Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

استراتيجية البنوك الحيوية لعضويات سرطان المبيض: معالجة عدم التجانس بين المرضى عبر الأنواع الفرعية النسيجية ومراحل المرض

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/66467
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital, Ludwig-Maximilian-University (LMU) Munich, 2German Cancer Consortium (DKTK), Partner site Munich (LMU), a partnership between the German Cancer Research Center (DKFZ) and the University Hospital of LMU Munich
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا لإنشاء عضويات سرطان المبيض من مراحل المرض المختلفة ويعالج تحديات التباين الخاص بالمريض لزيادة الغلة وتمكين التوسع القوي على المدى الطويل للتطبيقات اللاحقة. يتضمن خطوات مفصلة لمعالجة الأنسجة ، والبذر ، وضبط متطلبات الوسائط ، وتلطيخ التألق المناعي.

Abstract

في حين أن إنشاء بنك حيوي لسرطان المبيض من المواد العضوية المشتقة من المريض جنبا إلى جنب مع معلومات الخلفية السريرية الخاصة بهم يعد بالتقدم في البحث ورعاية المرضى ، إلا أن التوحيد القياسي لا يزال يمثل تحديا بسبب عدم تجانس هذا الورم الخبيث القاتل ، جنبا إلى جنب مع التعقيد المتأصل في التكنولوجيا العضوية. يوفر هذا البروتوكول القابل للتكيف إطارا منهجيا لتحقيق الإمكانات الكاملة لعضويات سرطان المبيض مع الأخذ في الاعتبار التباين الخاص بالمريض للأسلاف. من خلال تنفيذ سير عمل تجريبي منظم لتحديد ظروف الاستزراع المثلى وطرق البذر ، مع الاختبار المتوازي للبذر ثلاثي الأبعاد المباشر مقابل مسار 2D / 3D ، نحصل ، في معظم الحالات ، على خطوط توسيع قوية طويلة الأجل مناسبة لمجموعة واسعة من تطبيقات المصب.

والجدير بالذكر أن البروتوكول قد تم اختباره وإثبات كفاءته في عدد كبير من الحالات (N = 120) من المواد الأولية غير المتجانسة للغاية ، بما في ذلك سرطان المبيض عالي الدرجة ومنخفض الدرجة ومراحل المرض مع إزالة الانتفاخ الأولية ، والمرض المتكرر ، والعينات الجراحية بعد النيو المساعدة. ضمن بيئة إشارات خارجية منخفضة Wnt و BMP عالية ، لاحظنا أن الأسلاف معرضون بشكل مختلف لتنشيط مسار Heregulin 1 ß (HERß-1) ، مع تعزيز HERß-1 لتشكيل الأعضاء في البعض بينما تثبيطه في البعض الآخر. بالنسبة لمجموعة فرعية من عينات المريض ، يستلزم التكوين العضوي الأمثل والنمو طويل الأجل إضافة عامل نمو الخلايا الليفية 10 و R-Spondin 1 إلى الوسط.

علاوة على ذلك ، نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة لهضم الأنسجة وعزل السلف ونشير إلى أمثلة حيث تكون الزراعة القصيرة في 2D على البلاستيك مفيدة لتشكيل عضوي لاحق في مصفوفة مستخلص الغشاء القاعدي من النوع 2. وبشكل عام، يتطلب البنك الحيوي الأمثل اختبارا منهجيا لجميع الظروف الرئيسية بالتوازي لتحديد بيئة نمو مناسبة للخطوط الفردية. يصف البروتوكول أيضا إجراء المناولة للتضمين والتقسيم والتلوين بكفاءة للحصول على صور عالية الدقة للمواد العضوية ، وهو أمر مطلوب للتنميط الظاهري الشامل.

Introduction

لا تزال الإدارة السريرية لمرضى سرطان المبيض الظهاري صعبة بسبب عرضه السريري غير المتجانس في المراحل المتقدمة ومعدلات التكرار العالية1. يتطلب تحسين فهمنا لتطور سرطان المبيض والسلوك البيولوجي مناهج بحثية تعالج التباين الخاص بالمريض أثناء مسار المرض ، والاستجابة للعلاج ، والسمات النسيجية المرضية وكذلك الجزيئية2.

إن البنوك الحيوية، التي تتميز بالجمع المنهجي والحفظ طويل الأجل لعينات الورم المشتقة من مرضى سرطان المبيض جنبا إلى جنب مع معلوماتهم السريرية، توفر الحفاظ على مجموعة كبيرة من المرضى في مراحل المرض المختلفة، بما في ذلك عينات الورم من جراحات إزالة الانتفاخ الأولية، وبعد العلاج الكيميائي المساعد الجديد ومن الأمراض المتكررة. إنه يحمل إمكانات قيمة للنهوض بأبحاث السرطان بمثابة مورد للمؤشرات الحيوية الواعدة والأهداف العلاجية3. ومع ذلك ، فإن طرق البنوك الحيوية التقليدية ، مثل تثبيت الفورمالين والتجميد ، ليست قابلة لإجراء دراسات وظيفية على عينات الورم الأصلية بسبب فقدان الصلاحية وتعطيل بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد الأصلية 4,5.

تعتمد دراسات الآليات الجزيئية ، في علم الأورام وما بعده ، بشكل حاسم على استخدام النماذج التجريبية المناسبة التي تعكس بأمانة بيولوجيا المرض وتحافظ على الخصائص المختبرية للأنسجة التي لوحظت في الجسم الحي. تقوم الكائنات العضوية المشتقة من المريض ، بناء على الحفاظ على إمكانات التجديد ، بإعادة إنتاج الهيكل الأصلي للظهارة ووظيفتها في المختبر وتسمح بالاختبار في سياق خاص بالمريض. لذلك ، فقد برزت كأدوات واعدة للغاية لأبحاث السرطان والطب الشخصي ، وسد الفجوة بين التنوع السريري والبحوث المختبرية6،7،8،9. يمكن تطبيق الاستراتيجيات العلاجية المصممة خصيصا بناء على الاستجابات الدوائية الفردية للخطوط العضوية واختبار الأهمية الوظيفية للملامح الجزيئية مباشرة على رعاية المرضى10,11. إن إمكانية الزراعة طويلة الأجل بما في ذلك الخصائص الخاصة بالمريض وجمع البيانات السريرية المستقبلية ذات الصلة بمرور الوقت تبشر بخير كبير لتحديد العوامل النذير والتنبؤية الجديدة التي ينطوي عليها تطور المرض وآليات المقاومة 3,9.

ومع ذلك ، فإن بناء بنك حيوي يتضمن عضويات من عينات أورام مختلفة يتطلب مزيجا من الالتزام الصارم بالمنهجية المعقدة ووضع بروتوكولات لسهولة الصيانة12. يضمن توحيد العمليات إمكانية إنشاء البنك الحيوي وصيانته بكفاءة من قبل موظفين مدربين حتى في حالة الدوران المرتفع ، مع الالتزام في نفس الوقت بأعلى معايير الجودة13. أفادت العديد من الدراسات عن الجيل الناجح من الخطوط العضوية المستقرة لسرطان المبيض المقابلة للملف الطفري والظاهري للورم الأصلي بمعدلات كفاءة متفاوتة. ومع ذلك ، لا تزال البنوك الحيوية الروتينية تمثل تحديا في الممارسة العملية ، لا سيما بالنسبة للنمو المستقر طويل الأجل للخطوط ، وهو شرط أساسي للتوسع على نطاق واسع أو التحرير الجينومي الناجح.

