוב של כלים מיוחדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף באמצעות miRNA מצומד פלואורסצנטית, כדי לנתח את הדינמיקה של שחרור miRNA מתאי תורם ושילוב לתוך EVs. כמו כן, אנו דנים ביתרונות ובמגבלות השיטה ומספקים המלצות לשימוש מיטבי. השיטה הרב-תכליתית המוצגת במאמר זה תהיה שימושית לחוקרים המעוניינים לחקור שחרור miRNA לרכבים חשמליים ואת תפקידם הפוטנציאלי בתקשורת תאית ובמחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כתנאי מוקדם לשימוש בטכניקה זו, נדרש זיהוי ואימות של miRNA המיוצאים באופן סלקטיבי. מאחר שקווי תאים שונים משתנים בהתאם למטען ה-miRNA הממוין לרכבים החשמליים שלהם, מומלץ להעריך את קו התאים המעניין ואת כלי הרכב החשמליים הקשורים אליו לפני השימוש. בנוסף, טרנספקציה מבוססת ליפופקטמין היא אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול; מומלץ לקבוע מראש את יעילות הטרנספקציה לפני הגדרת הניסוי.
1. גידול תאים בתרבית והדבקת תאים ב-EV-miRNA מצומד פלואורופור
- צלחת 200,000 עד 400,000 תאים בבארות משולשות בצלחת 6 בארות במדיום תרבית מתאים. סובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור תאים אחיד. דוגרים על התאים עד שהם מגיעים למפגש של 70%-80%, בערך 24-48 שעות.
- עבור כל באר להיות transfected, לדלל את מגיב transfection ב 100μL של מדיום ללא סרום בצינור microcentrifuge על פי הוראות היצרן.
הערה: יש לקבוע את הריכוז האופטימלי של שומנים עבור קו התא המעניין לפני הגדרה זו. - כדי שכל באר תהיה נגועה, יש לדלל את ה-EV-miRNA המצומד פלואורופור (2nM) ואת ה-cell-miRNA (2nM) בנפרד בצינור מיקרוצנטריפוגה ב-100 μL של מדיה נטולת סרום.
הערה: יש לחשב את הנפח הכולל עבור המספר הכולל של בארות נגועות. בפרוטוקול זה, הפלואורסצנטיות הוערכה ב -7 נקודות זמן; לכן, הנפח הכולל היה 700 μL עבור שלב 1.2 ו 700 μL עבור שלב 1.3. בנוסף, כדי ללכוד בביטחון את אוכלוסיית התאים הפלואורסצנטית החיובית, המשתמש צריך להדביק תאים עם miRNA מעורבב שאינו פלואורסצנטי ולהקים שער שאינו כולל תאים אלה. - מוסיפים את תערובת הרנ"א המדולל (משלב 1.3) למגיב הטרנספקציה המדולל (משלב 1.2) ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 3-4 פעמים. תנו לתערובת השומנים-רנ"א המשולבת לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר את מצע התרבית הרגיל מהתאים והוסף 800 μL של מדיה ללא סרום לכל באר. הוסיפו בעדינות 200 μL של תערובת השומנים-רנ"א (משלב 1.4) טיפתית לתאים.
הערה: מדיית Opti-MEM שימשה להעברת קו העניין של התא (תאי Calu6). נסו להוסיף את תערובת השומנים-רנ"א ישירות לתרבית, והימנעו מהוספת התערובת לדפנות הצלחת.
2. קצירת תאים נגועים בנקודות זמן שונות לניתוח פלואורסצנטיות
- לדגור על התאים הנגועים ב 37 ° C במשך 7 שעות.
הערה: כדי לאמת טרנספקציה עקבית של שני miRNA (EV-miRNA ו- cell-miRNA), תאים נאספים מבאר אחת 3 שעות לאחר הטרנספקציה כדי לנתח את הפלואורסצנטיות באמצעות ציטומטר הזרימה. - לאחר תקופת הדגירה של 7 שעות, הסר את מתחם הטרנספקציה מהבארות והחלף אותו במדיה מלאה.
- כדי להעריך את נקודת הזמן של 7 שעות, קצרו את התאים ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS אחד.
