Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Resumo

A falta de modelos de câncer validados que recapitulem o microambiente tumoral de cânceres sólidos in vitro continua sendo um gargalo significativo para a pesquisa pré-clínica do câncer e o desenvolvimento terapêutico. Para superar esse problema, desenvolvemos o microtumor vascularizado (VMT), ou chip tumoral, um sistema microfisiológico que modela realisticamente o complexo microambiente tumoral humano. A VMT se forma de novo dentro de uma plataforma microfluídica por co-cultivo de vários tipos de células humanas sob condições dinâmicas e fisiológicas de fluxo. Esta construção microtumoral projetada por tecido incorpora uma rede vascular viva perfundida que suporta a massa tumoral em crescimento, assim como os vasos recém-formados fazem in vivo. É importante ressaltar que drogas e células imunes devem atravessar a camada endotelial para alcançar o tumor, modelando barreiras fisiológicas in vivo para liberação terapêutica e eficácia. Uma vez que a plataforma VMT é opticamente transparente, imagens de alta resolução de processos dinâmicos, como extravasamento de células imunes e metástases, podem ser obtidas com a visualização direta de células marcadas fluorescentemente dentro do tecido. Além disso, o VMT retém a heterogeneidade tumoral in vivo , assinaturas de expressão gênica e respostas a drogas. Praticamente qualquer tipo de tumor pode ser adaptado à plataforma, e as células primárias de tecidos cirúrgicos frescos crescem e respondem ao tratamento medicamentoso no VMT, abrindo caminho para uma medicina verdadeiramente personalizada. Aqui, os métodos para estabelecer o VMT e utilizá-lo para a pesquisa em oncologia são descritos. Essa abordagem inovadora abre novas possibilidades para o estudo de tumores e respostas a drogas, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa sobre o câncer.

Introdução

O câncer continua sendo um grande problema de saúde em todo o mundo e é a segunda causa de morte nos Estados Unidos. Somente para o ano de 2023, o Centro Nacional de Estatísticas de Saúde prevê mais de 1,9 milhão de novos casos de câncer e mais de 600.000 mortes por câncer ocorrendo nos EUA¹, destacando a necessidade urgente de abordagens de tratamento eficazes. No entanto, atualmente, apenas 5,1% das terapêuticas anticâncer que entram em ensaios clínicos finalmente obtêm a aprovação da FDA. O fracasso de candidatos promissores em progredir com sucesso através de ensaios clínicos pode ser parcialmente atribuído ao uso de sistemas modelos não fisiológicos, como culturas 2D e esferoides, durante o desenvolvimento pré-clínico de^{fármacos 2}. Esses modelos clássicos de câncer carecem de componentes essenciais do microambiente tumoral, como nicho estromal, células imunes associadas e vasculatura perfundida, que são determinantes-chave da resistência terapêutica e progressão da doença. Assim, um novo sistema modelo que mimetize melhor o microambiente tumoral humano in vivo é necessário para melhorar a tradução clínica dos achados pré-clínicos.

O campo da engenharia de tecidos está avançando rapidamente, fornecendo métodos aprimorados para o estudo de doenças humanas em ambientes de laboratório. Um desenvolvimento significativo é o surgimento de sistemas microfisiológicos (MPS), também conhecidos como chips de órgãos ou chips de tecido, que são órgãos humanos funcionais, miniaturizados, capazes de replicar condições saudáveis ou doentes ^3,4,5. Nesse contexto, chips tumorais, que são modelos tridimensionais de tumores humanos baseados em microfluídica in vitro, têm sido desenvolvidos para pesquisas em oncologia2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Esses modelos avançados incorporam pistas bioquímicas e biofísicas dentro de um microambiente tumoral dinâmico, permitindo que os pesquisadores estudem o comportamento tumoral e as respostas a tratamentos em um contexto fisiologicamente mais relevante. No entanto, apesar desses avanços, poucos grupos incorporaram com sucesso uma vasculatura viva e funcional, particularmente uma que se autopadroniza em resposta ao fluxo fisiológico 3,4,5,6. A inclusão de uma rede vascular funcional é crucial, pois permite modelar barreiras físicas que afetam a liberação de drogas ou células, homing celular para microambientes distintos e migração transendotelial de células tumorais, estromais e imunes. Ao incluir essa característica, o chip tumoral pode representar melhor as complexidades observadas no microambiente tumoral in vivo.

Para atender a essa necessidade não atendida, desenvolvemos uma nova plataforma de triagem de fármacos que permite a formação de redes de microvasos dentro de um dispositivo microfluídico 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Esta plataforma de chip de órgão base, denominada micro-órgão vascularizado (VMO), pode ser adaptada a praticamente qualquer sistema de órgãos para replicar a fisiologia tecidual original para modelagem de doenças, triagem de drogas e aplicações de medicina personalizada. Os VMOs são estabelecidos pela co-cultura de células endoteliais derivadas de células formadoras de colônias endoteliais (ECFC-EC), HUVEC ou iPSC-EC (doravante EC), e múltiplas células estromais na câmara, incluindo fibroblastos pulmonares humanos normais (NHLF), que remodelam a matriz, e pericitos que envolvem e estabilizam os vasos. O VMO também pode ser estabelecido como um sistema modelo de câncer pela co-cultura de células tumorais com o estroma associado para criar um modelo de microtumor vascularizado (VMT)8,9,10,11,12,13, ou chip tumoral. Através do co-cultivo de múltiplos tipos celulares em um ambiente de fluxo dinâmico, redes microvasculares perfundidas formam de novo nas câmaras teciduais do dispositivo, onde a vasculogênese é intimamente regulada por fluxos intersticiais^14,15. O meio é conduzido através dos canais microfluídicos do dispositivo por uma cabeça de pressão hidrostática que fornece nutrientes exclusivamente através dos microvasos às células vizinhas da câmara tecidual, com coeficiente de permeabilidade de 1,2 x ^10-7 cm/s, semelhante ao observado para capilares in^vivo8.