على وجه الخصوص ، لا تزال مسألة قابلية التوسع معرفة غامضة في هذا المجال حيث يتم أحيانا احتساب المواد العضوية التي تظهر إمكانات نمو بطيئة ومحدودة كخطوط ثابتة. كما أوضح في البداية هوفمان وآخرون ، وهي دراسة وفرت نتائجها الرئيسية الأساس لهذا البروتوكول الأكثر تطورا ، فإن المعالجة المثلى لأنسجة سرطان المبيض تتطلب استراتيجية فريدة لاستيعاب عدم التجانس14. تم تأكيد التوصيف الظاهري للعضويات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة والتشابه الوثيق مع أنسجة الورم الأبوي من خلال تسلسل الحمض النووي للوحة وتحليل النسخ للثقافات الناضجة (4-10 أشهر من الزراعة) مما يدل على استقرار النموذج8،9،12،14.

على النقيض من بيئة paracrine التي تنظم التوازن في قناة فالوب الصحية ، فإن الطبقة الظهارية ، التي من المحتمل أن تنتج سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) ، وإمكانية تجديد السرطان ، وقدرة تكوين الأعضاء ، أقل اعتمادا على مكملات Wnt الخارجية. علاوة على ذلك ، أثبتت إشارات البروتين المورفولوجي النشط للعظام (BMP) ، والتي تتميز بغياب Noggin في الوسط العضوي ، أنها مفيدة لإنشاء ثقافات طويلة الأجل من رواسب الأنسجة الصلبة لسرطان المبيض14,15. خلال البنوك الحيوية المنهجية للرواسب الصلبة لسرطان المبيض ، أكدنا هذه النتائج وأنشأنا خط الأنابيب ، مع التفاصيل الموضحة في هذا البروتوكول الذي يضمن التوسع المستدام على المدى الطويل في معظم الحالات. نجد أن الاختبار المتوازي لتركيبات الوسائط المختلفة وطرائق البذر عند العمل مع العزلات الأولية ضروري لتحسين إنشاء خطوط عضوية مستقرة طويلة الأجل وزيادة الغلة مما يتيح انتشارا قويا وتوسعا إلى تنسيقات الآبار المتعددة المطلوبة للتجارب النهائية16.

علاوة على ذلك ، فإن نقاء وجودة العينات التي تم جمعها أثناء الجراحة لهما أهمية حاسمة للإمكانات الانتقالية لعضويات سرطان المبيض في الأبحاث الأساسية والتشخيص الجزيئي. يتطلب تعقيد العرض السريري ل HGSOC تعاونا وثيقا بين الجراحين وأطباء الأورام والعلماء في المختبر لضمان تحديد المواد ذات الصلة بشكل صحيح ، والحفاظ على ظروف النقل ثابتة ، ويتم إنشاء خطوط عضوية بكفاءة عالية تمثل أهم خصائص مرض كل مريض. يوفر هذا البروتوكول إطارا موحدا ولكنه قابل للتكيف لالتقاط الإمكانات الكاملة لعضويات سرطان المبيض ، مع الأخذ في الاعتبار عدم التجانس الذي يميز سرطان المبيض16,17. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يتيح البنوك الحيوية الموثوقة لمجموعة واسعة من العرض السريري لسرطان المبيض ، بما في ذلك الأنواع النسيجية المختلفة (سرطان المبيض عالي الدرجة ومنخفض الدرجة ، LGSOC) ، ورواسب مختلفة من نفس المرضى الذين يظهرون اختلافات في تنظيم الجذعية ، والأنسجة من العمليات الجراحية في إعداد ما بعد المساعد الجديد ، ومواد الخزعة ، وعينات من العمليات الجراحية في المرحلة المتكررة من تطور المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم جمع عينات أنسجة الورم من جراحات سرطان المبيض وتم إنشاء عضويات مشتقة من المريض وفقا للجنة الأخلاقيات بجامعة LMU (17-471) ، مع الالتزام باللوائح الحالية المعمول بها في الاتحاد الأوروبي والوطنية والمحلية. وافق كل مريض مشارك في الدراسة في شكل مكتوب. عند العمل مع عينات الأنسجة الطازجة ، يلزم الحصول على إذن أمان من المستوى 2 للسلامة البيولوجية وخزانات التدفق الصفحي. ونظرا للطبيعة المعدية المحتملة لعينات الأنسجة، التي لا يمكن استبعادها بسبب عدم وجود اختبارات روتينية للأمراض المعدية ذات الصلة، فمن الضروري ضمان التقيد الصارم بلوائح السلامة البيولوجية المؤسسية وتوافر معدات الحماية الشخصية الكافية للموظفين الذين يجرون التجارب.

1. الاستعدادات

  1. إعداد متوسطة
    1. قم بإعداد وسائط 2D و 3D طازجة مرة واحدة في الأسبوع وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم سرد التركيب الدقيق للمكونات لكل وسيط في الجدول 1. يمكن استكمال كل من وسط سرطان المبيض 1 (OCM1) و OCM2 بالإضافة إلى HER1ß (التركيز النهائي: 50 نانوغرام / مل) ، مما يؤدي إلى أربع حالات مختلفة: OCM1 ، OCM1 + HER1ß ، OCM2 ، OCM2 + HER1ß.
    2. إنشاء حلول مخزون من كواشف عامل النمو والاحتفاظ بها عند 20 درجة مئوية و A83-01 ونيكوتيناميد (التخزين عند +4 درجة مئوية). نظرا لحساسية عوامل النمو لدرجة الحرارة ، استخدم محاليل المخزون المذاب على الفور للتحضير المتوسط وتجنب دورات الذوبان المتكررة عن طريق إنشاء قسامة.
      ملاحظة: يعد إعداد وسائل الإعلام خطوة حاسمة تحتاج إلى رقابة صارمة.
    3. إعداد الوسط المشروط RSPO-1
      1. قم بإذابة الخلايا التائية HA-R-Spondin1-Fc 293 (التخزين عند -80 درجة مئوية) بسرعة عند 37 درجة مئوية. اغسلها ب 10 مل من وسط الاستزراع القاعدي ، مع استكمال 10٪ مصل عجل الجنين (FCS) ، ويشار إليه من الآن فصاعدا باسم وسط الثقافة القاعدية ++.
      2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 12 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ وزرعها في دورق T75.
      3. تقسيم الخلايا بنسبة 1: 6 باستخدام كاشف تفكك يحتوي على التربسين (4 دقائق عند 37 درجة مئوية) عندما تصل الخلايا إلى التقاء. بذرها في قارورة T75 جديدة.
      4. في اليوم التالي ، أضف phleomycin D1 (1،25 ميكرولتر / مل) إلى الوسط.
      5. تقسيم الخلايا بنسبة 1:20 مع التربسين (4 دقائق عند 37 درجة مئوية) عندما تصل الخلايا إلى التقاء. قم بزرع الخلايا في قوارير T75 متعددة (عدد القوارير وفقا للحجم النهائي المستهدف) في 30 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ (يحتوي على 10٪ FCS) مع مكمل ب phleomycin D1.
      6. ابدأ إنتاج الوسائط المشروطة عندما تصل الخلايا إلى حوالي 50٪ من التقاء: استبدل الوسط ب 40 مل من وسط الثقافة القاعدية المكمل ب 5٪ FCS بدون phleomycin D1.
      7. جمع أول طاف بعد 3 أيام. لإزالة الحطام ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1200 × جم. احتفظ بالمادة الطافية في وعاء معقم عند 4 درجات مئوية.
      8. أضف وسط استزراع قاعدي جديد مكمل ب 5٪ FCS إلى الخلايا. جمع طاف الثاني بعد 3-4 أيام. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1200 × غرام. أضف الطافي الثاني إلى الطافي الأول.
      9. صفي الوسط المكيف باستخدام مرشح أعلى الزجاجة 0.2 ميكرومتر.
      10. لمراقبة الجودة والقياس الكمي RSPO1 ، أضف الوسط المنتج إلى خط خلية 293T (293T WntR ، 7xTcf-eGFP) 14 ، يتم تحويله بثبات باستخدام GFP-plasmid الذي يحمل مراسل Wnt18.
        ملاحظة: اعتمادا على كمية وشدة إشارة GFP ، يتم اختبار نشاط RSPO1 كناهض لمسار Wnt عن طريق القياس الكمي لخط خلية مراسل Wnt.
      11. احتفظ بقسمة 15 مل للاستخدام الفوري (في غضون أسبوع واحد) عند 4 درجات مئوية. لتخزين أطول (6 أشهر) احتفظ بالوسط المكيف عند -20 درجة مئوية.