- אם אתם עובדים עם תאים דבקים, הוסיפו 200 מיקרוליטר טריפסין לבאר אחת והמתינו עד שהתאים יתנתקו מהצלחת. מעבירים את התאים המנותקים לצינור מיקרוצנטריפוגה וגלולה באמצעות צנטריפוגה ב-200xg למשך 5 דקות.
- יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות כדי למנוע הפרעה לכדורית התא. לשטיפת PBS הראשונה, השהה מחדש את הגלולה ב~ 500 μL של 1x PBS וחזור על הגלולה באמצעות שלבי הצנטריפוגה לעיל. חזור על שטיפת PBS פעמיים נוספות.
- יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של תמיסת 2% פרפורמלדהיד (PFA) ולהעריך פלואורסצנטיות.
הערה: לאחר הוספת 2% PFA, ניתן לאחסן את גלולת התא בטמפרטורה של 4°C למשך 3-4 ימים.
- קצור את נקודות הזמן הנותרות בהתאם לשלבים בסעיף 2.3. אסוף את כל כדורי התא המאוחסנים והמשך בשלבים בסעיף 3.
3. ניתוח ציטומטריית זרימה של אות תא-miRNA ו-EV-miRNA בתאים
- הכינו תאים לניתוח ציטומטריית זרימה. סנן את תרחיף התא מחתך 2 עד מכסי מסננת של 35 מיקרומטר שהם חלק מצינוריות FACS פוליסטירן התחתונות העגולות כדי לאפשר הסרת פסולת וצברי תאים שעלולים להפריע לניתוח פלואורופור.
- הגדר את המכשיר בהתאם להוראות הכיול. הפעל את ציטומטר הזרימה ואפשר לו להתחמם לפחות 30 דקות לפני השימוש. הפעילו את מערכת הפלואידיקה בנוזל מעטפת, ובדקו וכווננו את יישור הלייזר.
- הפעל בקרת איכות כדי לאשר את הפלואידיקה של המכשיר. העמיסו מים מסוננים אולטרה-טהורים לתוך ציטומטר הזרימה ופעלו בקצב זרימה מתאים לזמן רכישה נאות.
הערה: קצב הזרימה וזמן הרכישה המתאימים תלויים בסוג התא של עניין, מורכבות הדגימה ואיכות הנתונים הרצויה. - פתח את תוכנת ניתוח נתוני ציטומטריית הזרימה ואשר את ביצועי הגלאי והלייזרים. הגדר פרמטרי סף ומתח לזיהוי בהתבסס על קו העניין של התא ופלואורופורים לפי בחירה.
הערה: עבור כל הניסויים במורד הזרם, נעשה שימוש בתאי Calu6.- הגדר את הסף ללכידת האות עבור תאי Calu6 ב- FSC 5000. בצע את הניתוח עבור 1 x 104 תאים עבור כל חזרה ניסיונית.
- כדי להסביר את החפיפה הספקטרלית בין פלואורופורים שונים, השתמש בתאים לא נגועים ובתאים שעברו טרנספקציה עצמאית רק עם אחד מהפלואורופורים כדי להגדיר בקרות פיצוי.
- לזיהוי ייצוא miRNA, השתמש ב- EV-miRNA מועמדים (miR-451a ו- miR-150) מצומדים ל- Alexa-fluor 488, וב- miRNA של תא ביקורת (cel-miR-67) מצומד ל- Cy3.
- עבור כל EV-miRNA, הצמידו את הפלואורופור לקצה 5′ של גדיל 5p. לפני הטרנספקציה, חישלו את הגדיל המצומד פלואורופור לגדיל 3p המשלים 100% שלו.
- לניתוח הביטוי בתאים נגועים, נתחו את הדגימות באמצעות תעלות FSC, SSC, FITC ו-PE המוגדרות ליחידות מתח 258, 192, 269 ו-423, בהתאמה (איור 1A, B).
- הכניסו את דגימת הבקרה השלילית לציטומטר הזרימה. לכוד אותות תא לאחר הגדרת עוצמות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צידי (SSC) בגליון עבודה מותאם אישית.