A incorporação de microvasos auto-organizadores ao modelo VMT representa um avanço significativo, pois: 1) mimetiza a estrutura e a função de massas tumorais vascularizadas in vivo; 2) pode modelar etapas-chave da metástase, incluindo interações tumor-endotélio e células estromais; 3) estabelece barreiras fisiologicamente seletivas para a liberação de nutrientes e medicamentos, melhorando a triagem farmacêutica; e 4) permite a avaliação direta de fármacos com capacidades antiangiogênica e antimetastática. Ao replicar a entrega in vivo de nutrientes, drogas e células imunes em um microambiente 3D complexo, a plataforma VMO/VMT é um modelo fisiologicamente relevante que pode ser usado para realizar o rastreamento de drogas e estudar o câncer, a biologia vascular ou órgão-específica. É importante ressaltar que a VMT suporta o crescimento de vários tipos de tumores, incluindo câncer de cólon, melanoma, câncer de mama, glioblastoma, câncer de pulmão, carcinomatose peritoneal, câncer de ovário e câncer de pâncreas8,9,10,11,12,13. Além de ser de baixo custo, facilmente estabelecida e organizada para experimentos de alto rendimento, a plataforma microfluídica é totalmente opticamente compatível para análise de imagens em tempo real de interações tumor-estroma e resposta a estímulos ou terapêutica. Cada tipo de célula no sistema é marcado com um marcador fluorescente diferente para permitir a visualização direta e o rastreamento do comportamento celular durante todo o experimento, criando uma janela para o microambiente dinâmico do tumor. Mostramos anteriormente que o VMT modela mais fielmente o crescimento, arquitetura, heterogeneidade, assinaturas de expressão gênica e respostas a drogas in vivo do que as modalidades de cultura^padrão10. É importante ressaltar que o VMT apoia o crescimento e o estudo de células derivadas do paciente, incluindo células cancerosas, que modelam melhor a patologia dos tumores pais do que as culturas esferoides padrão e avançam ainda mais os esforços de medicina personalizada¹¹. Este manuscrito descreve os métodos para estabelecer a VMT, mostrando sua utilidade para o estudo de cânceres humanos.

Protocolo

1. Projeto e fabricação

1. Design do dispositivo
   1. Para a fabricação de dispositivos microfluídicos, criar um molde de SU-8 usando uma camada de 200 μm de SU-8 spin-revestida em um bolacha de Si-wafer (RCA-1 limpo e 2% fluoreto de hidrogênio (HF) tratado), seguido por uma etapa de fotolitografia de máscara única, conforme descrito anteriormente ^8,9.
   2. Fundir uma réplica de polidimetilsiloxano (PDMS) de 4 mm de espessura do molde SU-8 para gerar um molde de poliuretano durável para etapas de fabricação a jusante. Várias iterações de projeto podem ser usadas 8,9,10,11,12,13,14,15.
   3. Na iteração atual, projete o dispositivo microfluídico para ser instalado sob medida em um formato de placa padrão de 96 poços e consistindo de uma camada de feição PDMS de 2 mm de espessura com 12 unidades de dispositivo microfluídico delimitadas por uma fina camada de membrana de polímero transparente (1/16 polegada) na parte inferior (Figura 1A).
   4. Assegurar que as unidades de tecido individuais consistam em uma câmara de tecido flanqueada por entrada de carga de gel (L1) e saída (L2), um regulador de pressão (PR)¹⁶ e canais microfluídicos desacoplados conectados a 2 entradas e saídas de mídia de cada lado (M1-M2, M3-M4; Figura 1B).
   5. Posicione cada entrada e saída dentro de um único poço que sirva como um reservatório médio para estabelecer a pressão hidrostática (10 mm H₂O) através do canal microfluídico. Para permitir a anastomose da rede vascular com os canais externos, conecte os canais microfluídicos à câmara tecidual através de poros de comunicação de 50 μm de largura (6 na parte superior, 6 na parte inferior).
      NOTA: Os resistores microfluídicos criam um gradiente de pressão intersticial de 5 mm H₂O através da câmara tecidual que se torna intraluminal quando a rede vascular está completamente formada ^8,10. Os procedimentos subsequentes começam com uma placa de alto rendimento totalmente montada.

