In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

A somatosensação, codificação neural de estímulos mecânicos, térmicos e químicos que incidem sobre a pele ou outras estruturas corporais, incluindo músculos, ossos e vísceras, inicia-se com a atividade em neurônios aferentes primários que inervam essas estruturas¹. Abordagens eletrofisiológicas baseadas em unidades únicas têm fornecido uma riqueza de informações sobre os subtipos aferentes envolvidos nesse processo, bem como como suas propriedades estímulo-resposta podem mudar ao longo do tempo ^1,2,3. No entanto, embora ainda existam fortes evidências em apoio à teoria da linha marcada, que sugere que modalidades sensoriais específicas são transmitidas por subpopulações específicas de neurônios, a capacidade de muitas subpopulações de neurônios de responder aos mesmos tipos de estímulos mecânicos, térmicos e químicos sugere que a maioria dos estímulos somatossensoriais é codificada por múltiplas subpopulações de neurônios^{4, 5º}. Assim, uma melhor compreensão da somatosensação só virá com a capacidade de estudar a atividade de 10, senão centenas, de neurônios simultaneamente.

Os avanços nas abordagens ópticas com o advento relativamente recente de técnicas de imagem confocal e, posteriormente, multifóton e digital têm facilitado a capacidade de realizar análises populacionais relativamente não invasivas da atividade neuronal ^6,7. Um dos últimos obstáculos na aplicação dessa tecnologia tem sido o desenvolvimento de ferramentas que possibilitem a avaliação óptica da atividade neural. Dada a velocidade de um potencial de ação que pode começar e terminar em menos de um milissegundo, um corante sensível à voltagem com a capacidade de acompanhar mudanças no potencial de membrana na velocidade de um potencial de ação seria a ferramenta ideal para esse fim. Mas, embora tenha havido um tremendo progresso nessa área 7,8,9,10, a relação sinal-ruído para muitos desses corantes ainda não é alta o suficiente para permitir uma análise populacional de centenas de neurônios em nível de célula única. Como uma abordagem alternativa, os investigadores têm se voltado para o monitoramento de mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). As limitações dessa estratégia foram claras desde o início e incluem o fato de que um aumento na [Ca²⁺]_i é uma medida indireta da atividade neural¹¹; que um aumento na [Ca²⁺]_i pode ocorrer independentemente do influxo de Ca²⁺ associado à ativação de canais de Ca²⁺ dependentes de voltagem (VGCCs)^12,13; que a magnitude e a duração de um transiente de Ca²⁺ podem ser controladas por processos independentes da atividade do VGCC 11,12,14; e que o curso temporal dos transitórios de Ca²⁺ excede em muito o de um potencial de ação¹⁵. No entanto, há uma série de vantagens significativas associadas ao uso de Ca²⁺ como uma medida indireta da atividade neural. Não menos importante é a relação sinal-ruído associada à maioria dos indicadores de Ca²⁺, refletindo tanto a magnitude da mudança no Ca²⁺ intracelular quanto o fato de que o sinal está surgindo do espaço tridimensional do citosol e não do espaço bidimensional da membrana celular. Além disso, com o desenvolvimento de indicadores de Ca²⁺ codificados geneticamente (GECI's), é possível tirar proveito de estratégias genéticas para direcionar a expressão dos indicadores de Ca²⁺ em subpopulações específicas de células, facilitando análises em nível populacional em preparações intactas (por exemplo, ver¹⁶).

Dado o número de ferramentas genéticas agora disponíveis em camundongos, não deve ser surpresa que as GECI tenham sido usadas mais extensivamente nesta espécie. Linhagens de camundongos com expressão constitutiva de GECI em subpopulações de neurônios sensoriais têm sido desenvolvidas ^7,16,17. Com o desenvolvimento de linhagens de camundongos expressando recombinases em tipos celulares específicos, é possível utilizar estratégias ainda mais sofisticadas para controlar a expressão de^GECI15. No entanto, embora essas ferramentas sejam cada vez mais poderosas, há uma série de razões pelas quais outras espécies, como ratos, podem ser mais apropriadas para algumas questões experimentais. Estes incluem o tamanho maior, facilitando uma série de manipulações experimentais que são difíceis, se não impossíveis, no rato menor; a facilidade de treinar ratos em tarefas comportamentais relativamente complexas; e pelo menos algumas evidências de que as propriedades biofísicas e os padrões de expressão de vários canais iônicos em neurônios sensoriais de ratos podem ser mais semelhantes aos observados em neurônios sensoriais humanos do que os mesmos canais em camundongos em relação ao humano¹⁸.

