Summary
O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.
Abstract
O sequenciamento do multioma, que fornece RNA de célula única- mesma célula/pareado e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequenciamento), representa um avanço em nossa capacidade de discernir a heterogeneidade de células tumorais - um foco primário da pesquisa translacional do câncer neste momento. No entanto, a qualidade dos dados de sequenciamento adquiridos com essa modalidade avançada é altamente dependente da qualidade do material de entrada.
As condições de digestão precisam ser otimizadas para maximizar o rendimento celular sem sacrificar a qualidade. Isso é particularmente desafiador no contexto de tumores sólidos com matrizes desmoplásicas densas que devem ser suavemente quebradas para liberação celular. Células recém-isoladas de tecido tumoral sólido são mais frágeis do que aquelas isoladas de linhagens celulares. Além disso, como os tipos celulares isolados são heterogêneos, condições devem ser selecionadas para suportar a população celular total.
Finalmente, as condições de isolamento nuclear devem ser otimizadas com base nessas qualidades em termos de tempos de lise e tipos/proporções de reagentes. Neste artigo, descrevemos nossa experiência com isolamento nuclear para a plataforma de sequenciamento multioma 10x Genomics a partir de espécimes tumorais sólidos. Fornecemos recomendações para digestão de tecidos, armazenamento de suspensões unicelulares (se desejado) e isolamento e avaliação nuclear.
Introduction
À medida que nosso conhecimento da biologia tumoral cresce, a importância de analisar células heterogêneas em todo o microambiente tumoral também temaumentado1,2. A capacidade de adquirir RNA de célula única e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequencing) da mesma célula de forma pareada (sequenciamento multioma) proporcionam um avanço significativo nesse sentido 3,4. No entanto, esses experimentos são caros e demorados, e a qualidade e o impacto dos dados adquiridos são altamente dependentes da qualidade das condições experimentais e dos materiais. Protocolos padronizados para isolamento de núcleos têm sido publicados 5,6. Tecidos frescos e heterogêneos requerem otimização de protocolo, uma vez que células recém-isoladas de espécimes tumorais sólidos são mais frágeis do que aquelas isoladas de linhagens celulares.
Outra consideração é que, para tumores sólidos, as peças cirúrgicas muitas vezes não estão disponíveis na sala de cirurgia até o final do dia. Como tal, geralmente não é viável proceder diretamente da aquisição da amostra para a captura dos núcleos sem uma etapa de criopreservação. Em nossa experiência, o congelamento de uma suspensão de célula única produz núcleos da mais alta qualidade (em vez de tecido inteiro congelado ou outras modalidades de preservação). Isso é particularmente verdadeiro para tipos de tecidos enzimáticos com alto teor de RNase, como o pâncreas.
As condições de digestão dos tecidos também precisam ser projetadas para maximizar o rendimento celular sem sacrificar a qualidade7. No contexto de tumores sólidos com matrizes desmoplásicasdensas8, a matriz extracelular deve ser suavemente quebrada para liberação celular. Além disso, como os tipos celulares isolados são heterogêneos, as condições devem ser ajustadas para suportar a população celular total. Amostras de câncer de pâncreas humano (adenocarcinoma ductal pancreático) são utilizadas no protocolo descrito. O câncer de pâncreas representa um tipo de tumor altamente desmoplásico, que prenuncia tecidos e células relativamente pegajosos. Além disso, como os espécimes de tumores pancreáticos disponíveis para pesquisa também tendem a ser relativamente pequenos, esforços são feitos para maximizar a quantidade de células capturadas.
O isolamento de núcleos requer a maior otimização em termos de condições e tempo de lise celular, bem como tipos e proporções de reagentes. O manuseio dos núcleos ao longo do isolamento também requer muito cuidado. Neste artigo, descrevemos nossa experiência otimizando o isolamento nuclear para a plataforma de sequenciamento multioma 10x Genomics a partir de tecido tumoral sólido (Figura 1). Fornecemos recomendações para digestão de tecidos, criopreservação de suspensões unicelulares (se desejado) e isolamento nuclear.