Gráfico 1. Projeto de plataforma microfluídica. (A) O esquema do conjunto da plataforma mostra a camada de feição do PDMS com 12 unidades de dispositivo coladas a uma placa de 96 poços sem fundo e seladas com uma fina membrana de polímero transparente. Cada unidade de dispositivo ocupa uma coluna de poços na placa. A unidade de dispositivo único delineada em vermelho é mostrada com detalhes em (B). (B) O esquema de uma unidade de dispositivo mostra uma única câmara de tecido posicionada dentro de um poço da placa de 96 poços e duas portas de carregamento com orifício de entrada e saída (L1-L2) perfurado para permitir a introdução de mistura célula-matriz. As entradas e saídas médias (M1-M2, M3-M4) são perfuradas e posicionadas dentro de poços que servem como reservatórios de meio. Diferentes volumes de meios estabelecem um gradiente de pressão hidrostática através da câmara tecidual através de canais microfluídicos desacoplados. A unidade reguladora de pressão (PR) serve como uma válvula de ruptura de gel para aumentar a facilidade de carregamento. Observe que o dispositivo tem 200 μm de profundidade e a câmara de tecido é de 2 mm x 6 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparações antes do carregamento

1. Cultura celular
   1. Manter as células de acordo com as recomendações do fabricante em incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂ .
   2. Frascos de placa T75 de EC, NHLF ou outras células fibroblastos/estromais transduzidas e células cancerosas desejadas 3-4 dias antes do carregamento em uma densidade informada pelos protocolos do fabricante e do usuário. Para este protocolo, placa 1 x 10⁶ células por frasco para cada tipo de célula. Cultura de CE em meio completo de Endothelial Growth Media 2 (EGM2), NHLF em Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de SFB e células cancerosas em meios apropriados, dependendo do tipo celular.
   3. Manter as células alimentando-se com os respectivos meios a cada 2-3 dias e reconfirmar a eficiência de transdução ou marcação visualizando as células sob um microscópio fluorescente. No dia do carregamento, assegure-se de que a CE seja 80%-100% confluente, enquanto NHLF seja subconfluente em 70%-80%.
2. Preparação do fibrinogênio
   1. Preparar a solução de fibrinogênio para a concentração desejada (normalmente, 5-8 mg/mL suporta a formação de rede vascular robusta), responsável pela porcentagem de coagulação do fibrinogênio. Calcule a quantidade de fibrinogênio necessária com a seguinte equação:
      Fibrinogênio (mg) = (volume (mL)) x (concentração (mg/mL))/ (coagulação %)
   2. Dissolver o fibrinogênio em um volume apropriado de meio endotelial basal 2 (EBM2), aquecido a 37 °C, agitando suavemente o tubo (não vórtice). Incubar o fibrinogênio em banho-maria a 37 °C para permitir que ele entre completamente em solução. É importante ressaltar que não use um meio completo.
   3. Solução de fibrinogênio com filtro estéril com filtro de 0,22 μm e alíquota para o volume desejado, tipicamente 400 μL por tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Outras proteínas da matriz (por exemplo, colágenos, fibronectina ou laminina) podem ser inseridas na mistura de fibrinogênio.

3. Carregamento das amostras

NOTA: O carregamento é sensível ao tempo e deve ser concluído do início (levantamento de células) ao fim (adição de mídia aos dispositivos) dentro de cerca de 1,5-1,75 h para garantir os melhores resultados. Cada etapa é anotada com um temporizador sugerido para ajudar a manter o usuário no caminho certo.