Enquanto a transdução dos estímulos somatossensoriais geralmente ocorre nos terminais periféricos dos aferentes primários, o potencial de ação iniciado na periferia deve passar pela estrutura que abriga os somas aferentes primários, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG) ou trigeminal (TG), antes de atingir o sistema nervoso^central19. Embora haja evidências de que nem todo potencial de ação que se propaga ao longo de um axônio aferente primário invadirá o corpo celular²⁰, consequência do fato de os somatas aferentes primários estarem conectados ao axônio aferente principal através de uma junção T¹⁹, a maioria dos potenciais de ação iniciados na periferia parece invadir o soma²¹. Isso confere três vantagens experimentais ao usar GECIs para avaliar a codificação populacional em aferentes primários: o grande tamanho do corpo celular em relação aos axônios aumenta ainda mais o sinal para ruído quando se usa [Ca²⁺]_i como uma medida indireta de atividade aferente; os DRG são geralmente de fácil acesso; e avaliar a atividade em um local espacialmente distante dos terminais aferentes minimiza o impacto potencial da cirurgia necessária para expor os gânglios sobre as propriedades estímulo-resposta dos terminais aferentes. No entanto, como os TG estão localizados abaixo do cérebro (ou acima da paleta), eles são muito mais difíceis de acessar do que o DRG. Além disso, embora existam muitas semelhanças entre os neurônios DRG e TG, há uma lista crescente de diferenças também. Isso inclui a organização aproximadamente somatotópica dos neurônios no TG²², estruturas únicas inervadas, diferentes padrões terminais centrais 23,24,25,26 e, agora, uma lista crescente de diferenças tanto na expressão gênica^27,28 quanto na expressão funcional do receptor²⁹. Além disso, como estamos interessados na identificação de mecanismos periféricos de dor, o número relativamente grande de síndromes dolorosas que parecem ser exclusivas do sistema trigeminal (por exemplo, enxaqueca, neuralgia do trigêmeo, síndrome da ardência bucal) que parecem envolver atividade aberrante em aferentes primários 30,31,32, sugere que o GT precisa ser estudado diretamente.

Assim, enquanto as propriedades estímulo-resposta dos neurônios TG têm sido estudadas com GECIs em^{camundongos 16}, porque as razões listadas acima sugerem que o rato pode ser uma espécie mais apropriada para abordar uma variedade de questões experimentais, o objetivo do presente estudo foi desenvolver uma abordagem para usar GECIs para estudar neurônios TG no rato. Para isso, utilizamos uma abordagem viral para conduzir a expressão do GECI GCaMP6s no sistema nervoso periférico. Em seguida, removemos o prosencéfalo para permitir o acesso ao GT. Finalmente, estímulos mecânicos e térmicos foram aplicados na face, enquanto as respostas neuronais foram avaliadas em microscopia fluorescente. Juntos, esses dados suportam um papel para a utilização do rato para investigar mudanças no TG sob muitos estados, expandindo o kit de ferramentas para investigadores interessados em codificação sensorial no sistema trigeminal.

Todos os experimentos envolvendo o uso de animais em pesquisa foram realizados de acordo com as normas estabelecidas pelo National Institutes of Health e pela International Association for the Study of Pain e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh (protocolo #22051100). Ao final de cada experimento, os ratos foram eutanasiados via exanguinação com perfusão cardíaca de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS), uma abordagem aprovada pela Associação Médica Veterinária Americana e pela IACUC da Universidade de Pittsburgh.