- בחלקה, בחרו FSC עבור ציר X, SSC עבור ציר Y, ושער עבור האוכלוסייה המעניינת על ידי ציור מצולע סביבו (ראו איור 1B, לוח תחתון).
- צור חלקה חדשה באמצעות האוכלוסייה המגודרת.
- הגדר את ציר X לאות פלואורסצנטי 1 (FS1) לזיהוי miRNA תאי ואת ציר Y לאות פלואורסצנטי 2 (FS2) לזיהוי EV-miRNA. הגדר פרמטרים של פיצוי עבור פלואורופורים בודדים באמצעות תאים הנגועים באופן עצמאי עם כל אחד miRNA מתויג פלואורסצנטית. במגרש החדש, שער על האוכלוסייה המעניינת.
- לזיהוי EV-miRNA, השתמש בערוץ FITC. להערכת אות miRNA תאי, השתמש בערוץ PE. בתוכנה, צור שער סביב התאים שהיו חיוביים הן עבור FITC והן עבור PE על ידי ציור מצולע סביב אוכלוסיית הפלואורסצנטיות הכפולה כאשר FITC נבחר עבור ציר X ו- PE נבחר עבור ציר Y.
- רשום את הנתונים הסטטיסטיים עבור האוכלוסייה המגודרת.
- רשום את אחוז התאים באוכלוסייה המגודרת שהם חיוביים הן עבור FITC והן עבור PE, כמו גם עבור אלה החיוביים עבור FITC או PE.
- חזור על השלבים לעיל עבור דגימות או פקדים נוספים בניסוי.
4. בידוד כלי רכב חשמליים מתאים נגועים
- עבור תאים שגודלו בתרבית במדיה המכילה בסרום, רוקנו את כלי הרכב החשמליים מהסרום כדי למנוע זיהום צולב.
- כדי ליצור סרום מדולדל EV, לדלל את הסרום ל -50% במדיה של תרבית תאים כדי להפחית צמיגות וצנטריפוגה את הסרום 50% שנוצר ב 110,000 x גרם במשך 18 שעות.
- אספו בזהירות את הסופרנאטנט (סרום נטול EV) וסננו אותו באמצעות מכלול מסנן של 0.2 מיקרומטר. השתמש בסרום 50% ללא EV שנוצר כדי ליצור מדיה מלאה, במקרה זה, RPMI בתוספת 10% סרום.
- כדי לאסוף כלי רכב חשמליים, הוסיפו את המדיה המלאה שהתרוקנה מהרכב החשמלי לתאים ואספו את כלי הרכב החשמליים 48 שעות לאחר הדגירה.
הערה: הפרוטוקול המתואר להלן שונה מ-Kowal et al.14.
- לגדל תאים בצלחות תרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ עד למפגש של 80%. הדבק את התאים בנפרד עם cell-miRNA ו- EV-miRNA ב- 10 מ"ל של Opti-MEM בהתאם לפרוטוקול הטרנספקציה בסעיף 1 של הפרוטוקול.
הערה: לא כל פרוטוקולי הטרנספקציה מתרחבים באופן ליניארי. זה עשוי להיות חיוני כדי להסתגל תחילה ולהעריך את תנאי transfection בלוחות 15 ס"מ. - לאחר 7 שעות, שאפו את מדיית הטרנספקציה והחליפו אותה במדיה מדולדלת EV (15 מ"ל). לגדל תאים במדיה מדולדלת EV במשך 48 שעות.
- הסר את המדיה המותנית מהתאים ושחרר אותה לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. צנטריפוגה את המדיה הממוזגת ב 2000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים מתים ופסולת תאים. מעבירים את הסופרנאטנט שנוצר לצינור טרי.
- צנטריפוגה את supernatant ב 10,000 x גרם במשך 40 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולסנן אותו באמצעות מכלול מסנן 0.2 מיקרומטר.
- העבירו את מדיית תרבית התאים המסוננת לצינור אולטרה-צנטריפוגה סטרילי בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. שוקלים ומאזנים את הצינורות זה כנגד זה. סובב את הדגימות ב 110,000 x גרם במשך 90 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
- השהה מחדש את הגלולה בנפח מתאים של 1x PBS לשטיפה וצנטריפוגה ב 110,000 x גרם למשך 90 דקות 4 ° C.