1. Preparo de materiais (Dia do carregamento)
   1. Colocar em banho-maria a 37 °C durante 10-15 minutos: solução salina balanceada de Hank (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) para lavar as células, reagente de dissociação celular, meios (por exemplo, EGM2, DMEM)
   2. Manter os seguintes reagentes num frigorífico a 4 °C até estarem prontos a utilizar: trombina, laminina (descongelada durante a noite a 4 °C).
   3. Descongelar alíquota de fibrinogênio à temperatura ambiente. Preparar alíquotas de 1,5 μL de trombina em tubos de microcentrífuga de 500 μL, com um tubo por unidade de dispositivo. Certifique-se de que a alíquota de trombina esteja na parte inferior de cada tubo para facilitar o carregamento.
   4. Coloque placas de alto rendimento esterilizadas por UV em um exsicador por pelo menos 30 minutos antes do carregamento para remover o ar preso na microfluídica.
2. Preparação celular (Início do temporizador = início em 0 min)
   1. Verifique as células ao microscópio em aumento de 4x para confirmar a confluência e a eficiência da transdução.
   2. Lavar cada frasco T75 de células 2x com 5 mL de HBSS e aspirar completamente. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação a cada frasco e incubar a 37 °C, 5% CO₂ durante 1-2 min.
   3. Bata suavemente na placa usando a palma da mão e verifique se todas as células foram levantadas.
   4. Lavar as células do balão com 9 ml de meio apropriado e recolher-as numa camada cónica de 15 ml. Remova imediatamente uma pequena alíquota para contagem de células.
   5. Centrifugar as células a 300 x g durante 3-5 minutos a 4 °C. Ao centrifugar células, conte as células. Um frasco T75 confluente de CE ou NHLF deve produzir pelo menos 2 x 10⁶ células.
   6. Após centrifugação, aspirar o meio e ressuspender o pellet em meio apropriado na concentração de 1 x 10⁶ células/mL. Mantenha as células no gelo.
3. Preparação da mistura celular e fibrinogênio (Timer = início em 20 min)
   1. Determine quantos dispositivos serão carregados, adicionando 1-2 para contabilizar a perda de pipetagem, e multiplique pelo volume de mistura célula/fibrinogênio necessário por dispositivo. Isso dependerá da configuração do dispositivo, mas para o design do dispositivo apresentado neste artigo, são necessários 6 μL por dispositivo.
   2. A concentração de cada tipo celular deve ser determinada experimentalmente. Para um ponto de partida, carregar CE a uma concentração de aproximadamente 7 x 10⁶ células/mL e NHLF a uma concentração de 3,5 x 10⁶ células/mL. A concentração de células cancerosas pode variar consideravelmente com base em sua taxa de crescimento, mas normalmente está dentro da faixa de 0,5-2 x 10⁶ células/mL. Use esta equação para calcular o número de células necessárias:
      Número de células necessárias = (volume de fibrina (μL))/1000 μL x (concentração de células)
   3. Ressuspenda as células a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL e use a seguinte equação para determinar o volume de células necessário:
      Volume de células necessárias (μL) = (número de células necessárias)/1000
   4. Misture os respectivos volumes de EC, NHLF e células cancerosas (apenas para VMT) em um tubo cônico e centrífuga a 300 x g por 3-5 min a 4 °C.
   5. Depois de girar, aspirar cuidadosamente o meio e pipetar qualquer meio residual perto do pellet. Ressuspenda suavemente, mas completamente, o pellet no volume calculado de fibrinogênio, tomando cuidado extra para não introduzir bolhas de ar. Continue no gelo.
   6. Traga placas esterilizadas e alíquotas de trombina para o capuz de cultura de tecidos.
4. Carregando dispositivos (Timer = início em 30-35 min)
   1. Usando uma pipeta P20, pipetar 6 μL de volume da mistura célula/fibrina. Certifique-se de pipetar a mistura para cima e para baixo pelo menos 5x para garantir uma suspensão de célula uniforme. Mantenha a mistura no gelo para retardar a coagulação.
   2. Misture suavemente a célula/fibrina em um tubo de trombina, colocando a ponta da pipeta diretamente na alíquota de trombina no fundo do tubo. Imediatamente pipetar para cima e para baixo pelo menos 2x, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. A fibrina começará a coagular uma vez misturada com trombina, tão rapidamente, mas deliberadamente completar etapas 3.4.3. e 3.4.4. antes dos géis de fibrina na ponta da pipeta (~3 s).
   3. Levante a placa de alto rendimento em um ângulo e insira rapidamente a ponta do pipet em uma das portas de carregamento do dispositivo (L1 ou L2). Consulte a Figura 2A para obter o esquema.
   4. Empurre o êmbolo de pipeta até a primeira parada com um movimento suave e fluido para injetar a mistura célula/fibrina na câmara de tecido. Preste atenção para que o gel atravesse completamente a câmara.
      NOTA: Aplicar muita pressão durante esta etapa pode levar ao rompimento do gel nos canais microfluídicos na parte superior e/ou inferior das câmaras de tecido.
   5. Coloque suavemente a placa de volta no exaustor de cultura de tecidos sem remover a ponta da pipeta, liberar o êmbolo da pipeta ou perturbar a pipeta. Use a mão para torcer e remover a ponta da pipeta do P20 e deixe-a no orifício da porta de carregamento. Não use o botão ejetor para remover a ponta, pois isso causará muita pressão.
   6. Prossiga com as etapas 3.4.1-3.4.5 para os dispositivos restantes.
   7. Quando o carregamento estiver completo, deixe a placa descansar por 2 minutos sem ser perturbada na capa de cultura de tecidos.
   8. Remova as pontas da pipeta torcendo-as suavemente e puxando-as das portas de carregamento. Substitua a tampa da placa.
   9. Incubar toda a placa durante 15-20 minutos numa incubadora a 37 °C para permitir que o gel se polimerize completamente.
   10. Após a incubação, verifique cada unidade do dispositivo sob o microscópio. Verifique se as células estão distribuídas uniformemente por toda a câmara, sem bolhas de ar, e se há uma interface de gel claramente visível entre a câmara tecidual e os canais microfluídicos, como na Figura 2B-C.
5. Revestimento do canal com laminina (Timer = início em 45-50 min)
   1. Após os géis estarem completamente sólidos, introduzir laminina nos canais microfluídicos para promover a anastomose vascular.
   2. Usando um P20, introduzir 4 μL de laminina em cada canal microfluídico (superior e inferior) do dispositivo. Insira a ponta da pipeta em M1 ou M3 e expulse a laminina lentamente, observando para garantir que a laminina cubra todo o canal superior e, em seguida, repita para M2 ou M4 para revestir todo o canal inferior.
   3. Determine a orientação pipetando a laminina do lado oposto ao regulador de pressão para permitir pressão suficiente para empurrá-la. No entanto, se a laminina não viajar facilmente de um lado, remova a ponta de um lado e empurre a laminina do outro lado. Ir para a segunda parada da pipeta (ou seja, empurrar o êmbolo até o fim) pode ser necessário para gerar pressão suficiente para empurrar a laminina através de todo o canal.
   4. Retire a ponta suavemente da entrada/saída da mídia. Não use o botão ejetor no P20.
   5. Repetir os passos 3.5.1-3.5.4 para cada dispositivo e incubar a placa a 37 °C, 5% CO₂ durante 10 minutos.
6. Adição de mídia (Timer = início em aproximadamente 1 h 10 min)
   1. Adicionar 275 μL de meio completo EGM2 nos reservatórios de meios não acoplados de poços nas fileiras A e B ou G e H. Este será o lado alto, e a orientação deve ser determinada fazendo com que os poços do lado oposto ao regulador de pressão tenham alto volume para iniciar. A mídia será empurrada do lado alto pela gravidade.
   2. Usando uma pipeta P200, introduzir 75 μL de meio nas entradas/saídas médias dos poços contendo os 275 μL de EGM2. Insira a ponta no orifício de entrada da mídia e expulse lentamente o meio, observando que a mídia viaja pelo canal e borbulha do outro lado.
   3. Remova a ponta da pipeta e empurre o meio restante da ponta para o reservatório do meio de modo que o volume total no lado alto seja de 350 μL.
   4. Repita as etapas 3.6.1-3.6.3 para cada unidade de dispositivo, canais superior e inferior.
   5. Adicionar 50 μL de meio para cobrir completamente o lado baixo, poços nas fileiras A e B ou G e H, dependendo da orientação descrita acima. Certifique-se de que há uma camada uniforme de mídia cobrindo o fundo do poço. Consulte a Figura 2D para obter um esquema mostrando os volumes de mídia nos reservatórios.
7. Remoção de bolhas de ar (pós-carregamento)
   NOTA: A remoção de bolhas é uma etapa crítica para garantir o fluxo adequado em cada dispositivo. No dia 2, as células endoteliais e os fibroblastos começarão a se esticar em resposta ao fluxo (Figura 2E).
   1. Uma vez que todos os meios são adicionados, incubar as placas por 1-2 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO₂ antes de verificar se há bolhas de ar nos canais ou nas entradas/saídas médias.
   2. Visualize bolhas nos canais de mídia no microscópio e expulse reintroduzindo 75 μL de mídia nos canais para empurrar as bolhas para fora.
   3. Visualize bolhas nas entradas/saídas médias a olho. Use uma pipeta P200 para remover as bolhas de ar presas nas entradas e saídas médias, empurrando o êmbolo para baixo, introduzindo a ponta no orifício e puxando a bolha para fora, levantando o êmbolo para aplicar pressão negativa e sugar a bolha.

