Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.
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Artigo de método
In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) permitem técnicas de imagem para monitorar mudanças no cálcio intracelular em populações-alvo de células-alvo. Sua grande relação sinal-ruído faz dos GECIs uma ferramenta poderosa para detectar a atividade evocada por estímulo em neurônios sensoriais. Os GECIs facilitam a análise em nível populacional da codificação de estímulos com o número de neurônios que podem ser estudados simultaneamente. Essa codificação populacional é mais apropriadamente feita in vivo. Os gânglios da raiz dorsal (DRG), que abrigam a soma de neurônios sensoriais que inervam estruturas somáticas e viscerais abaixo do pescoço, são usados mais extensivamente para imagens in vivo porque essas estruturas são acessadas com relativa facilidade. Mais recentemente, esta técnica foi utilizada em camundongos para estudar neurônios sensoriais no gânglio trigeminal (GT) que inervam estruturas orais e craniofaciais. Existem muitas razões para estudar TG além da DRG, incluindo a longa lista de síndromes dolorosas específicas para estruturas orais e craniofaciais que parecem refletir alterações na atividade dos neurônios sensoriais, como a neuralgia do trigêmeo. Camundongos são usados mais extensivamente no estudo de neurônios DRG e TG devido à disponibilidade de ferramentas genéticas. No entanto, com diferenças de tamanho, facilidade de manuseio e diferenças de espécies potencialmente importantes, há razões para estudar neurônios TG de ratos em vez de camundongos. Assim, desenvolvemos uma abordagem para obtenção de imagens de neurônios TG de ratos in vivo. Injetamos filhotes neonatais (p2) por via intraperitoneal com um AAV que codifica GCaMP6s, resultando em >90% de infecção dos neurônios TG e DRG. TG foi visualizado no adulto após craniotomia e decorticação, e mudanças na fluorescência de GCaMP6s foram monitoradas em neurônios TG após estimulação das regiões mandibular e maxilar da face. Confirmamos que aumentos na fluorescência foram evocados por estímulo com bloqueio de nervo periférico. Embora essa abordagem tenha muitos usos potenciais, estamos usando-a para caracterizar a(s) subpopulação(ões) de neurônios TG alterados após lesão de nervo periférico.
Introdução
A somatosensação, codificação neural de estímulos mecânicos, térmicos e químicos que incidem sobre a pele ou outras estruturas corporais, incluindo músculos, ossos e vísceras, inicia-se com a atividade em neurônios aferentes primários que inervam essas estruturas1. Abordagens eletrofisiológicas baseadas em unidades únicas têm fornecido uma riqueza de informações sobre os subtipos aferentes envolvidos nesse processo, bem como como suas propriedades estímulo-resposta podem mudar ao longo do tempo 1,2,3. No entanto, embora ainda existam fortes evidências ....
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo o uso de animais em pesquisa foram realizados de acordo com as normas estabelecidas pelo National Institutes of Health e pela International Association for the Study of Pain e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh (protocolo #22051100). Ao final de cada experimento, os ratos foram eutanasiados via exanguinação com perfusão cardíaca de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS), uma abordagem aprovada pela Associação Médica Veterinária Americana e pela IACUC da Universidade de Pittsburgh.
1. Indução do GCaMP
- Encom....
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Resultados
Como já tivemos sucesso com o sorotipo AAV9 para a infecção de neurônios sensoriais deratos15, usamos esse sorotipo para a expressão de GCaMP6s em neurônios TG de ratos. Portanto, primeiramente procuramos avaliar a eficiência da infecção de neurônios sensoriais de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando este vírus foi administrado a filhotes de ratosneonatais20. Este vírus utiliza o promotor CAG, que dirige e mantém altos níveis de expressão gênica. Além disso, foi d.......
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Discussão
Aqui, demonstramos uma maneira rápida e não invasiva de gerar um rato GECI para obtenção de imagens do TG. Escolhemos um promotor CAG para conduzir e manter altos níveis de expressão gênica. Embora estudos anteriores sugiram que outros sorotipos de AAV podem conduzir eficientemente a expressão gênica em neurônios DRG39, nossos resultados são consistentes com um estudo recente envolvendo injeção intraperitoneal de AAV em neonatos32, indicando que o sorotipo AAV9 é altamente .......
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Divulgações
Dr. Gold estava recebendo apoio financeiro de Grunenthal durante o desenvolvimento desta preparação. Não houve sobreposição no foco do estudo de Grunenthal e na preparação descrita neste manuscrito. Nenhum dos outros autores tem qualquer outro potencial conflito de interesses a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos Drs. Kathy Albers e Brian Davis pelo uso de seu programa Leica Microscope and Metamorph, Charles Warwick por ajudar a construir nosso dispositivo térmico Peltier e Dr. Raymond Sekula por ajudar na solução de problemas da preparação cirúrgica. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) e R01NS122784 (MSG e RS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 | Addgene | 100844-AAV9 | AAV9-GCaMP6s |
| vírus ACEmaleato de promazina | Covetrus | 11695-0095-5 | 10 mg / mL |
| AnaSed (xilazina) injeção | AKORN Saúde Animal | 23076-35-9 | 20 mg / mL |
| CTR5500 Caixa de eletrônicos | Leica | 11 888 820 | Fonte de alimentação |
| Broca de rebarba de cutwell | Ransom & Randolph | ¼ redondo | |
| DM 6000 FS | Leica | 11 888 928 | Base Stand |
| EL6000 | Leica | EL6000 | Fonte de luz com lâmpada de mercúrio de 120 W |
| Fórceps | FST | 11252-00 | Dumont No. 05 |
| Friedman rongeurs | FST | 16000-14 | Tamanho do copo de 2,5 mm |
| Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16021-14 | 1 mm tamanho do copo |
| Almofada de aquecimento (Almofada de terapia de temperatura) | STRYKER | 8002-062-022 | |
| Cloridrato de cetamina | Covetrus | 1695-0703-1 | 100 mg/mL |
| Plan Fluor 20x/0.40 | Leica | MRH00105 | 20x objetiva, 0.4 NA10.8 mm WD |
| Caneta de cautério de alta temperatura com cabo de alimentação | Bovie | HIT1 | Caneta de cautério portátil Change-A-Tip |
| Prime 95B | Photometrics | Prime 95B | CMOS Câmera |
| Salina | Fisher Scientific | NC0291799 | 0,9% Lâmina de bisturi salino estéril |
| Fisher Scientific | 22-079-701 | tamanho 15 lâmina descartável | |
| Espátula | BRI | 48-1460 | espátula cerebral |
| Tesoura de mola | FST | 91500-09 | Student Vannas, tesoura de mola de ponta de 5 mm |
| FST | 15012-12 | Noyes, 14 mm de ponta | |
| STP6000 Painel de toque inteligente | Leica | 11 501 255 | Seringa de painel de controle |
| Hamilton | 80201 | 25 μ L Modelo 1702 Seringa de ponta Luer | |
| Aquecedor de água | Adroit | HTP-1500 |
Referências
- Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
- Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
- Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L.
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Reimpressões e permissões