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Protocol
Amostras de câncer de pâncreas humano (adenocarcinoma ductal pancreático) foram adquiridas de acordo com um protocolo aprovado pelo IRB em nosso laboratório. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para coleta de tecidos. O tecido foi transportado da sala cirúrgica para o laboratório e, em seguida, processado da seguinte forma.
1. Dissociação tecidual (digestão)
- Prepare o Buffer de Digest (consulte a Tabela de Materiais).
- Obter o tecido de interesse o mais rápido possível após a excisão do tumor e transportar o espécime em tampão de têmpera (DMEM F-12 com ~5% de soro fetal bovino) ou 1x PBS em gelo.
- Pique o tecido com pinça e tesoura limpas em 3-5 mL de tampão digestivo em uma placa de Petri de 90 mm (Figura 2A).
- Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 50 mL e dissociar em ~10 mL de tampão digesto por 30 min a 37 °C usando um banho-maria com função de agitação ou um agitador seco.
- Retire do agitador e tempere com ~20 mL de meio de têmpera. Filtrar a solução através de um filtro de células de 100 μm para um tubo cónico limpo.
- Recolher qualquer tecido sólido remanescente do filtro (repicar os pedaços de tecido restantes, se necessário) e colocar em ~10 ml de tampão Digest fresco durante mais 30 minutos a 37 °C com agitação. Repita até que todo o tecido tumoral tenha sido dissociado.
- Alíquotas de suspensão de células de piscina e filtre através de um filtro de células de 70 μm seguido por um filtro de células de 40 μm em um tubo cônico limpo sobre gelo.
- Centrifugar para células de pellet a 500 × g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, decantar o sobrenadante.
2. Criopreservação
- Enxaguar as células ressuspendendo o pellet em 1 mL de PBS 1x.
- Transfira a suspensão celular (~1-10 milhões de células/tubo para congelamento ideal) para um criovial de 1,5 mL sobre gelo.
- Centrifugar para células de pellet a 500 × g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, decantar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 1 mL de solução de Bambanker, transferir para um criovial de 1,5 ou 2 mL (Figura 2B) e congelar usando um recipiente de congelação com taxa de resfriamento de -1 °C/min (contendo álcool isopropílico a 100%) a -80 °C, ou transferir para nitrogênio líquido se o armazenamento a longo prazo da amostra for previsto.
3. Isolamento de núcleos
- Descongele rapidamente o criovial da suspensão celular e coloque-o sobre gelo molhado.
- Transfira a suspensão celular descongelada para um tubo de microcentrífuga de 2 ml e complete o frasco para injetáveis para 2 ml de solução com 1x PBS para enxaguar as células.
- Obter uma contagem manual de células usando um hemocitômetro para avaliar tanto a quantidade quanto a qualidade das células (Figura 2C).
- Centrifugar para células de pellet a 500 × g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, decantar suavemente o sobrenadante utilizando pontas de pipeta progressivamente mais pequenas para deixar para trás um pellet seco e mantê-lo no gelo.
- Use um rotor de caçamba oscilante para todas as etapas de centrifugação. Para obter o máximo rendimento celular, coloque os tubos na centrífuga com a dobradiça voltada para fora e, em seguida, decante com a ponta da pipeta direcionada para o lado oposto do tubo (Figura 2D).
NOTA: Para decantar o sobrenadante, use pontas de pipeta progressivamente menores para remover o fluido para limitar a ruptura do pellet enquanto maximiza o volume de fluido decantado. Esta estratégia é particularmente útil mais tarde no protocolo após a extração dos núcleos, uma vez que a pelota dos núcleos geralmente não é visível.
- Use um rotor de caçamba oscilante para todas as etapas de centrifugação. Para obter o máximo rendimento celular, coloque os tubos na centrífuga com a dobradiça voltada para fora e, em seguida, decante com a ponta da pipeta direcionada para o lado oposto do tubo (Figura 2D).