Gráfico 2. Esquema de carregamento do dispositivo. (A) Usando uma pipeta P20, a mistura célula/fibrina é introduzida na câmara de tecido de cada unidade de dispositivo através de uma das portas de carregamento. (B) A micrografia de Brightfield mostra um dispositivo microfluídico carregado de EC, fibroblastos e células cancerosas para formar uma VMT. Barra de escala = 500 μm. (C) Micrografia de fluorescência do aparelho em B mostrando CE em vermelho, tumor em ciano e fibroblastos em azul. (D) O esquema mostra a adição de meio nos reservatórios, com 350 μL no lado alto e 50 μL no lado baixo para gerar a cabeça de pressão hidrostática. (E) Dia 2 da cultura de VMT mostra fibroblastos e CE começando a se esticar para formar a rede vascular. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Manutenção de dispositivos e aplicações experimentais

1. Manutenção e tratamento medicamentoso
   NOTA: Para manter o fluxo no sistema, a pressão hidrostática deve ser restabelecida diariamente pipetando o volume do meio do lado baixo de volta para o lado alto ou vice-versa, garantindo que o volume total no lado alto permaneça em 350 μL. A direção do fluxo é alterada todos os dias após o dia 2 do estabelecimento do VMO ou VMT. Detalhes adicionais de manutenção e tratamento são fornecidos abaixo.
   1. Troca de meios a cada dois dias com EGM2 completa até que a vasculatura esteja totalmente estabelecida (dia 5-6). Aspirar completamente os meios antigos e substituir os poços de alta pressão (350 μL) e os poços de baixa pressão (50 μL).
      NOTA: A determinação experimental de formulações de meios otimizados pode ser conduzida para outros tipos celulares, muitas vezes envolvendo uma mistura de 50:50 ou adição de componentes específicos em EGM2.
   2. Uma vez formada a rede vascular e o tecido totalmente desenvolvido (dia 4-7), realizar um teste de perfusão com dextran antes de utilizar os dispositivos para experimentos (passo 4.2.1.). Utilize apenas dispositivos que tenham perfusão suficiente na câmara tecidual.
   3. Para experimentos com terapêutica, no dia em que o tratamento começar, tire imagens em todos os canais fluorescentes de cada dispositivo. Isso servirá como linha de base.
   4. Tratar os dispositivos terapêuticos desejados, substituindo o meio por meio fresco contendo o fármaco diluído na concentração desejada. Certifique-se de que os medicamentos sejam diluídos em veículos apropriados, dependendo da recomendação do fabricante, mas não excedam 0,01% de DMSO na mídia.
   5. Expor os dispositivos à droga pelo tempo desejado (normalmente 48 h, mas pode ser informado pela farmacocinética).
   6. Fotografe cada canal de cada dispositivo no intervalo de tempo desejado para monitorar a resposta ao tratamento. Manter as placas conforme indicado no passo 4.1.1 durante a duração da experiência.
   7. Ao final do experimento, as placas de água sanitária e colocar em um recipiente de risco biológico, fixar com PFA a 4% para coloração por imunofluorescência (etapa 4.3.), ou colher para isolamento de células vivas ou RNA (etapa 4.4.).
2. Ensaios de perfusão
   1. Perfusão de dextran
      NOTA: A permeabilidade/perviedade vascular pode ser determinada pela perfusão da rede vascular com dextran fluorescentemente marcado de pesos moleculares variados (40 kD, 70 kD ou 150 kD). FITC- ou rodamina-dextran pode ser usado dependendo da etiqueta fluorescente do CE.
      1. Antes da perfusão, determine a exposição apropriada do canal de FITC ou rodamina adicionando alguns μL de dextran dentro do canal fluídico ou câmara de um dispositivo vazio. Defina o tempo de exposição logo abaixo do nível de saturação através do uso de software de microscópio para exibir um histograma de intensidades de pixel, garantindo uma faixa dinâmica caracterizada por pixels uniformemente distribuídos sem qualquer concentração notável de valores de alta intensidade.
      2. Faça micrografias de todos os dispositivos em canais de interesse, incluindo uma imagem de fundo de todos os dispositivos no canal de dextran fluorescente, para calibrar contra o fundo. Use a mesma exposição determinada acima e alinhe a câmara de tecido no centro do quadro da imagem para garantir imagens consistentes para quantificação.
      3. Preparar um estoque principal de FITC-dextran ou rodamina-dextran na concentração de 5 mg/mL em 1x DPBS. Esta unidade populacional pode ser mantida a 4 °C.
      4. Para preparar um estoque de trabalho, diluir 5 mg/mL de estoque até uma concentração final de 50 μg/mL em EGM2.
      5. Substitua o meio nos reservatórios pela solução de dextran diluída como metade do volume máximo (175 μL em um poço e o lado alto no canal superior ou inferior da câmara de tecido). Substitua o meio nos outros poços de modo que o lado alto não acoplado receba 175 μL de EGM2 fresco sem dextrano e os poços do lado baixo tenham apenas 50 μL em cada.
         NOTA: Dextran só deve ser adicionado a um lado dos canais microfluídicos (superior ou inferior) para permitir a visualização do corante viajando através do lado de alta pressão, para o leito vascular e para fora do lado de baixa pressão.