הערה: גלולת ה-EV הושעתה מחדש ב-60 מ"ל של PBS 1x בהתבסס על הנפח המרבי המותר לצינורות הרוטור בעלי הזווית הקבועה ששימשו במחקר זה. - שאפו PBS והשהו את כדורית ה-EV בנפח מתאים (50-100 μL) של 1x PBS ומערבולת טריים. אחסנו כלי רכב חשמליים בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
5. ניתוח ציטומטריית זרימה של אותות תא-miRNA ו-EV-miRNA בכלי רכב חשמליים
- כדי להכין את מתלי הרכב החשמלי לניתוח ציטומטריית זרימה, דללו את כלי הרכב החשמליים בנפח מתאים של PBS 1x אולטרה-מסונן.
הערה: נפח הטעינה של ניתוח ציטומטריית זרימה של כלי רכב חשמליים צריך להיקבע בהתבסס על מספר כלי הרכב החשמליים בדגימות. באופן כללי, אם יש ~ 30,000 חלקיקים במתלה EV, הנפח הסופי צריך להיות ~ 500-600 μL ב 1x PBS. בדגימה נקייה יש כ-35-50 חלקיקים/μL. - השתמש בציטומטר זרימת ננו או בציוד חלופי חזק מספיק כדי לנתח חלקיקים בגודל ננומטרי.
הערה: כאן, נעשה שימוש בציטומטר ננו-זרימה Attune NxT. - פתח את התוכנה והגדר את המכשיר בהתאם להוראות הכיול המומלצות. בצע את בדיקת הביצועים באמצעות ננו-חרוזי ביצועים. אם ננו-חרוזים מזוהים בטווח הגדלים הסטנדרטי, הביצועים הם אופטימליים. לקבוע את קצב הזרימה המתאים לזיהוי חלקיקי EV.
- הפעל בקרת איכות באמצעות מים מסוננים טהורים במיוחד כדי לאשר את פלואידקת המכשירים ואת הביצועים של הגלאי והלייזרים.
- באמצעות חרוזי כיול המתאימים לניסוי, הגדר את ציטומטר הזרימה כך שיזהה במדויק חרוזים בגדלים שונים וימדוד אותות פלואורסצנטיים.
הערה: לצורך הגדרת ניתוח EV על ידי ציטומטריית זרימה, נעשה שימוש בחרוזי ApogeeMix. חרוזים אלה מכילים תערובת של חרוזי סיליקה שאינם פלואורסצנטיים וחרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים בגדלים שבין 80 ננומטר ל -1300 ננומטר.- הגדר את הפרמטרים להערכת הרגישות והרזולוציה של אוכלוסיות שונות בתמהיל החרוזים בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש בגאטינג המתאים כדי לפתור את אוכלוסיית החרוזים מרעש המכשיר.
- מערבלים את הדגימות ביסודיות כדי לפזר באופן שווה את כלי הרכב החשמליים לפני הטעינה לניתוח.
- פתח את תוכנת ניתוח הנתונים ציטומטריית זרימה והצג PBS אולטרה מסונן. הגדר את ה- gating עבור חלקיקי EV באמצעות PBS מסונן במיוחד תוך הבטחה שה- gating מתאים לגודל המתאים של חלקיקים בהתבסס על החרוזים בשלב 5.5.
- טען את דגימת הבקרה השלילית כדי לנתח כלי רכב חשמליים כשהם עוברים דרך ציטומטר הזרימה. לכוד אותות EV תוך כדי תכנון FSC על ציר X ו- SSC על ציר Y.
הערה: סף SSC ללכידת כלי רכב חשמליים נקבע על 300. נפח הרכישה נקבע על 95 μL מתוך סך של 145 μL נפח מצויר. קצב הזרימה נקבע על 12.5 מיקרוליטר/דקה. הניתוח בוצע עם 1 x 106 חלקיקי EV. אוכלוסיית כלי הרכב החשמליים היא הטרוגנית וכתוצאה מכך חלק מהפסולת תבודד יחד עם כלי רכב חשמליים. זיהוי חלקיקים כולל בתרשים FSC לעומת SSC מדגיש חלקיקים בטווח מגוון, אשר צפוי בעת שימוש בתכשירים EV גולמי. - צור חלקה חדשה באמצעות האוכלוסייה המגודרת.