2. بدء ثقافة عضوية سرطان المبيض

  1. عزل الأنسجة الأولية
    1. نقل الأنسجة الطازجة والقابلة للحياة ويفضل مباشرة بعد الجراحة وإجراء العزل في غضون 20 ساعة كحد أقصى بعد جمعها. تأكد من حالة النقل المناسبة في وسط جمع الأنسجة باستخدام صندوق نقل مجهز بكمادات باردة عند حوالي 4 درجات مئوية.
    2. في المختبر ، قم بإعداد الكواشف والمعدات اللازمة لتسهيل معالجة العينات في الوقت المناسب:
      1. مصفوفة مستخلص غشاء القاع من النوع الثاني (مصفوفة BME 2) على الجليد (حوالي 2 ساعة).
      2. قم بإعداد المشارط التي تستخدم لمرة واحدة ، وأدوات التشريح المعقمة (المقص والملاقط) ، وإدخالات مرشح بحجم 400 ميكرومتر لأنابيب 50 مل.
      3. قم بإعداد وعاء يحتوي على كمية صغيرة من النيتروجين السائل للتجميد المفاجئ وحمام مائي مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: العمل داخل غطاء التدفق الصفحي لزراعة الخلايا.
    3. اغسل المنديل الطازج في طبق بتري جيدا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (بدون Ca++ و Mg ++). داخل طبق بتري ، قم بتفتيت الأنسجة باستخدام المشارط و / أو المقص القابل للتصرف إلى قطع صغيرة بحجم 3-5 مم.
    4. افصل الأنسجة التي تم الحصول عليها إلى ثلاثة أقسام للأغراض التالية:
      1. جمع الأنسجة في الأنابيب المبردة. انقل الأنابيب المبردة إلى الحاوية المحضرة المملوءة بالنيتروجين السائل لتجميد الصدمات.
      2. جمع الأنسجة (2-3 مم) في حاوية عينات نسيجية مملوءة بالفورمالين للتثبيت (24 ساعة) وتضمينها في البارافين لأغراض تلطيخ19،20.
      3. علاوة على ذلك ، تجانس الأنسجة قبل الهضم الأنزيمي. تعظيم التفكك الميكانيكي بمشرط ونقله إلى أنبوب نسيج سعة 50 مل.
        ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة غارقة دائما في برنامج تلفزيوني أثناء التجانس لتجنب جفاف الأنسجة.
    5. الجمع بين الأنسجة المتجانسة مع خليط الهضم الذي يحتوي على PBS (بدون Ca ++ و Mg ++) ، كولاجيناز I (محلول مخزون 5 وحدة / ميكرولتر ، التركيز النهائي 1 وحدة / ميكرولتر) ، ومثبط انتقائي ROCK1 و 2 (تركيز نهائي 3 ميكرومتر) (المكونات المدرجة في الجدول 1). استخدم 15 مل من خليط الهضم في أنبوب سعة 50 مل لكل 2 سم3 من الورم.
      ملاحظة: تتطلب المواد المحدودة (مثل عينات الخزعة) كميات صغيرة فقط (حوالي 2-3 مل) من خليط الهضم لضمان التفكك الأنزيمي.
    6. للتفكك الأنزيمي ، احتضان الأنبوب لمدة 1.5 ساعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إجراء دوامة متقطعة وقوية (كل 20 دقيقة تقريبا لمدة 10-15 ثانية) لدعم التفكك الميكانيكي.
    7. بعد الحضانة ، أضف 15 مل من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++ إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق عند 300 × جم.
    8. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي الجديد ++. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مرشح 400 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل.
    9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. إزالة طاف والحفاظ على بيليه الخلية.
    10. لإزالة كريات الدم الحمراء ، أضف 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) إلى حبيبات الخلية. احتضان في حمام مائي لمدة 5 دقائق على 37 درجة مئوية.
    11. أضف 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ لتعطيل التحلل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. أضف 3 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ إلى حبيبات الخلية.
    12. عد الخلايا القابلة للحياة بعد تخفيف 1: 1 باستخدام محلول صبغة تريبان الزرقاء (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر من العينة + 10 ميكرولتر من محلول البقع الزرقاء تريبان) في عداد خلية أوتوماتيكي أو يدويا في غرفة نيوباور.
    13. حساب عدد الخلايا اللازمة للبذر 3D المباشر. لكل رواسب الورم ، قم بالبذور في صفيحة مكونة من 48 بئرا على الأقل 2-3 آبار لكل وسط سرطان المبيض ، وهو ما يتوافق مع إجمالي 8-12 بئرا في مصفوفة البذر (OCM1 ، OCM1 + HER1ß ، OCM2 ، OCM2 + HER1ß). احسب 30000 خلية لكل بئر في قطرة 25 ميكرولتر من مصفوفة BME Type 2. اختياريا ، اختر تنسيق 24 بئرا مع 50 ميكرولتر من مصفوفة BME 2 و 50000 خلية مصنفة لكل بئر.
    14. قم بزرع الخلايا المتبقية في 2D (انظر الخطوة 2.1.13).
    15. ماصة كمية تعليق وسط الثقافة القاعدية ++ الذي يحتوي على العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة في أنبوب جديد وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. إزالة طاف والحفاظ على بيليه الخلية.
    16. على الجليد ، أضف الكمية الإجمالية من مصفوفة BME 2 الباردة (25 ميكرولتر لكل بئر في لوحة تنسيق 48 بئرا ؛ وبالتالي ، 100 ميكرولتر ل 4 آبار) إلى الحبيبات واخلطها جيدا لتحقيق توزيع متساو للخلايا لكل بئر عن طريق سحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل دون إنشاء فقاعات.
    17. قم بزرع الخلايا في قطرات من مصفوفة BME 2 (25 ميكرولتر) إلى لوحة 48 بئر الفارغة المدفأة مسبقا. لتحقيق توزيع متساو بين الآبار ، حرك الماصة برفق وببطء لأعلى ولأسفل (3-4x) داخل الأنبوب قبل نقل قطرة مصفوفة BME 2 إلى كل بئر لمنع ترسيب الخلية أثناء التوزيع.
    18. بعد احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لدمج قطرات مصفوفة BME 2 ، ماصة 250 ميكرولتر لكل من وسائط سرطان المبيض الأربعة (OCM1 ، OCM1 + HER1ß ، OCM2 ، OCM2 + HER1ß) في الآبار المقابلة.
    19. بالتوازي مع إجراء البذر المباشر 3D ، حافظ على الخلايا المعزولة المتبقية عن طريق بدء ثقافة 2D.
      1. بعد الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، أضف الحبيبات إلى وسيط 2D. حدد التنسيق (قارورة T75 أو قارورة T25) ، اعتمادا على عدد الخلايا المتاحة بعد البذر ثلاثي الأبعاد.
      2. احتضان القارورة لمدة 3-5 أيام عند 37 درجة مئوية للتصاق الخلايا. احتفظ بنفس الوسط لأول 72 ساعة.
      3. عندما تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، انقل الثقافة إلى مصفوفة BME 2. لا تقم بتوسيع العزلات الأولية في ثقافة 2D عن طريق الانقسام لأن الانتشار طويل المدى على 2D يضر بإمكانية الجذعية.
  2. نقل من ثقافة 2D إلى ثقافة 3D
    1. في قارورة T75 أو T25 ، اغسل الطبقة الأحادية 2x ب 5 مل من PBS لفصل الخلايا عن السطح السفلي. احتضان مع 1 مل من التربسين لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++ لتعطيل كاشف التفكك. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام.
    3. أضف 3 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ إلى الحبيبات. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1.12-2.1.13. بذرة لتركيبات الوسائط المختلفة (انظر الشكل 1) كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.18.
  3. تقييم النمو العضوي
    1. صور الآبار مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتوثيق نمو المواد العضوية. اصنع صورا قابلة للمقارنة عالية الجودة لثقافة 2D / 3D وألواح البذر المباشر بواسطة مجهر تباين الطور. احرص على الاتساق في التكبير واستخدم 4x للحصول على نظرة عامة على الآبار (القياس الكمي) و 10x و 20x لتوثيق مورفولوجيا الكائنات العضوية.
    2. تنظيم تخزين الصور في مجلدات مخصصة للخطوط الفردية.
    3. اختر أفضل خط عضوي للزراعة طويلة الأجل من خلال التقييم المقارن لتكوين الأعضاء في طرق البذر المختلفة (2D متبوعا بالبذر ثلاثي الأبعاد مقابل البذر ثلاثي الأبعاد المباشر) وتركيبات الوسائط المختلفة (OCM1 و OCM1 + HER1ß و OCM2 و OCM2 + HER1ß).
      1. في المتوسط ، بعد 14-21 يوما من العزلة ، قم بتقييم إمكانات تكوين الأعضاء (الكمية) بالإضافة إلى الحجم والنمط الظاهري الخلوي للعضويات المزروعة في ظل ظروف مختلفة. ابحث عن الميزات التالية: عدم وجود فجوات ، أو فحم الغشاء أو فقدان الالتصاق ، وتقريب الخلايا.