      6. Sob o microscópio, observe se o dextran fluorescente flui através da rede vascular. Isso normalmente ocorrerá dentro de aproximadamente 2 minutos após a adição do corante ao reservatório do meio.
      7. Comece a criar imagens do canal de dextran fluorescente (e outros canais, se desejado). Este é o ponto de tempo T = 0. Tire imagens adicionais em vários pontos de tempo (normalmente a cada 10 min) ou em uma única imagem de ponto final.
   2. Perfusão de células
      NOTA: Vários tipos de células podem ser perfundidos através da vasculatura dependendo do desenho do estudo, incluindo linfócitos ou macrófagos para estudos de imunologia do câncer, bem como células cancerosas para estudos de metástase. As células devem ser marcadas fluorescentemente para facilitar o rastreamento ao longo do tempo.
      1. Pelo menos 2 h antes da perfusão das células, realizar a perfusão de dextran em todos os dispositivos, conforme descrito acima. Esta etapa é importante para determinar a permeabilidade vascular antes da adição de células.
      2. Determine a exposição apropriada à câmera para as células a serem perfundidas. Pegue uma pequena amostra de células para visualizar ao microscópio e defina o tempo de exposição para esse marcador fluorescente. Defina o tempo de exposição logo abaixo do nível de saturação.
      3. Faça micrografias de todos os dispositivos em canais de interesse, incluindo uma imagem de fundo de todos os dispositivos no canal de dextran fluorescente, para calibrar contra o fundo. Utilizar a mesma exposição determinada no passo 4.2.2.1.
      4. Confirmar se o dextran se difundiu completamente para fora das câmaras de tecido antes de colher as células para perfusão. Colha e conte as células de interesse.
      5. Ressuspenda as células na densidade apropriada em EGM2. Por exemplo, as células T são normalmente adicionadas a aproximadamente 1 x 10⁶ células/mL para imitar a concentração no sangue.
         NOTA: EC são sensíveis à composição da mídia, mas podem tolerar até 50% de mistura com a maioria dos outros meios. Teste antes.
      6. Adicionar 175 μL de suspensão celular em um poço no lado superior de cada dispositivo e adicionar 175 μL de EGM2 completo ao outro poço. No lado baixo, adicione 50 μL de meio completo EGM2 em ambos os poços.
      7. Sob o microscópio, observe se as células fluorescentes fluem através da rede vascular. Isso normalmente ocorrerá dentro de aproximadamente 2 minutos após a adição das células ao reservatório do meio.
      8. Uma vez que o fluxo celular é estabelecido, comece a obter imagens do canal celular fluorescente (e outros canais, se desejado). Este é o ponto de tempo T = 0. Tire imagens adicionais em vários pontos de tempo ou uma única imagem de ponto final, dependendo do desenho do estudo. Por exemplo, a geração de imagens a cada 10 minutos resultará em cursos de tempo de alta resolução ou a cada 6-12 h para rastrear movimentos celulares periódicos.
3. Coloração por imunofluorescência (IF)
   1. Aspirar meios de poços. Adicionar 200 μL de PFA a 4% em ambos os poços do lado superior de cada unidade do dispositivo e 50 μL no lado baixo. Permitir que o PFA flua através das câmaras durante 15 minutos à temperatura ambiente ou 30 minutos a 4°C.
   2. Durante a incubação, preparar uma placa de 24 poços com 500 μL de 1x PBS por poço. Calcule quantos poços são necessários para manchar cada dispositivo.
   3. Remova completamente o PFA dos poços. Vire a placa de cabeça para baixo e remova cuidadosamente o suporte de plástico na membrana.
      NOTA: A coloração IF também pode ser realizada in situ sem remover a membrana e o dispositivo. Para fazer isso, execute etapas de coloração perfundindo reagentes através do VMO/VMT e aumente a duração de cada etapa de incubação em aproximadamente 6 vezes.
   4. Descasque com muita delicadeza e cuidado a camada de membrana inferior da camada característica do dispositivo para expor as câmaras de tecido, segurando ambos os cantos e puxando para baixo em um movimento lento e suave. A maior parte do tecido deve permanecer na câmara tecidual. Consulte a Figura 3A.
   5. Use uma lâmina de barbear ou bisturi para aplicar força suficiente para cortar totalmente a camada de feição e cortar um pequeno retângulo ao redor de cada unidade de dispositivo individual, como mostrado na Figura 3B.
   6. Cunhar uma espátula entre a camada de feição e a placa do poço. Aplique uma pressão suave sob a camada de feição para remover cuidadosamente toda a camada de feição que contém a câmara de tecido da placa do poço.
   7. Coloque cada peça da camada de feição retangular do PDMS contendo o tecido virado para baixo em um único poço contendo PBS.
   8. Quando todas as unidades estiverem em poços, lave com PBS colocando a placa em um balancim suave por 5 min, aspirando PBS do poço e substituindo-a por 500 μL de PBS fresco. Repita para um total de 3 lavagens.
   9. Aspirar PBS de cada poço e permeabilizar os tecidos com 500 μL de Triton-X a 0,5% em PBS, 2x por 10 min cada em um balancim suave. Remova a solução de permeabilização.
   10. Bloquear em 500 μL de soro a 10% em Triton-X a 0,1% por dispositivo durante 1 h à temperatura ambiente com balanço suave.