- הפעם, בחרו אות פלואורסצנטי 1 (FS1) לזיהוי miRNA תאי בציר X ואות פלואורסצנטי 2 (FS2) לזיהוי EV-miRNA בציר Y.
- הגדר פרמטרים לפיצוי עבור הפלואורופורים באמצעות דגימות EV שבודדו מתאים נגועים ב- miRNA יחיד. במגרש החדש, שער על אוכלוסיית הרכב החשמלי המעניינת.
- לניתוח הביטוי של miRNA מצומד פלואורופור בכלי רכב חשמליים שבודדו מהתאים הנגועים, נתחו את דגימות הרכב החשמלי באמצעות תעלות FSC, SSC, BL1 ו-YL1 שהוגדרו ליחידות מתח של 370, 370, 400 ו-400, בהתאמה (איור 2A, B).
- רשום את הנתונים הסטטיסטיים עבור האוכלוסייה המגודרת והצג אותם באופן חזותי באמצעות היסטוגרמות וחלקות נקודות.
- חזור על השלבים לעיל עבור דגימות או פקדים נוספים בניסוי.
6. אימות שחרור miRNA ברכב חשמלי באמצעות qRT-PCR
- חלצו RNA מכלי רכב חשמליים ומתאי אב באמצעות ערכת בידוד הרנ"א miRVana בהתאם להוראות היצרן.
הערה: כימות של רנ"א מבודד מכלי רכב חשמליים אינו אפשרי מכיוון שהכמות הכוללת של רנ"א המבודד מכלי רכב חשמליים אינה חוצה בדרך כלל את סף הכמות המינימלי של ננו-טיפה סטנדרטית. זאת בשל דלדול RNA ריבוזומלי מדגימות EV, אשר ניתן לאמת באמצעות Agilent Bioanalyzer. לפיכך, ציון התקינות לכימות EV-RNA בדרך כלל אינו אמין ואינו הייצוג האמיתי של כמות EV-RNA. לכן, לכימות qRT-PCR של EV-RNA ו-Cell-RNA, נעשה שימוש בנפחים שווים של RNA מבודד לאחר בידוד ממספר שווה של תאים. לצורך נורמליזציה של qRT-PCR, נעשה שימוש ב- miRNA הנמצאים בכל מקום על פני דגימות מרובות כפי שנקבע מנתוני ריצוף RNA שנרכשו בעבר. - המר את הרנ"א המופק ל-cDNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור הספציפית לרנ"א קטן.
- הגדר את תגובת qRT-PCR באמצעות תבנית cDNA ופריימרים ספציפיים ל- miRNA בהתאם להוראות היצרן.
הערה: עבור ניסויי אימות, ערכת miRCURY LNA qRT PCR ופריימרים תואמים מהיצרן שימשו להערכת הביטוי של cell-miRNA ו- EV-miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו משתמשים בציטומטריית זרימה ככלי רב עוצמה לחקר שחרור miRNA מהתאים לרכבים חשמליים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים הנגועים ב-cell-miRNA וב-EV-miRNA גילה ירידה רציפה של אות פלואורסצנטי המתאים ל-EV-miRNA, בעוד שהאות המתאים ל-miRNA התא נשמר בתאים. כדי להבטיח שהצמידות של הפלואורופורים לא תפריע לשחרור miRNA לרכבים חשמליים, miR-451a הוצמד לשני פלואורופורים נפרדים (כלומר, Alexa fluor 488 ו-Alexa fluor 750), ושימור התאים הוערך. התוצאות מצביעות על שונות מינימלית בין זיהוי אותות פלואורופור נפרדים לאחר טרנספקציה, מה שמאמת את אמינות הגישה הזו (איור 3A,B).