3. زراعة العضوية على المدى الطويل

  1. المرور العضوي
    1. تجنب تقسيم المواد العضوية بشكل متكرر وأثناء المرحلة التكاثرية. إجراء إجراءات الهضم الميكانيكية والأنزيمية مع فترات تزيد عن 10 أيام.
    2. لتعطيل كل قطرة مصفوفة BME 2 ، أضف 250 ميكرولتر (تنسيق 48 بئرا) أو 500 ميكرولتر (تنسيق 24 بئرا) من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++. تأكد من الذوبان الكامل للقطرة والماصة بشكل متقطع لأعلى ولأسفل وكشط الجزء السفلي من اللوحة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وضعه على الثلج. أضف 1 مل من وسط الاستزراع القاعدي المثلج ++.
      ملاحظة: تعتمد كفاءة إزالة مصفوفة BME 2 بشدة على درجة الحرارة المتوسطة حيث يتم تحقيق أفضل ذوبان أقل من 4 درجات مئوية.
    3. تجمع 2-3 آبار تقنية مكررة للتوسع المتساوي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. افحص محتوى التعليق مقابل مصدر الضوء لمعرفة ما إذا كان جل BME 2 لا يزال مرئيا. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الغسيل بوسط بارد إذا كانت مصفوفة BME 2 لا تزال مرئية.
    4. احتضان مع 1 مل من التربسين (المخزنة في 20-25 درجة مئوية) في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7-10 دقائق. دوامة بشكل متقطع لمدة 10 ثوان لتعزيز التفكك. افحص الأنبوب بشكل دوري بصريا لمعرفة ما إذا كان التفكك يتقدم.
    5. اسحب تعليق الخلية لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة من خلال إبرة بحجم يتراوح من 23 جم إلى 27 جم. تحقق مما إذا كانت كتل الخلايا الكبيرة لا تزال موجودة وكرر الإجراء إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: التجزئة من خلال حقنة اختيارية ، ويعتمد حجم الإبرة على فعالية التفكك المطلوبة. يؤدي تعليق الخلية المتجانس إلى التوزيع المتساوي بين الآبار.
    6. أضف 1 مل من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++ لتعطيل التفاعل.
    7. اختياري: عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1.12-2.1.13 وحدد نسبة الانقسام إلى الممر الأبوي (على سبيل المثال ، 1: 3 آبار).
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. إزالة الطاف.
    9. إجراء البذر كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.18 وتطبيق الوسط العضوي الأمثل لسرطان المبيض وفقا للثقافة طويلة الأجل القائمة بالفعل. تغيير وسط سرطان المبيض كل 3-4 أيام.
    10. في حالة تعطل قطرة مصفوفة BME 2 أثناء التغيير المتوسط ، فكر في إعادة البذر دون هضم إنزيمي. لتجنب تعطيل القطرة ، قم بإجراء إجراء التغيير الوسيط بعناية دون سحب مباشر على قطرة مصفوفة BME 2. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب ترك كمية زائدة من وسط الاستزراع القاعدي المتبقي ++ على الحبيبات قبل التخفيف باستخدام مصفوفة BME 2 في الخطوة 2.1.16 لأنها قد تؤثر على هشاشة القطرات.
  2. الحفظ بالتبريد للمواد العضوية
    ملاحظة: إجراء الحفظ بالتبريد للعضويات أثناء مرحلة الانتشار في الأسبوع الأول بعد المرور.
    1. قم بتعطيل قطرة مصفوفة BME 2 باستخدام وسط الاستزراع القاعدي البارد المثلج ++ وفقا للخطوة 3.1.2. بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 3.1.3 ، اعمل على الثلج وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد المثلج. انقل معلق الخلية إلى أنابيب مبردة سعة 1.8 مل محددة مسبقا.
    2. قم بتخزين الأنابيب في حاوية تجميد تحتوي على كحول الأيزوبروبيل مبرد مسبقا وضعها في -80 درجة مئوية طوال الليل.
    3. الحفاظ على أنابيب الأسهم في -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 أشهر. نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين مستقر على المدى الطويل.
  3. ذوبان المخزونات العضوية
    1. قم بتسخين 9 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية في أنبوب مكتوب عليه 15 مل.
    2. انقل قارورة المخزون المطلوبة من التخزين عند -80 درجة مئوية أو إلى النيتروجين السائل إلى حاوية نقل مملوءة بالنيتروجين السائل.
    3. انقل أنبوب التبريد إلى حمام مائي عند 37 درجة مئوية وحركه برفق حتى تبدأ المادة المجمدة بالقرب من جدران الأنبوب في الذوبان.
    4. وزع المعلق العضوي ببطء في الأنبوب المسمى المملوء ب 9 مل من الوسط. هز الأنبوب برفق. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام وإزالة الطاف.
    5. إجراء البذر كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.18 وتطبيق الوسط العضوي الأمثل لسرطان المبيض وفقا لظروف الاستزراع طويلة الأجل المحددة بالفعل للخط الفردي.
  4. تثبيت المواد العضوية
    1. قم بإجراء جمع المواد العضوية كما هو موضح في الخطوات 3.1.2-3.1.3.