   11. Diluir os anticorpos primários em 3% de soro em Triton-X a 0,1% na concentração e volume desejados. Remova a solução de bloqueio e adicione solução de anticorpos primários suficiente para cobrir totalmente o fundo de cada poço e permitir a livre circulação dos tecidos do dispositivo (~200 μL). Cubra a placa com uma película transparente.
   12. Incubar a placa balançando durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, leve a placa contendo os tecidos do dispositivo de volta à temperatura ambiente (~15 min).
   13. Aspirar a solução primária de anticorpos de cada poço e lavar as câmaras com 500 μL de PBS, 3x por 5 min cada em um balancim suave.
   14. Adicionar 200 μL de anticorpo secundário no soro a 3% em Triton-X a 0,1% na concentração desejada. Incubar a placa com balanço suave por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
   15. Aspirar a solução de anticorpos secundários e lavar com PBS, 3x por 5 min cada com balanço suave. Adicione uma solução de 1x DAPI em Triton-X a 0,1% durante 10 minutos enquanto balança no escuro.
   16. Remova os recortes retangulares do dispositivo contendo tecidos manchados da placa usando uma pinça e coloque o lado do tecido para cima em uma toalha de papel.
   17. Pipetar alguns μL (~10 μL) de solução antifade diretamente em cada câmara e lamínula, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Deixe o antifade curar em câmaras durante a noite à temperatura ambiente no escuro e, em seguida, prossiga com a imagem.
4. Isolamento tecidual e celular para ensaios moleculares
   NOTA: Cada placa de alto rendimento conterá aproximadamente 1-2 x 10⁵ células, dependendo do ponto de tempo de colheita. Dimensionar o número de réplicas experimentais para contabilizar o total de células, bem como a perda potencial durante a colheita.
   1. Análises unicelulares
      1. Aspirar o meio de cada poço e inverter a placa de alto rendimento para que a camada do dispositivo fique voltada para cima.
      2. Remova o suporte plástico na membrana. Descasque com muita delicadeza e cuidado a membrana inferior do PDMS da camada característica do dispositivo para expor as câmaras de tecido, segurando ambos os cantos e puxando para baixo em um movimento lento e suave.
      3. A membrana pode ser removida mesmo com a colagem adequada. A maior parte do tecido deve permanecer na câmara tecidual após a remoção da membrana; No entanto, se alguma porção estiver presa à membrana, siga os passos abaixo na própria membrana.
      4. Lavar cada unidade do dispositivo com 500 μL de HBSS ou PBS. A cada unidade do dispositivo, adicione 100 μL de reagente de dissociação e deixe-o descansar como uma gota sobre o dispositivo. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C por 5 min.
      5. Após a digestão, use uma pipeta P200 para pipetar para cima e para baixo através das câmaras de tecido e coletar os tecidos no reagente de dissociação. Mover a ponta da pipeta para frente e para trás em cada dispositivo para garantir a remoção completa do tecido e coletar em um cônico de 15 mL com 500 μL de EGM2 para neutralizar o reagente de dissociação.
      6. Para a remoção completa das células remanescentes da câmara de tecido, adicionar 500 μL de EGM2 a cada unidade do dispositivo e lavar com uma pipeta P200.
      7. Centrifugar a solução de digestão contendo os tecidos deslocados a 300 x g durante 5 min a 4 °C para pellet de células únicas e tecidos inteiros.
      8. Aspirar cuidadosamente o meio e adicionar 500 μL de 1 mg/mL (200 U/mL) de colagenase tipo IV, 0,1 mg/mL de hialuronidase tipo V e 200 U/mL de DNAse tipo IV em HBSS aos tecidos.
      9. Após uma ressussão suave, deixe a solução descansar durante 2 minutos à temperatura ambiente antes de pipetar suavemente novamente para dissociar o gel.
      10. Lavar, misturar a digestão com 10 mL de EGM2 e centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C. Ressuspender as células em 1x DPBS com BSA ou HSA a 1% e passar por um filtro pré-molhado de 70 μm girando a 200 x g por 1 min.
      11. Conte as células e ajuste o volume para que a concentração final seja de 1000 células por μL. As suspensões celulares podem então ser submetidas a FACS, citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única.
   2. Isolamento de RNA de tecidos inteiros
      1. Siga as etapas 4.4.1.1 e 4.4.1.2 acima.
      2. Adicione aproximadamente 10 μL de tampão de lise de RNA em cada câmara de tecido exposta, garantindo que o tampão se agrupe diretamente sobre os tecidos. Não utilize mais de 100 μL de tampão de lise de ARN no total.
      3. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente. Use o P20 para pipetar para cima e para baixo em cada unidade de dispositivo e use a ponta da pipeta para raspar qualquer material residual da câmara de tecido, se necessário.
      4. Transfira o máximo possível de tampão de lise para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Repita as etapas 4.4.2.2.-4.4.2.3. para os dispositivos restantes e agrupar amostras no tubo de 1,5 mL.
      5. Siga as instruções do fabricante para isolar o RNA, dependendo do kit ou dos reagentes.