מכיוון שסיבות שונות יכולות להסביר את אובדן miR-451a המתויג באופן פלואורסצנטי מהתאים, כולל פירוק RNA, היה קריטי לוודא שאובדן התאים חופף לשפע EV. באמצעות ציטומטריית זרימה, נצפתה הצטברות של miR-451a מצומדת ל-Alexa fluor-488 בכלי רכב חשמליים באופן תלוי זמן, מה שסיפק עדות לאריזה יעילה ובסופו של דבר לשחרור של miRNA לרכבים חשמליים. לעומת זאת, האות הפלואורסצנטי המתאים לתא שמר על miRNA, cel-miR-67 לא זוהה ברכבים חשמליים (איור 4). ממצאים אלה באמצעות גישה חדשה זו אומתו באמצעות qRT-PCR, אשר חשף יחס ביטוי גבוה משמעותית של EV/cell עבור miR-150, EV-miRNA נוסף, בהשוואה ל-cell-miRNA, cel-miR-67 (איור 5).
איור 1: הגדרת פרמטרים של ציטומטר זרימה לזיהוי אותות בתאים. (A) לצורך ניתוח פלואורסצנטיות התא, באמצעות התוכנה, הוגדרו המתחים המודגשים עבור הפרמטרים שצוינו. המכשיר הוקם כדי להקליט 10,000 תאים לדגימה. תצוגת המפקח מאשרת את הפרמטרים שהוגדרו לזיהוי ולניתוח. (B) לצורך ניתוח פלואורסצנטיות של תאים, הסף עבור הפרמטר FSC נקבע על 5,000 תחת כרטיסיית הגדרות הציטומטר של התוכנה. החלונית הימנית העליונה מציגה את הגדרות הלייזר עבור לכידת הנתונים. החלוניות התחתונות מציגות גליון עבודה כללי פעיל במהלך התקדמות זיהוי התאים. הדגימות הופעלו בזרימה בינונית ונלכדו תוך קביעת FSC-A ו-SSC-A כפרמטרים של ציר x וציר y, בהתאמה. הגאטינג נקבע באמצעות כלי מצולע ציור סביב האוכלוסייה המעניינת. ה-gating עשוי להיות שונה עבור קו עניין אחר של תאים, בהתאם למגוון אוכלוסיית התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת פרמטרים של ציטומטריית זרימה לזיהוי אותות בכלי רכב חשמליים. (A) עבור זיהוי וניתוח במורד הזרם של כלי רכב חשמליים, נפח הרכישה נקבע על 95 μL כאשר מהירות הזרימה נקבעה על 12.5 μL/min. הסף שנבחר לזיהוי רכב חשמלי היה 0.3x1000 תחת כרטיסיית הגדרות המכשיר של התוכנה בהתבסס על חרוזי הכיול שבהם נעשה שימוש. המתחים עבור FSC, SSC, BL1 ו-YL1 היו 370, 370, 400 ו-400, בהתאמה. (B) הגדרת gating ללכידת אוכלוסיית כלי רכב חשמליים הטרוגניים והבחנה בין כלי רכב חשמליים לרעשי הרקע של המכשיר. דגימת PBS ריקה (למעלה) שימשה כבקרה שלילית לפתרון רעשי רקע מאוכלוסיית הרכב החשמלי. מדגם EV (למטה) מראה כי האוכלוסייה המעניינת היא רק 1.8% מכלל האוכלוסייה מכיוון שהמדגם הטרוגני עם חלקיקים חופפים בטווח הגודל. עם זאת, ההקפדה המחמירה נבחרה כדי להבטיח את איתור אוכלוסיית הרכב החשמלי המעוניינת בכך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי אותות בתאים באמצעות ציטומטריית זרימה. (A) פלואורסצנטיות המתאימה ל-EV-miRNA ול-cell-miRNA זוהתה בתאים בזמנים שצוינו בין 7 שעות ל-72 שעות לאחר ההדבקה. האות המתאים ל-EV-miR-451a (Alexa fluor-488) פחת עם הזמן בהשוואה לאות מ-miRNA השמור בתא, cel-miR-67. (B) פלואורסצנטיות המתאימה ל-EV-miR-451a המסומנת ב-Alexa fluor-750 הראתה את אותה מגמה כמו Alexa Fluro-488 המסומנת ב-miR-451a, מה שמצביע על כך