    2. أضف 3 مل من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS (درجة الحموضة 7.4) واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل 2x ب 5 مل من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم ، وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 4 مل من برنامج تلفزيوني طازج إلى الحبيبات واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى التضمين.
      ملاحظة: المواد العضوية الثابتة مستقرة والتخزين عند 4 °C ممكن لمدة 1 شهر قبل التضمين.
    4. سخني الجل النسيجي (المخزن في -20 درجة مئوية) عند 65 درجة مئوية حتى يتم تسييله.
    5. كشف المواد العضوية الثابتة المستقرة والمرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة الطاف. في حالة تعطل حبيبات الخلية ، قم بإجراء الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم وتخلص من PBS الطاف.
    6. الحبيبات في 100 ميكرولتر من الجل الدافئ عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. انقل القطرة إلى قطعة من فيلم الختم واسمح بحدوث التصلب بعد ~ 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. انقل قطرة الهلام الثابتة إلى علبة البارافين النسيجية. إجراء بروتوكولات تضمين الأنسجة القياسية19،20.
    8. قطع شرائح بسمك 5-10 ميكرومتر باستخدام أداة قطع التقسيم المجهري. نقل التخفيضات على شرائح الأنسجة. تجفيف الشرائح لمدة 1 ساعة عند 65 درجة مئوية ؛ احتفظ بها في مكان جاف.
  5. تلطيخ المناعي للأقسام العضوية
    1. انقل الشرائح المعدة عبر صواني زجاجية بسلسلة التخفيف التالية: 2 × 15 دقيقة عامل مسح للأنسجة ؛ 15 دقيقة 100٪ إيثانول ؛ 1 دقيقة 100٪ إيثانول ؛ 10 دقيقة 96٪ إيثانول ؛ 5 دقائق 70٪ إيثانول ؛ 5 دقائق 50٪ إيثانول.
    2. أضف برنامج تلفزيوني واحتفظ ب 5 دقائق على الخلاط عند 100 دورة في الدقيقة. كرر الغسيل 2x.
    3. أضف محلول استرجاع المستضد (Tris (hydroxymethyl) aminomethane-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - المخزن المؤقت [pH 9.0] أو Citrate [pH 6.0]) إلى الشرائح الموضوعة في الغرفة القابلة للحرارة. في قدر بخاري ، احتفظ بالحاوية مع الشرائح لمدة 30 دقيقة ، تليها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. كرر الخطوة 3.5.2.
    5. انقل الحجرة التي تحتوي على الشرائح لمدة 15 دقيقة إلى محلول منظف نفاذية 1٪ (في PBS).
    6. كرر الخطوة 3.5.2.
    7. حدد موقع المواد العضوية على الشرائح باستخدام قلم شمعي مناعي للحفاظ على القطرة خلال الخطوات التالية.
    8. أضف على كل شريحة 100 ميكرولتر من مصل 10٪ في وسط تخفيف ، اعتمادا على أنواع الجسم المضاد الثانوي.
    9. كرر الخطوة 3.5.2.
    10. تمييع الأجسام المضادة الأولية في وسط ، مما يؤدي إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل في صينية الحضانة / غرفة الرطوبة.
    11. كرر الخطوة 3.5.2.
    12. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في وسط ، مما يؤدي إلى قطرات 100 ميكرولتر ، والاحتفاظ بها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في صينية الحضانة.
    13. كرر الخطوة 3.5.2.
    14. أضف محلول مضاد للبقع النووية DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dihydrochloride) المخفف في وسط تخفيف 1:1,000. يحفظ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحضانة.
    15. كرر الخطوة 3.5.2.
    16. أضف وسيط التثبيت وقم بتغطيته بغطاء الغطاء. ثبت الشرائح بطلاء أظافر شفاف بمجرد أن يجف (حوالي 8-12 ساعة).
    17. صورة مع مجهر متحد البؤر أو مجهر مضان آخر. قم بعمل صور عامة بالإضافة إلى صور مفصلة للهياكل تحت الخلوية التي تلتقط الخصائص الرئيسية لمورفولوجيا العضوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد تفكك الأنسجة الأولي ، والترشيح ، والعد ، يتم زرع الخلايا بالتوازي مباشرة في شكل 3D ، كما هو موضح أعلاه ، وكذلك التعليق في القارورة لتوسيع 2D وجيزة. في بعض الحالات ، يؤثر التوسع 2D العابر بشكل إيجابي على تكوين العضو العضوي ، ويتم إنشاء الخط طويل الأجل بنجاح عبر هذا المسار بينما يمكن أن يؤدي البذر ثلاثي الأبعاد المتوازي المقارن إلى توقف النمو (الشكل 1). لكل نسيج متبرع تتم معالجته ، يتم اختبار الخلايا وفقا لمصفوفة الوسائط. وباتباع هذه الاستراتيجية، يحتوي البنك الحيوي الخاص بنا الآن على خطوط تمثل كل حالة نمو قياسية كما هو موضح في الشكل 2. من خلال التنفيذ الصارم لمنصة الفحص المصغرة هذه لاختبار الوسائط المختلفة وطرق البذر ، نجحنا في إنشاء خطوط عضوية من أنواع نسيجية مختلفة ومراحل تطور مرض سرطان المبيض (الشكل 3) من العمليات الجراحية الأولية المصلية عالية الدرجة ، بعد الفاصل الزمني المساعد الجديد ومن الأمراض المتكررة. يوضح التوصيف الظاهري للخطوط العضوية عن طريق تلطيخ التألق المناعي للعلامات الرئيسية مقارنة بالأنسجة الأبوية بشكل مقنع أن السمات المميزة لحجرة الورم الظهارية محفوظة في النموذج العضوي: العمارة الظهارية والالتصاق المميز ب (EpCAM) ، وهوية النسب (PAX8) ، وخاصية طفرة نقطة TP53 النموذجية ل HGSOC مما يؤدي إلى التراكم في النواة (الشكل 4).