Gráfico 3. Plataforma de preparação para imunomarcação. (A) Esquema de plataforma de dispositivo totalmente montada com camada de membrana na parte superior. Para remover a membrana, puxe cuidadosamente cada canto da camada externa para baixo em um movimento constante e suave. (B) Uma vez que a camada de membrana é removida completamente, use uma lâmina, bisturi ou faca para cortar retângulos ao redor da câmara de tecido de cada unidade do dispositivo, tomando cuidado para não cortar o próprio tecido. Uma espátula pode então ser encravada sob cada retângulo para desalojá-la da placa e colocar cada unidade em um único poço de uma placa de 24 poços com PBS para coloração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Seguindo os protocolos aqui descritos, VMOs e VMTs foram estabelecidos usando EC, NHLF e, para VMT, a linhagem celular de câncer de mama triplo-negativa MDA-MB-231. VMOs estabelecidos também foram perfundidos com células cancerosas para mimetizar metástases. Em cada modelo, no 5º dia de co-cultura, uma rede vascular se auto-monta em resposta ao fluxo impulsionado pela gravidade através da câmara tecidual, servindo como um conduto para a entrega in vivo de nutrientes, terapêutica e células cancerígenas ou imunes ...

Discussão

Quase todos os tecidos do corpo recebem nutrientes e oxigênio através da vasculatura, tornando-se um componente crítico para a modelagem realista da doença e triagem de drogas in vitro. Além disso, várias neoplasias malignas e estados patológicos são definidos por disfunção e hiperpermeabilidade do endotélio^vascular3. Notavelmente, no câncer, a vasculatura associada ao tumor é frequentemente mal perfundida, interrompida e vazada, agindo assim como uma barreira para a entrega de células te...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fabricação
(3-Mercaptopropil)trimetoxissilano, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One  μ Microplacas de Poliestireno de 96 poços	Greiner Bio-One	655096
Metanol ≥ 99,8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Punção de biópsia descartável estéril com êmbolo, 1 mm de diâmetro,	membrana Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS	de plasma PAX Industries	HT-6240
PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
Dessecador a vácuo de policarbonato transparente SP Bel-Art Lab Companion Bel-Art Tampas	Bel-Art	F42400-4031
com anéis de condensação, placa de 96 poços	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Kit de elastômero de silicone (PDMS)	Dow	4019862
Cultura de células/carregamento
BioTek Lionheart FX Automated Microscópio	Agilent
CELLvo Células Progenitoras Endoteliais Humanas	StemBioSys	N/A
Colágeno I, cauda de rato	Enzo Ciências da Vida
Colagenase de Clostridium histolyticum (tipo 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank' s Solução salina balanceada, 1X sem cálcio e magnésio	Corning	21-021-CV
Corning  DMEM com L-Glutamina, 4,5 g/L de Glicose e Piruvato de Sódio	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190144
EGM-2 Meio de Crescimento de Células Endoteliais-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogênio de plasma bovino	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectina plasma humano	Sigma-Aldrich	F0895
Isotiocianato de fluoresceína– dextrano (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatina de pele suína	Sigma-Aldrich	G1890
Hialuronidase de testículos de ovelha (tipo 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminina Proteína de camundongo	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Fibroblastos Pulmonares Humanos Normais	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldeído 4% em 0.1M Tampão de Fosfato Salino, pH 7.4	Microscopia Eletrônica Ciências	15735-90-1L
PBMCs - Células mononucleares do sangue periférico	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7,4	Gibco	10010049
Soro Bovino Fetal de Grau Premium (FBS), Inativado por Calor	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Kit de Micropreparação de RNA Rápido	Zymo Pesquisa	R1051
Trombina de plasma bovino	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (eletroforese),	Fisher BioReagents	BP151-100
TripLE Express Enzyme (1X), vermelho de fenol	Gibco	12605028
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Tecnologia	LL-0003