1. Indução do GCaMP

1. Encomende ratas Sprague Dawley grávidas para que os filhotes possam ser injetados no momento apropriado após o nascimento.
2. Borrife as luvas com EtOH 70% antes de manusear cada filhote de rato. Isso impedirá que a barragem canibalize os filhotes.
3. Filhotes de ratos swab (P1-2) com 70% de EtOH e anestesiam no gelo por 3 min.
4. Injetar 15 μL de AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) por via intraperitoneal usando uma seringa Hamilton estéril e estanque ao gás de 25 μL.

2. Cirurgia de exposição do gânglio trigeminal

1. Administrar coquetel anestésico (55 mg/kg de cetamina, 5,5 mg/kg de xilazina, 1 mg/kg de acepromazina) por via intraperitoneal com base no peso corporal em ratos de 6-8 semanas de idade (aproximadamente 150-200 g).
   NOTA: Isso geralmente é suficiente para manter um plano cirúrgico de anestesia, avaliado pela ausência de um reflexo de retirada para pinça nociva de uma pata traseira. No entanto, suplemente com isoflurano através de um cone nasal se os animais se tornarem leves.
2. Uma vez totalmente anestesiado, raspe os cabelos e bigodes da cabeça e do rosto.
3. Monte o rato em uma estrutura estereotáxica com barras auriculares e coloque uma almofada de aquecimento (~37 ^oC) por baixo para manter a temperatura corporal.
4. Monitore os sinais vitais (frequência cardíaca, frequência respiratória, saturação de oxigênio no sangue) com um oxímetro de camundongo ou comparável.
   NOTA: A temperatura corporal é monitorada por uma sonda retal e mantida pela colocação de ratos em uma manta de água circulante controlada por feedback.
5. Coloque gaze mergulhada em soro fisiológico gelado na cabeça para contrair os vasos sanguíneos para minimizar o sangramento. Usando um bisturi tamanho 15, faça uma incisão na linha média da pele e do músculo sobre o crânio.
6. Use dissecção romba da pele e do músculo para expor o crânio.
7. Usando uma broca redonda de 1/4, perfure cuidadosamente a calota craniana para expor o prosencéfalo. Em seguida, use rongeurs (copo de 2,5 mm) para cortar cuidadosamente o crânio.
8. Usando um bisturi tamanho 15, faça uma incisão no cérebro (Bregma: -3,80) e no bulbo olfatório.
   NOTA: Cortar mais caudalmente além deste ponto resultará em morte de ratos
9. Use uma espátula para desconectar cuidadosamente a dura-máter do crânio e levantar suavemente o cérebro cortado para revelar o TG e a base do crânio.
   NOTA: O uso adicional de perfusão salina gelada durante toda a extração minimizará o sangramento e otimizará o campo de dissecção a seguir.
10. Usando uma caneta cauterizada, estanque qualquer sangramento resultante da extração.
    NOTA: Cortar a dura-máter resultará em sangramento inevitável. É melhor preparar aCSF gelado (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM glicose, 2,5 mM CaCl₂) para banhar a cavidade do crânio para ajudar a contrair os vasos sanguíneos, mantendo a saúde neuronal.

3. Imagem GCaMP6s

NOTA: Dado o tamanho e a densidade desses neurônios, o sistema de imagem e aquisição de dados utilizado (objetiva, microscópio, fonte de luz, câmera) determinará o número de células GECI⁺ visualizadas. A fonte de luz, a objetiva e a câmera também determinarão os parâmetros usados para a aquisição da imagem, incluindo o tempo de exposição e a taxa de captura da imagem. Enquanto técnicas multifótons e confocais podem ser usadas dependendo dos parâmetros do experimento, a microscopia de epifluorescência pode ser suficiente para resolver muitas células. Qualquer pacote de aquisição de imagens pode ser usado. O ideal é que a aplicação do estímulo seja bloqueada no tempo com o pacote do software de aquisição de imagens.