كما يجب النظر في بعض النقاط المنهجية المهمة لاتخاذ القرارات بكفاءة أثناء البنوك الحيوية العضوية. لا يتم تحديد إمكانات النمو العضوي فقط من خلال الزيادة في قطر العضوي. بالإضافة إلى ذلك ، تحدد خصائص النمط الظاهري إمكانات التمدد مثل اللون والظلام وسلامة الكنتور. يشير تكوين فجوات الإجهاد السيتوبلازمي إلى ظروف دون المستوى الأمثل. قد تحدث المشكلات الأولية فيما يتعلق بالنمو وإمكانية تكوين الأعضاء بسبب ظروف النقل غير المناسبة وتأخير عملية الأنسجة. نظرا لملاحظة تباين كبير بين الأفراد في إمكانات التوسع داخل خطوط الورم ، نوصي بالانتظار لمدة 14 يوما على الأقل قبل اتخاذ قرار نهائي بشأن إمكانات النمو. إذا لوحظت أنماط نمو مماثلة في البداية في وسائط مختلفة ، فيجب توسيع ظروف متعددة. من تجربتنا ، غالبا ما يكون التمييز الواضح لإمكانات النمو المستقر على المدى الطويل ممكنا فقط بعد الزراعة لعدة أسابيع أو أشهر.

Figure 1
الشكل 1: فوائد البذر الموجز في 2D للعزلات الأولية لتوليد الأعضاء اللاحقة. (أ) مخطط التخطيط التجريبي الذي يوضح استراتيجية البذر المتوازي ثنائية الاتجاه: 2D / 3D ، والبذر ثلاثي الأبعاد المباشر في أربعة وسائط مختلفة. (ب) صورة للعزلات الأولية الملتصقة قبل التربسين ونقل 3D. (ج) مثال على الرواسب الأولية حيث كشف البذر المتوازي عن الميزة الواضحة لمسار 2D / 3D حيث كان التوسع العضوي طويل الأجل ممكنا فقط من السلف التي تم عزلها في البداية على البلاستيك. تظهر الصورة العلوية اليسرى ثقافة ثلاثية الأبعاد بعد 7 أيام من العزلة عند الممر 0 (يشار إليه باسم P0) مع عدم كفاية تكوين الأعضاء بعد المقطع الأول (المشار إليه باسم P1) في الصورة اليسرى السفلية. بعد البذر ثنائي الأبعاد على البلاستيك (راجع الشكل 1B) متبوعا بالنقل إلى ثقافة ثلاثية الأبعاد ، يظهر بالفعل تكوين عضوي أفضل عند P0 ، بينما يتم تأكيد إمكانات التوسع على المدى الطويل عند الممر 4 (P4). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المتطلبات المتوسطة الخاصة بالمريض. أمثلة على أربعة خطوط موسعة مستقرة طويلة الأجل ينمو كل منها في وسط مختلف. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الاختصارات: OCM = وسط سرطان المبيض. لها = هيرجولين 1β ؛ HGSO = سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توليد عضوي من جميع مراحل المرض. صور لخطوط تمدد مستقرة طويلة الأجل ، من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة ومنخفض الدرجة في عرض المرض الأولي ، من الجراحة الفاصلة (العلاج الكيميائي المساعد الجديد) ، ومن الأنسجة السرطانية المتكررة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الاختصارات: HGSOC = سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة. LGSOC = سرطان المبيض المصلي منخفض الدرجة ؛ NACT = العلاج الكيميائي المساعد الجديد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تطابق وثيق بين النمط الظاهري للعضويات وأنسجة سرطان الوالدين. تظهر الصور متحدة البؤر لتلطيخ التألق المناعي للأنسجة السرطانية (A) والخط العضوي المزدوج (B) تشابها كبيرا جدا في نمط التلوين ومستوى التعبير لجميع العلامات ، EpCAM (أخضر) ، PAX8 (أحمر) ، TP53 (أرجواني). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تركيب خليط الوسائط والهضم المستخدم في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعالج البروتوكول المصمم التحديات السابقة للبنوك الحيوية العضوية لسرطان المبيض فيما يتعلق بتكوين الأعضاء وإمكانية المرور على المدى الطويل ويضمن توليد خطوط قابلة للتوسيع بالكامل من غالبية رواسب الورم الصلبة. تؤثر عملية الجمع الجراحي لعينات الورم لاستخدامها في توليد المواد العضوية بشكل كبير على العائد وإمكانية التوسع. يمكن الحصول على عينات من أنسجة الورم خلال إجراءات مختلفة ، بما في ذلك الجراحة متعددة الحشوية أو تنظير البطن التشخيصي أو الخزعة. يجب على جراح الأورام النسائية المتمرس إعطاء الأولوية للحصول على عينات ورم نظيفة من المواقع البريتونية. والجدير بالذكر أنه لوحظ أن المناطق الميتة المجهرية داخل رواسب الورم الكبيرة أقل ملاءمة للجيل الناجح من الثقافات العضوية. وبما أن نقاء العينة أمر بالغ الأهمية لعكس الخصائص الجزيئية والظاهرية للتطبيقات النهائية، فإن الجهود المتزامنة لكل من الفرق السريرية والمختبرية مطلوبة للبنوك الحيوية المثلى، مما يضمن إنشاء الخطوط من المناطق الأكثر صلة بالورم.