שהפלואורופור אינו משפיע על שימור miRNA על ידי התאים. בסך הכל, התוצאות המייצגות מצביעות על כך שה-miRNA הנגוע מתנהג באופן דומה ל-miRNA האנדוגני בהתבסס על ייצוא ה-miRNA לרכבים חשמליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי אותות בכלי רכב חשמליים באמצעות ציטומטריית זרימה. פלואורסצנטיות המתאימה ל-EV-miR-451a ול-cell-miR-67 זוהתה בכלי רכב חשמליים 24 שעות ו-48 שעות לאחר ההעברה. האות המתאים ל-EV-miR-451a (Alexa fluor-488) נלכד בכלי רכב חשמליים 48 שעות לאחר ההעברה. לעומת זאת, האות עבור cel-miR-67 לא זוהה ברכבים חשמליים. דגימת PBS ריקה שימשה כדי להגדיר את ה-gating עבור הניסוי הזה, כפי שמוצג באיור 2B. דגימות EV שבודדו מתאים שהודבקו ב-RNA מקושקש שאינו פלואורסצנטי שימשו כביקורת שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: כימות של EV-miRNA ו-cell-miRNA בתאים ובכלי רכב חשמליים באמצעות qRT-PCR. תאי Calu6 הודבקו ב-2 ננומטר של miR-150 ו-cel-miR-67 כל אחד. כלי רכב חשמליים נאספו 48 שעות לאחר ההדבקה. העשרת EV חושבה כיחס של ביטוי EV חלקי ביטוי תאי בתאי Calu6 שעברו טרנספקט עבור miR-150 ו-cel-miR-67. בהתבסס על תוצאות ריצוף RNA שהשוו את הביטוי של miRNA בתאי Calu6 לבין כלי הרכב החשמליים המתאימים להם, miR-30c שימש כבקרה אנדוגנית וכמנרמל לחישוב שינוי קיפול. הנתונים המוצגים הם מהעתק ביולוגי אחד, כאשר כל נקודת נתונים מציגה תגובות qRT-PCR משולשות. הנתונים מבוטאים כממוצע ±-SD, וערכי p חושבו באמצעות מבחן t לא מזווג עם התיקון של וולש (**p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| החוזק | חולשות |
| מאפשר הערכה סימולטנית של ייצוא סלקטיבי של miRNA מרובים בתאים ובכלי רכב חשמליים בהתאמה | לדרוש נהלים נוספים כדי להבחין בין תופעת יצוא אקטיבית ופסיבית |
| הערכה של אוכלוסייה הטרוגנית גולמית אפשרית ואינה דורשת הפרדה מוקדמת של אוכלוסיות כלי רכב חשמליים. ניתן להשתמש בו כדי לנתח סוגים שונים של כלי רכב חשמליים הערה: הסף לזיהוי סוגים שונים של חלקיקים ישתנה |
רגישות נמוכה אינה מאפשרת איתור ריכוזים מוגבלים של miRNA בתאים או ברכבים חשמליים. ניתן להתגבר על כך על ידי שילוב ניתוח qRT-PCR במורד הזרם בעקבות בידוד RNA מכלי רכב חשמליים |
| דורש פרק זמן קצר להגדרה וניתוח בהשוואה לשיטות סטנדרטיות המשמשות לכימות miRNA | היעדר פרוטוקולי תקינה לסוגים שונים של ציוד, קווי תאים ופלואורופורים שונים. |
טבלה 1: נקודות החוזק והחולשה העיקריות של הפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול החדש שהוקם מאפשר לכידת קינטיקה של שחרור miRNA לרכבים חשמליים לאחר טרנספקציה של EV-miRNAs. הגישה מאפשרת ניתוח סימולטני של מספר רב של EV-miRNA ו-cell-miRNAs, בכפוף ליכולות הציטומטר. יתר על כן, בעוד ניתוח ציטומטריית זרימה יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה miRNA EV, זה לא בלי מגבלות. אם כי ניתן להתגבר על חלק מהמגבלות כאשר משתמשים בהן בשילוב עם טכניקות אחרות להבנה מקיפה יותר.
תחום מתפתח של עניין בביולוגיה של כלי רכב חשמליים הוא הבנת הייצוא הסלקטיבי של miRNA לרכבים חשמליים15,16. בעוד פרוטוקול זה מציע כלי רב עוצמה המאפשר לחקור ייצוא סלקטיבי של miRNA, אחד האתגרים הקריטיים הוא להבחין בין יצוא אקטיבי ופסיבי. יש לנקוט משנה זהירות מכיוון שביטוי יתר של miRNA בריכוז גבוה מספיק עלול לשנות את יצוא ה-miRNA, מה שעלול לגרום להעמסה פסיבית בלתי הולמת. לכן, ניסויים כדי לקבוע את ריכוזי transfection אופטימליים של miRNA הוא חיוני בעת חקר ייצוא סלקטיבי.
יתר על כן, הפרוטוקול, בשילוב עם טכניקות משלימות כגון ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA), מאפשר לחוקר להעריך את ספירת חלקיקי הרכב החשמלי תוך הערכת שחרור ה-miRNA ויש לו פוטנציאל לאפשר הבחנה בין שינויים במסלולי ביוגנזה של EV לבין מנגנוני ייצוא miRNA. זה חשוב במיוחד בשל המתווכים החופפים של תהליכים אלה17. בהתחשב בכך ש-miRNA יכול להשפיע על פנוטיפים שונים, כולל כאלה המעורבים בביוגנזה של EV, יהיה זה נבון להעריך את ספירת החלקיקים לאחר טרנספקציה של miRNA18. כדי להתגבר על משוכה זו, אפשרות נוספת היא לשלב EV-miRNA שנותר ללא שינוי בתנאי הניסוי, ובכך לשלול גורמים המעורבים בביוגנזה של EV תוך הדגשת המסלולים המעורבים בייצוא EV-miRNA.
מספר מחקרים כימתו miRNA באמצעות qRT-PCR, שיטה סטנדרטית לכימות miRNA אנדוגני 10,11,16. עם זאת, חסרה לו היכולת ללכוד באופן דינמי שחרור של miRNA לרכבים חשמליים. כאשר משווים ציטומטריית זרימה ל- qRT-PCR, הם נבדלים מאוד בהתבסס על רגישות הבדיקה והעיצוב. בעוד qRT-PCR היא טכניקה רגישה ביותר ומסוגלת תיאורטית לכמת ספירת העתקי miRNA מינימלית, הבחנה בין שתי דגימות דורשת הבדל של לפחות פי 2 (100%) במספר העותקים של miRNA המעניינים. ציטומטריית זרימה, לעומת זאת, לוכדת הבדלים מבוססי אותות בהתבסס על שפע של miRNA המסומן באופן פלואורסצנטי ויכולה להבדיל בין שינויים באחוזים קטנים באותות. עם זאת, רגישותו הנמוכה מגבילה את הזיהוי של miRNA עם מספרי העתקה מוגבלים. שתי הטכניקות משלימות זו את זו באופן סינרגטי כאשר משתמשים בהן יחד, כפי שמצוין בפרוטוקול.
לסיכום, פרוטוקול זה מציע כלי רב ערך לחקר דינמיקת ייצוא miRNA סלקטיבית. למרות האתגרים שהוזכרו לעיל, כוחו של פרוטוקול זה טמון ביכולתו לנתח מספר miRNA בו זמנית, מה שתורם להבנה טובה יותר של ביולוגיית miRNA, הייצוא שלהם ותפקידם בביולוגיה של EV. נקודות החוזק והחולשה העיקריות של הפרוטוקול שיש לקחת בחשבון מפורטות בטבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים בתמיכה ובייעוץ מד"ר ג'יל האצ'קרופט, מנהלת מתקן הליבה של Flow Cytometry באוניברסיטת Purdue. עבודה זו נתמכה על ידי R01CA226259 ו- R01CA205420 ל- A.L.K., פרס חדשנות של איגוד הריאות האמריקאי (ANALA2023) IA-1059916 ל- A.L.K., מענק מתקן משאבים משותפים של Purdue P30CA023168, ומלגת דגל פולברייט לדוקטורט שהוענקה על ידי מחלקת המדינה, ארה"ב ל- H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