1. Coloque a cavidade craniana abaixo da objetiva e coloque o TG em foco usando luz visível.
2. O comprimento de onda de excitação do GCaMP6s é de 496 nm, e seu comprimento de onda de emissão é de 513 nm; assim, use os cubos dicroicos e de filtro apropriados para localizar as células GCaMP⁺ . Ajuste o foco para localizar e resolver a área dos gânglios em que os neurônios estão respondendo aos estímulos aplicados ao campo receptivo de interesse.
3. Utilizar uma objetiva de 10x para permitir a visualização da maioria dos neurônios do GT responsivos a estímulos mecânicos aplicados a uma região de 1^cm2 da face¹⁶. Use uma objetiva seca de 20x com uma longa distância de trabalho (10,8 mm) para aumentar a resolução.
4. Use software de aquisição (por exemplo, Metamorph) para coletar dados de fluorescência ao longo do tempo e em resposta à aplicação de estímulos.
   1. Para minimizar o fotoclareamento dos neurônios, use o menor tempo de exposição possível para detectar aumentos basais e evocados na fluorescência. Com a objetiva de ar de 20x, 0,40 NA, uma fonte de luz de haleto de mercúrio de 120 W e uma câmera complementar de metal-óxido-semicondutor (CMOS) utilizada neste estudo, um tempo de exposição de 300 ms e uma taxa de aquisição de imagens de 3 Hz, obtêm-se registros basais estáveis por >90 min.
      OBS: 1) Estes parâmetros de aquisição de imagens devem ser determinados empiricamente. 2) Mecânica (escova, puntiforme, vibração, pinça), térmica (calor e frio) e química (capsaicina, mentol, mediadores inflamatórios) podem ser aplicadas ao campo receptivo. Uma abordagem subjetiva relativamente barata é aplicar os estímulos manualmente. Abordagens mais objetivas e reprodutíveis são recomendadas, no entanto, onde atuadores controlados por realimentação podem ser usados para aplicação repetida em uma força conhecida. Embora os dispositivos Peltier controlados por feedback sejam úteis para aquecimento e resfriamento controlados, eles não são ideais para a estimulação térmica de uma face curva. Fontes de luz infravermelha controladas por feedback são uma alternativa para aquecimento, e o spray a frio é uma alternativa menos do que ideal para resfriamento.

Como já tivemos sucesso com o sorotipo AAV9 para a infecção de neurônios sensoriais deratos15, usamos esse sorotipo para a expressão de GCaMP6s em neurônios TG de ratos. Portanto, primeiramente procuramos avaliar a eficiência da infecção de neurônios sensoriais de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando este vírus foi administrado a filhotes de ratosneonatais20. Este vírus utiliza o promotor CAG, que dirige e mantém altos níveis de expressão gênica. Além disso, foi demonstrado que o AAV9 infecta eficientemente neurônios sensoriais quando administrado a ratos neonatais33. As primeiras injeções utilizaram 5 μL no 5º dia pós-natal (p5) de filhotes, resultando em aproximadamente 51,66% ± 14,33% de eficiência (Figura 1A). Para aumentar a taxa de infecção, eventualmente usamos um volume maior de vírus (15 μL) em ratos mais jovens (p2), mantendo o título viral de 2,4 x 1014 o mesmo. Essa estratégia resultou em 91,84% ± 3,18% (n = 8) de neurônios infectados (Figura 1B).

Para visualizar os neurônios TG inervando o coxim vibrissal, desenvolvemos uma estratégia cirúrgica para expor os TG in-vivo. Aproximadamente 60% do prosencéfalo pode ser removido sem afetar os grandes centros respiratórios. Isto corresponde ao tecido cerebral rostral a Bregma -3,80. Um esquema do GT exposto (esquerda) e do território de inervação do nervo infraorbital (ION, direita) são mostrados na Figura 2. A região do GT que originou a inervação do coxim vibrissal foi determinada com a aplicação de estimulação mecânica luminosa (escova) no coxim vibrissal, monitorando-se as mudanças de fluorescência a 20x. Como previsto, a região V2 do GT, que inerva a divisão maxilar da face, foi a única área ativada. Ou seja, embora não estudadas sistematicamente, não foram detectadas alterações na fluorescência em resposta a estímulos aplicados nas regiões V1 (pele na testa) ou V3 (pele na mandíbula) quando os neurônios em estudo puderam ser ativados com estímulos aplicados ao coxim vibrissal. As mudanças na fluorescência no início do estudo e em resposta aos estímulos aplicados no coxim vibrissal foram então monitoradas. A região de interesse (V2) está demarcada na Figura 3A. Consistente com relatos anteriores de níveis relativamente baixos de atividade de repouso em neurônios sensoriais34, a fluorescência em repouso foi relativamente baixa na maioria dos neurônios, e houve pouca evidência de aumentos espontâneos na fluorescência (Figura 3B). O critério utilizado para identificar a atividade evocada por estímulo em neurônios da periferia6,16,21 e do SNC 12,35,36 é um campo em evolução com vários pacotes sofisticados de fluxo de trabalho que têm sido disponibilizados gratuitamente 37,38. Uma discussão completa dos pontos fortes e fracos das várias abordagens empregadas está além do escopo do presente manuscrito. Como esse não foi o foco do presente estudo, utilizamos critérios relativamente arbitrários e subjetivos baseados no pico de resposta observado em regiões dos gânglios nas quais não havia neurônios claramente detectáveis (baseado na capacidade de ver o núcleo), de modo que um neurônio era considerado responsivo a um estímulo se o aumento da fluorescência estivesse bloqueado no tempo para a aplicação do estímulo (aumento da fluorescência detectado dentro de 1 s da aplicação do estímulo ( com base na suposição de que um potencial de ação iniciado nos axônios condutores mais lentos (0,2 m/s) iniciado em um local não superior a 3 cm do corpo celular deveria atingir o corpo celular em menos de um segundo), e foi >6 vezes o desvio padrão da resposta de pico (ΔF/F) detectou um local de controle (Figura 3C). Em seguida, caracterizamos as propriedades de resposta desses neurônios a estímulos naturais: escova, puntixe, calor e frio. Exemplos de respostas a cada um desses estímulos são mostrados na Figura 4. Notadamente, a resposta à estimulação puntiforme, mais utilizada em estudos relacionados à dor, é a resposta mais robusta (Figura 4B,F).

Nosso objetivo ao desenvolver esta técnica foi ser capaz de avaliar mudanças na codificação populacional em neurônios TG. Assim, adaptamos a lesão crônica por constrição ao ION (CCI-ION), conforme empregadoanteriormente29, para estudar ratos 2 semanas após a lesão nervosa. Após a indução do modelo, foram expostos os GT e avaliados o repouso e a atividade evocada no GT ipsilateral e contralateral ao local da lesão. Curiosamente, a magnitude do pico de resposta evocada ao pincelado foi aumentada ~2 vezes no lado lesado do nervo em relação ao pico de resposta ao mesmo estímulo aplicado no lado contralateral (Figura 5A-C). Além disso, quando dois estímulos pincelados foram aplicados em série (com intervalo interestímulos de 10 s), houve amplificação significativa da magnitude da resposta ao segundo estímulo no lado lesionado, porém não lesionado (Figura 5D).

Finalmente, como um experimento de controle inicial para confirmar que o aumento da fluorescência evocado por estímulo era devido a potenciais de ação iniciados na periferia, avaliamos o impacto da tetrodotoxina (1 μM) nas respostas evocadas por estímulo. O TTX foi injetado em um volume de 200 μL por via percutânea, conforme descrito anteriormente28 para atingir o nervo infraorbital. Como mostrado na Figura 6, a atividade evocada foi quase completamente eliminada. Em conjunto, esses resultados demonstram a utilidade do uso de AAV9-GCaMP para interrogar respostas da população TG in vivo.

Figura 1: Alta eficiência da infecção por GCaMP6s em neurônios TG com injeção neonatal de AAV. (A) Filhotes de ratos P5 foram injetados com 5 μL do vírus pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (título: 2,4 x 1014) por via intraperitoneal: a expressão de GCaMP6s foi detectada em 51,7 ± 14,3% dos neurônios TG (n = 3 cortes por animal, 7 ratos). (B) O aumento do volume de injeção para 15 μL em animais mais jovens (p2) melhorou a eficiência da infecção: a expressão de GCaMP6s foi detectada em 91,8 ± 3,2% dos neurônios TG (n = 3 cortes por animal, 8 ratos). Painéis à esquerda foram corados para GCaMP6s. Os painéis no meio foram corados com NeuN, um marcador neuro-específico. Os painéis à direita são uma imagem mesclada dos painéis GCaMP6s e NeuN. A barra de escala no primeiro painel é a mesma para todos os painéis subsequentes. O gráfico à direita é um gráfico da expressão de GCaMP6s (média ± MEV) como uma porcentagem do número total de neurônios por fatia por animal, onde os pontos individuais são os dados para cada animal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Localização do gânglio trigeminal (TG), nervo infraorbital (ION) e área da face (coxim vibrissal) estimulados. (A) O prosencéfalo foi removido para permitir o acesso ao GT. (B) Área da face em que foram aplicados estímulos naturais em relação ao ION e TG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Aumento evocado por estímulo na fluorescência do GCaMP6s. (A) Campo visual total sob aumento de 20x. As divisões oftálmica (V1) e maxilar (V2) do GT estão indicadas. (B,C) A região da caixa é mostrada nos painéis B e C, que são imagens de fluorescência antes e após a estimulação com escova do coxim vibrissal, respectivamente. Círculos brancos são regiões de interesse comparadoras. Os neurônios foram considerados responsivos a um estímulo com base na mudança de pico de fluorescência observada nas regiões de interesse comparadoras descritas no texto. A barra de escala no primeiro painel é a mesma para ambos os painéis. (D) Alterações representativas na fluorescência dos neurônios mostrados em B e C em resposta a um estímulo de escova aplicado à face. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Classificação dos neurônios com base em sua resposta aos estímulos aplicados à face. Imagens representativas dos neurônios TG antes (painéis superiores - Baseline) e depois (painel médio - Estimulação) das respostas a uma escova de cabelo camelo de 1 cm (A - Brush), grade de 1 cm2 de monofilamentos (B - Punctate), aquecimento (C - Calor) e resfriamento (D - Frio) aplicados na mesma região da face. A barra de escala no primeiro painel é a mesma para todos os painéis subsequentes. Círculos alaranjados denotam um exemplo de neurônio responsivo. Círculos brancos são regiões de interesse comparadoras. (E-H) Traços representativos de cada resposta por estímulo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A lesão nervosa aumenta as respostas evocadas pelo pincel nos neurônios TG. Respostas típicas dos neurônios TG ao escovado aplicado duas vezes na face do rato no lado contralateral a uma lesão de constrição crônica do nervo infraorbital (A, Contra) ou no lado ipsilateral à lesão nervosa (B, Ipsi). (C) A análise de dados agrupados de neurônios responsivos de seis ratos (os dados plotados são por rato) confirmou que a diferença na magnitude da primeira resposta ao pincel foi significativa (teste t pareado). (D) Quando o pico de resposta ao primeiro e segundo estímulo foi analisado como uma razão (R2/R1), a análise dos dados agrupados confirmou que o aumento da razão de resposta no lado lesado do nervo foi significativo. ** p < 0,01 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Bloqueio da atividade evocada em neurônios TG com tetrodotoxina (TTX). (A) Dados de fluorescência de neurônios TG ipsilaterais a uma lesão nervosa após injeção de TTX (200 μL, 1 μM) adjacente ao nervo infraorbital após aplicação de um estímulo em escova (barra azul). (B) Dados de pico de resposta agrupados de três ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dr. Gold estava recebendo apoio financeiro de Grunenthal durante o desenvolvimento desta preparação. Não houve sobreposição no foco do estudo de Grunenthal e na preparação descrita neste manuscrito. Nenhum dos outros autores tem qualquer outro potencial conflito de interesses a revelar.