في حين أن هذا البروتوكول يغطي الاختلافات في تبعيات عامل النمو التي لاحظناها خلال عامين من البنوك الحيوية ، فمن الواضح أن هناك ما يبرر تحسينا إضافيا لزيادة الفعالية لأننا ما زلنا لم نلاحظ أي نمو عضوي في 20٪ من الحالات وعدد الخطوط التي أظهرت إمكانات توسع محدودة اقترح صيانة دون المستوى الأمثل للجذع. على الرغم من أن البنك الحيوي العضوي لدينا لا يتضمن حاليا سوى عينات سرطان المبيض من الأنسجة المصلية (HGSOC و LGSOC) ، إلا أن تجربتنا مع عينات من أنسجة سرطان المبيض الظهارية المختلفة قبل برنامج البنوك الحيوية المنظم أظهرت معدلات نجاح مماثلة دون اختلافات محددة. والجدير بالذكر أن غالبية الأنواع الفرعية لسرطان المبيض الظهاري تشترك في مورفولوجيا طبقية زائفة عمودية مماثلة مع الأنسجة التي تطورت من قناة مولر (قناة فالوب والرحم وعنق الرحم) بينما في المقابل ، تنشأ ظهارة المبيض نفسها من الناحية التنموية من التلال التناسلية والميزونيفروس ، حيث يتم تغطيتها بطبقة واحدة من ظهارة مكعبة. نظرا لأن المسارات التنموية التي تنظم التوازن الظهاري لها دور مركزي في التحكم في إمكانات الخلايا الجذعية البالغة ، يجب أن تؤخذ الاختلافات في الأصل الجنيني في الاعتبار عند تطوير بروتوكولات للبنوك الحيوية للعضويات. وبالتالي ، نعتقد أن الأسلاف من سطح المبيض من المحتمل أن تتطلب ظروف ثقافة خاصة بالأعضاء للحفاظ على نمو مستقر طويل الأجل.

والجدير بالذكر أنه في مختبرنا ، أثبت البروتوكول نجاحه أيضا لعينات سرطان المبيض بعد المساعد الجديد ، على الرغم من أن العلاج الكيميائي المساعد الجديد يؤثر على صلاحية الخلية والنمط الظاهري للأنسجة. تظهر هذه العينات المزيد من الحطام ومجاميع الأنسجة خارج الخلية مقارنة بالعينات المستمدة من الأنسجة الساذجة للعلاج الكيميائي لجراحات إزالة الانتفاخ الأولية التي يمكن أن تؤثر على إمكانات تكوين الأعضاء. في هذه الحالات ، اختبرنا أن كمية مناسبة من الأنسجة الجراحية والالتزام الصارم بظروف النقل الموصى بها أمران حاسمان لتوليد عضوي ناجح ، حيث قد تكون عينات ما بعد المساعد الجديد أكثر حساسية.

ظاهرة مثيرة للاهتمام للغاية للتأثير المفيد للتوسع القصير على البلاستيك في 2D من الأسلاف المعزولة حديثا على النمو العضوي اللاحق ، والتي لاحظناها مرارا وتكرارا وبالتالي تم تضمينها في الإجراء التجريبي الموحد ، هي إضافة مهمة إلى منهجية مجال أبحاث المواد العضوية السرطانية ، والتي تعتمد إلى حد كبير على استراتيجيات البذر المباشر. من المغري التكهن بأن حساسية السلف بعد الهضم الأنزيمي وقدرة عوامل النمو على تجهيزها بشكل كاف يمكن أن تكون الآليات الكامنة وراء هذا الاختلاف ، والذي يكون في بعض الحالات عاملا حاسما إذا كان من الممكن إنشاء الخط. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لإنشاء تبعيات واضحة.

في مواجهة التحديات التي يفرضها التصاق الخلايا العالية والوصلات الوظيفية في عضويات سرطان المبيض 3D ، والتي يصعب هضمها ، قد يساعد مزيج من التفكك الميكانيكي والأنزيمي مع الإبرة والمحاقن عندما تبقى كتل كبيرة بعد التربسين. يمكن أن تؤدي تجربة الظروف الأنزيمية المختلفة إلى مزيد من التحسينات.

بعد التخزين طويل الأجل ، يمكن إذابة الخطوط العضوية وإدخالها في الثقافة وفقا للتصميم التجريبي واستخدامها في التطبيقات اللاحقة. يتيح ذلك الوصول في أي وقت إلى خطوط عضوية تم إنشاؤها بالفعل لأغراض بحثية محددة وهو أمر مثير للاهتمام بشكل خاص للتحقيق في السلوك طويل المدى لخطوط معينة في ضوء تطور مرض المريض. ومع ذلك ، لا يزال الحفظ بالتبريد لعضويات سرطان المبيض يمثل تحديا. يمكن أن تؤثر التغيرات في درجات الحرارة أثناء دورات التجميد والذوبان سلبا على صلاحية العضوية ووظائفها وإمكانية التمدد. يكون التخزين طويل الأجل أكثر استقرارا في النيتروجين السائل ، حيث تقلل درجات الحرارة المنخفضة جدا من خطر التدهور بحيث يمكن الحفاظ على سلامة المواد العضوية. ومع ذلك ، فإن التحسين المستمر له ما يبرره لوضع إجراءات متسقة للتجميد والتخزين والذوبان ، لزيادة تحسين هذه العمليات.

على الرغم من المشكلات العالقة المذكورة ، يوضح هذا البروتوكول القدرة على توليد خطوط عضوية مستقرة باستمرار من عينات الورم الصلبة لمرضى سرطان المبيض. في مختبرنا ، قمنا بمعالجة 120 عينة من أنسجة سرطان المبيض الأولية حتى الآن لتحقيق النجاح في حوالي 50٪ من الحالات بما في ذلك مجموعة واسعة من الأنواع الفرعية النسيجية ومراحل المرض مع إزالة الانتفاخ الأولية والمرض المتكرر والعينات الجراحية بعد المساعد. من خلال توفير إطار منظم لتوليد المواد العضوية المشتقة من عينات مختلفة من المرضى ، والبذر المتوازي في وسائط مختلفة ، وتنفيذ استراتيجيات البذر المختلفة ، يوفر هذا البروتوكول فرصة لتقييم الاختلافات الفردية في إمكانات الجذعية ، وبالتالي توفير معلومات إضافية حول بيولوجيا الورم. على حد علمنا ، فإن الغالبية العظمى من الدراسات تتبع عادة النهج العكسي لاختبار المكونات المتوسطة على عدد صغير من العينات واختيار البساطة في الغالب وسيط واحد مثالي. يوضح اختبارنا المنهجي لتأثير HER1ß ، وتأثير مكملات RSPO1 و FGF10 ، والبذر 2D / 3D بشكل قاطع أن أنسجة سرطان المبيض لديها درجة من التباين بين المرضى في خصائص الجذعية ، والوسط الأمثل هو بالفعل خاص بالمريض. لذلك ، من الضروري إجراء اختبار متوازي منهجي لتركيبات الوسائط المختلفة التي توفر بيئات إشارات باراكرين خارجية مختلفة.

إن إنشاء بنك حيوي حي مع مجموعة واسعة من المواد العضوية المشتقة من مختلف مرضى سرطان المبيض جنبا إلى جنب مع المعلومات السريرية التي تم جمعها في المستقبل ، بمثابة مورد قيم لمجموعة واسعة من التطبيقات البحثية ويعكس المشهد السريري غير المتجانس الذي يمكن تطبيقه على عدد أكبر من المرضى17. تتيح الزراعة طويلة الأجل والحفظ بالتبريد الاتساق التجريبي وإمكانية الوصول المتكررة لنفس الخط العضوي بمرور الوقت ، حيث تعمل كقاعدة للتصميمات التجريبية الطولية ذات الخصائص الخلوية لخط الورم دون تغيير.