- Prepare 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer e Wash Buffer (Figura 3A) de acordo com o protocolo publicado com as seguintes modificações (ver Tabela 1, Tabela de Materiais):
NOTA: Coloque o Digitonin num bloco de aquecimento a 65 °C antes de utilizar para dissolver o precipitado (figura 3B). Isso normalmente leva cerca de 10 minutos. - Prepare o tampão de lise celular de 0,1x combinando 100 μL de 1x tampão de lise celular e 900 μL de tampão de diluição de lise celular, pipetar suavemente para misturar e colocá-lo no gelo.
- Ressuspenda o pellet de células em 100 μL de tampão de lise celular 0,1x resfriado e pipete suavemente para misturar 5x.
- Incubar no gelo por 3 min (Figura 3C).
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem resfriado e pipete para cima e para baixo para misturar suavemente 5x.
- Centrifugar para pellet os núcleos a 500 × g durante 5 min a 4 °C, decantar suavemente o sobrenadante para um pellet seco e manter no gelo.
NOTA: Se o número inicial de células for baixo (100.000-200.000 células), execute as etapas de lise e lavagem celular em um tubo de PCR de 200 μL em vez de um tubo de microcentrífuga de 2 mL para diminuir a área de superfície do tubo e minimizar as perdas. Nesse caso, ajuste o volume do Buffer de lavagem para baixo para acomodar o volume menor do tubo. - Repita as etapas 3.9-3.10 2x para um total de três lavagens.
- Conte manualmente os núcleos usando uma lâmina de hemocitômetro sob o microscópio. Use corante azul de tripano se desejado para fornecer contraste para visualizar os núcleos e para ajudar a discernir núcleos de células não lisadas.
- Prepare o 1x Nuclei Buffer de acordo com o protocolo publicado: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM TDT, 1 U/μL RNase Inhibitor em água nuclease-free e mantenha no gelo (ver Tabela de Materiais).
- Ressuspenda a pelota de núcleos em 1x Nuclei Buffer com base na recuperação de núcleos alvo de meta.
NOTA: Se a concentração for suficientemente elevada, procure uma recuperação visada de 10.000 ou ligeiramente superior nesta etapa (3.230-8.060 núcleos/μL) ao determinar o volume de ressuspensão inicial, dada a perda de volume prevista de 25 μL e a diminuição de 20% da concentração com filtragem (Passo 3.15). - Passe suavemente o volume dos núcleos ressuspensos através de um filtro de células de ponta de pipeta de 40 μm e coloque os núcleos no gelo (Figura 3D).
- Reconte os núcleos (Figura 4A-C). Diluir ainda mais a solução final com Nuclei Buffer, se necessário.
- Transportar os núcleos no gelo e proceder imediatamente à captura dos núcleos de acordo com os protocolos publicados.
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Representative Results
Para isolar núcleos de alta qualidade de espécimes tumorais sólidos de pacientes para sequenciamento do multioma (Figura 1), o tecido tumoral foi dissociado e uma suspensão unicelular foi criopreservada (Figura 2A-D). A suspensão celular foi então descongelada no momento da captura planejada do mulômeno. A captura dos núcleos foi realizada com reagentes de tampão de lise otimizados e temporização para maximizar a qualidade e o rendimento (Figura 3A-D). Imagens representativas dos núcleos mostram tamanho e forma adequados (Figura 4A-C). Os núcleos circundados em cinza pálido mostram pontilhados leves do envelope.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho de isolamento de núcleos. Esquema mostrando o fluxo de trabalho básico de um espécime de tecido tumoral inteiro para uma suspensão de núcleo único pronta para submissão para captura de núcleos, preparação de biblioteca de multioma e, finalmente, sequenciamento de scRNA e ATAC. Abreviações: scRNA = RNA de célula única; ATAC-seq = ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapas de digestão tecidual, criopreservação, avaliação celular e centrifugação. (A) Configuração do equipamento para picagem de amostras de tecido tumoral; (B) criopreservação da suspensão celular; (C) avaliação microscópica da suspensão celular; (D) abordagem da centrifugação para este protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Preparação dos reagentes, extração dos núcleos e filtragem. (A) Preparação de reagentes de extração de núcleos; B) Dissolução da digitonina a 65 °C antes da utilização; (C) incubação de amostras para lise celular em gelo; (D) filtragem dos núcleos extraídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens microscópicas representativas de núcleos colhidos de espécimes complexos de tecido tumoral. (A-C) Imagens representativas de núcleos colhidos com e sem coloração com Azul de Tripano. (B,C) Os núcleos circundados em cinza pálido mostram pontilhados suaves do envelope nuclear. Objetivas de 10x e 40x utilizadas. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome da solução | Componentes | ||
| Buffer de resumo | 0,5-1 mg/mL de colagenase tipo IV | ||
| 100 U/mL DNase I | |||
| 0,1% Poloxamer 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% de soro fetal bovino (SFB) em meio 199 | |||
| 1X Buffer de lise celular | Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) | ||
| NaCl 10 mM | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA (em vez de 1%) | |||
| 0,10% Tween-20 | |||
| 0,1% Nonident P40 Substituto | |||
| 0,01% Digitonina | |||
| TDT de 1 mM | |||
| Inibidor de 1 U/μL de RNAse em água livre de nucleases | |||
| Tampão de diluição de lise celular | Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) | ||
| NaCl 10 mM | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| TDT de 1 mM | |||
| Inibidor de 1 U/μL de RNAse em água livre de nucleases | |||
| Tampão de lavagem | Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) | ||
| NaCl 10 mM | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0,10% Tween-20 | |||
| TDT de 1 mM | |||
| Inibidor de 1 U/μL de RNAse em água livre de nucleases | |||
Tabela 1: Soluções utilizadas neste protocolo.
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Discussion
Desembaraçar as populações celulares heterogêneas presentes no microambiente tumoral é uma área ativa de foco na biologia do câncer. Da mesma forma, existem tecidos complexos em patologias benignas, como cicatrização de feridas e fibrose. O sequenciamento multioma tem emergido como uma ferramenta poderosa que permite a aquisição de dados de scRNA- e ATAC-seq pareados. Este protocolo descreve o isolamento de núcleos, o que demanda otimização no processamento de espécimes tumorais frescos, frágeis e pequenos. Aqui nós fornecemos um protocolo para isolamento de núcleos de espécimes de tecido tumoral sólido desmoplásico. Encontramos essa abordagem para produzir dados confiáveis e de alta qualidade, mesmo quando as suspensões celulares são congeladas antes do isolamento e captura dos núcleos.
Aumentar a concentração de albumina ao longo do ensaio é útil para limitar a aglomeração de células e núcleos a jusante, o que pode ser um problema ao trabalhar com amostras tumorais. Em termos de digestão dos tecidos, os reagentes do kit de digestão também podem ser usados com este protocolo, se desejado (ver Tabela de Materiais). Se usado, ainda recomendamos seguir as trocas digest/quench e tampão a cada 30 min para maximizar o rendimento de células viáveis. Após a dissociação tecidual, a lise das hemácias pode ser realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Um protocolo de separação de células de gradiente também pode ser realizado a critério do pesquisador (ver Tabela de Materiais). Não realizamos esses protocolos rotineiramente, mas aplicamos tais protocolos em amostras semelhantes, sem diferenças notáveis nos resultados. Se forem observados pequenos detritos significativos após a filtragem dos núcleos, a Classificação de Núcleos Ativados por Fluorescência (FANS) pode ser considerada para purificação adicional. Uma discussão detalhada do FANS, incluindo recomendações de protocolo, está disponível, mas além do escopo deste protocolo. Vale ressaltar que existem protocolos na literatura que consideram uma etapa de fixação antes da lise celular. No entanto, preferimos prosseguir com tecidos e núcleos não fixos, pois scATAC-seq funciona melhor em tecido nãofixo9.
Para a lise celular, como o inibidor de RNase é bastante dispendioso, é razoável reduzir o volume preparado do tampão de lise celular (e do tampão de diluição de lise celular) em comparação com os volumes fornecidos no protocolo publicado, se desejado, desde que as proporções de reagentes permaneçam proporcionais. Na avaliação e contagem dos núcleos colhidos, um Kit de Viabilidade/Citotoxicidade LIVE/DEAD pode ser aplicado a critério do pesquisador. O corante azul de tripano também pode ser usado para fornecer contraste para visualizar os núcleos e para ajudar a discernir núcleos de células não lisadas, se necessário. Finalmente, vale ressaltar que aplicamos as mesmas condições de lise celular com reagentes ajustados por protocolo para ATAC-seq unicelular com excelentes resultados10.
As etapas críticas do protocolo são o momento preciso da lise e o manuseio suave, mas conveniente, dos núcleos. A submistura levará à lise celular incompleta ou inconsistente; no entanto, a mistura excessiva irá cisalhar a cromatina. Como observado em outros protocolos de isolamento de núcleos, a mistura de núcleos deve ser realizada por pipetagem e não por vórtice da amostra, pois as forças de cisalhamento podem danificar os núcleos frágeis11. A este respeito, é importante que o tampão de lise celular seja preparado fresco pouco antes de usar em cada ocasião. O esforço da célula da ponta da pipeta (filtragem) após a etapa final de centrifugação é fundamental em nossa experiência para evitar a aglomeração de núcleos antes da captura. Esta filtragem pode ser repetida antes do carregamento se os aglomerados ainda forem detectados na contagem final ou se desenvolverem durante o transporte da amostra antes do carregamento, tendo em mente a perda adicional de volume e concentração a cada etapa de filtragem adicionada. É importante ressaltar que não deve haver pausa significativa entre o isolamento e a captura dos núcleos.
As limitações desse protocolo são que a dissociação tecidual e, particularmente, o tempo e as condições de incubação da lise celular podem precisar ser otimizados para diferentes tipos de tumoressólidos12. Este protocolo tem sido otimizado para tumores sólidos desmoplásicos, como carcinoma de mama e adenocarcinoma pancreático, e também tem sido aplicado com sucesso em tecidos desmoplásicos não tumorais, como fibrose parenquimatosa, mas outros tipos de tumores podem exigir ajustes adicionais. Ele é otimizado tanto para suspensões de células frescas quanto para suspensões de células congeladas com excelente rendimento de núcleos de ambos. Recomendamos buscar essa otimização sequencialmente começando com a dissociação tecidual e, uma vez que uma suspensão ótima de célula única tenha sido alcançada, passando para a otimização das condições de lise celular para produzir uma suspensão ótima de núcleo único.
O sequenciamento ATAC de célula única e, mais recentemente, o sequenciamento de multioma apresentam uma tremenda ferramenta inovadora para desembaraçar a heterogeneidade celular de tumores sólidos. Os subtipos celulares podem ser delineados com base em suas características de acessibilidade da cromatina e expressão gênica, e a influência da acessibilidade e expressão dos fatores de transcrição no comportamento tumoral pode ser examinada diretamente. Esses avanços metodológicos estão sendo amplamente aplicados, dado seu enorme potencial para descobrir novos alvos terapêuticos. Sendo assim, o desenvolvimento de protocolos otimizados para a obtenção desses dados é de extrema importância. Aqui compartilhamos este protocolo de isolamento de núcleos no contexto do tecido do câncer de pâncreas - um tipo de câncer para o qual existem poucas terapias e todas com eficácia limitada até o momento.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), particularmente Dhananjay Wagh e John Coller, e à 10x Genomics por sua assistência na otimização de nossos experimentos. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser e Byrne Lee por sua assistência na aquisição de espécimes de pacientes. Gostaríamos de agradecer a Art e Elaine Taylor, a Fundação Rantz e Warren e Judy Kaplan por seu generoso apoio aos nossos esforços de pesquisa. As fontes de financiamento incluem subsídios do NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), o Gunn/Olivier Fund, o California Institute for Regenerative Medicine, a Stinehart/Reed Foundation e o Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. O sequenciamento foi obtido usando máquinas adquiridas com fundos do NIH (S10OD025212, S10OD018220 e 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
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