من خلال الاحتفاظ بالبنية الظهارية والاستقطاب ، تعد الخطوط العضوية نموذجا مناسبا لدراسة الاتصال بين الخلايا الخلوية واتخاذ القرارات المتعلقة بمصير الخلية المعتمدة على السياق بوساطة مسارات إشارات paracrine. يعد تضمين المواد العضوية في الجل النسيجي خطوة وسيطة عملية وفعالة لتجنب فقدان المواد بعد التثبيت ويضمن إمكانية إجراء المعالجة النهائية (التضمين في البارافين والتقسيم) بالتوازي مع عينات الأنسجة. يعد فقدان المواد العضوية أثناء إجراء التثبيت مشكلة حرجة عندما يكون عدد الكائنات العضوية محدودا للغاية. ومع ذلك ، يمكن مواجهة هذه الخسارة عن طريق إزالة المواد العضوية تماما من المصفوفة خارج الخلية عن طريق الغسيل في وسط استزراع قاعدي بارد وعن طريق تجميع بئرين كاملين على الأقل من صفيحة ذات تنسيق 24 بئرا قبل التثبيت. يسمح بروتوكول تلطيخ التألق المناعي بالتصوير البؤري عالي الدقة لمطابقة الخصائص الجزيئية والمظهرية لعضويات سرطان المبيض مع أنسجة الورم الأبوي ولكنه أيضا أداة قيمة لدراسة الاستجابة الخلوية للمركبات الكيميائية أو توصيف الخطوط المعدلة وراثيا. هذه الطريقة مناسبة أيضا لتلطيخ الأنسجة دون أي تعديلات محددة. اعتمادا على الغرض من الدراسة ، ينبغي النظر في أقسام أرق مقطوعة مع ميكروتوم (2-3 ميكرومتر).

الأهم من ذلك ، أن الثقافة المستقرة طويلة الأجل هي شرط أساسي لتجارب تحرير الجينات والمقايسات الوظيفية حول الاستجابة للأدوية ومقاومة العلاجات الجديدة والقياسية17،21. على وجه الخصوص ، توفر المواد العضوية الناتجة عن إعادة الخزعات التي يتم إجراؤها أثناء تطور المرض وتكراره ، إمكانية إجراء تحليلات مقارنة مباشرة بين الورم الأصلي الساذج للعلاج والخصائص المكتسبة حديثا التي لوحظت أثناء الانتكاس. إن تحديد استجابات العلاج الخاصة بالمريض وتشكيل مقاومة العلاج في المختبر يتقدم في مجال الطب الدقيق في أبحاث سرطان المبيض21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تم إدراج M.K. كمخترع على براءة اختراع تتعلق بوسيط لعضويات سرطان المبيض. تلقت F.T. تمويلا بحثيا ومجلسا استشاريا وأتعابا ونفقات سفر من AstraZeneca و Clovis و Eisai و ImmunoGen و Medac و MSD و PharmaMar و Roche و SAGA Diagnostics و Tesaro / GSK. تلقى S.M. تمويلا بحثيا أو مجلسا استشاريا أو نفقات فخرية أو نفقات سفر: AbbVie و AstraZeneca و Clovis و Eisai و GlaxoSmithKline و Hubro و Medac و MSD و Novartis و Nykode و Olympus و PharmaMar و Pfizer و Roche و Sensor Kinesis و Teva و Tesaro.

Acknowledgments

يتم تمويل الدراسة من قبل مركز أبحاث السرطان الألماني DKTK ، موقع شريك ميونيخ ، شراكة بين DKFZ ومستشفى جامعة LMU ميونيخ. يتم دعم الدراسة أيضا من خلال منحة مساعدة السرطان الألمانية (#70113426 و #70113433). تم إجراء تضمين البارافين للأنسجة والمواد العضوية في المنشأة الأساسية لمعهد التشريح ، كلية الطب ، LMU ميونيخ ، ميونيخ. تم إجراء التصوير البؤري في مرفق التصوير الحيوي الأساسي في المركز الطبي الحيوي (BMC). يريد المؤلفون أن يشكروا سيمون هوفمان وماريا فيشر وكورنيليا هيربست وسابين فينك ومارتينا رحمة على المساعدة التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 Sterican 26 G Braun, Melsungen, Germany 4657683
100 Sterican 27 G Braun, Melsungen, Germany 4657705
293T HA Rspo1-Fc R&D systems, Minneapolis, USA 3710-001-01 Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) Merck, Darmstadt, Germany 616454
Advanced DMEM/F-12 Medium  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 12634028
Anti-p53 antibody (DO1) Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-126
Anti-PAX8 antibody Proteintech, Manchester, UK  10336-1-AP
B-27 Supplement (50x) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm Corning, Berlin, Germany  430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 658175
Collagenase I Thermo Scientific, Waltham, USA 17018029
Costar 48-well Clear TC-treated  Corning, Berlin, Germany  3548
Cryo SFM PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear R&D systems, Minneapolis, USA 3533-005-02 Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG Jackson Immuno 715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany C9999-1000ML
DAPI Thermo Scientific, Waltham, USA 62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 Thermo Scientific, Waltham, USA A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 Thermo Scientific, Waltham, USA A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel Thermo Scientific, Waltham, USA Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene  Corning, Berlin, Germany  351447
Feather scalpel  Pfm medical, Cologne, Germany 200130010
Fetal Bovine Serum Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 10270106
Formalin 37% acid free, stabilized Morphisto, Offenbach am Main, Germany 1019205000
GlutaMAX Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 35050038
HEPES (1 M) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D systems, Minneapolis, USA AF960
Human FGF10 Peprotech, NJ, USA 100-26
Human recombinant BMP2 Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA PHC7146
Human recombinant EGF Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1 Peprotech, NJ, USA 100-03
LAS X core Software Leica Microsystems https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 17502-048
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany N0636
Omnifix 1 mL Braun, Melsungen, Germany 3570519
Paraffin
Parafilm Omnilab, Munich, Germany 5170002
Paraformaldehyd  Morphisto, Offenbach am Main, Germany 1176201000
Pen Strep Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany P4333-100
PluriStrainer 400 µm PluriSelect, Leipzig, Germany 43-50400-01
Primocin InvivoGen, Toulouse, France ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany 11814389001
Roticlear Carl Roth, Karlsruhe, Germany A538.5
Surgipath Paraplast Leica, Wetzlar, Germany 39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials Thermo Scientific, Waltham, USA 375418PK
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany T8787
Trypan Blue Stain Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany T8154
TrypLE Express Enzyme  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 12604-013
Tween-20 PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany A4974-0100
Y-27632 TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany 1254
Zeocin Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA R25001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
  3. Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
  4. Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  8. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  9. Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
  10. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
  11. Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
  12. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
  13. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
  14. Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
  15. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  16. Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
  17. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  18. Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
  19. Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021).
  20. Thermo Scientific. Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
  21. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 204 ،
استراتيجية البنوك الحيوية لعضويات سرطان المبيض: معالجة عدم التجانس بين المرضى عبر الأنواع الفرعية النسيجية ومراحل المرض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trillsch, F., Reichenbach, J.,… More

Trillsch, F., Reichenbach, J., Czogalla, B., Kraus, F., Burges, A., Mahner, S., Kessler, M. Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages. J. Vis. Exp. (204), e66467, doi:10.3791/66467 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter