Summary
Denne protokol tilbyder en systematisk ramme for etablering af ovariecancerorganoider fra forskellige sygdomsstadier og adresserer udfordringerne ved patientspecifik variabilitet for at øge udbyttet og muliggøre robust langsigtet ekspansion til efterfølgende applikationer. Det inkluderer detaljerede trin til vævsbehandling, såning, justering af mediekrav og immunofluorescensfarvning.
Abstract
Mens etableringen af en biobank for kræft i æggestokkene fra patientafledte organoider sammen med deres kliniske baggrundsinformation lover fremskridt inden for forskning og patientpleje, er standardisering fortsat en udfordring på grund af heterogeniteten af denne dødelige malignitet kombineret med den iboende kompleksitet af organoidteknologi. Denne tilpasningsdygtige protokol giver en systematisk ramme for at realisere det fulde potentiale af ovariecancerorganoider i betragtning af en patientspecifik variabilitet af forfædre. Ved at implementere en struktureret eksperimentel arbejdsgang for at vælge optimale dyrkningsforhold og såningsmetoder med parallel test af direkte 3D-såning versus en 2D / 3D-rute opnår vi i de fleste tilfælde robuste langsigtede ekspansionslinjer, der er egnede til en bred vifte af downstream-applikationer.
Især er protokollen blevet testet og vist sig effektiv i et stort antal tilfælde (N = 120) af meget heterogent udgangsmateriale, herunder højkvalitets og lavgradig ovariecancer og stadier af sygdommen med primær debulking, tilbagevendende sygdom og post-neoadjuverende kirurgiske prøver. Inden for et eksogent signalmiljø med lav Wnt, høj BMP observerede vi, at forfædre var forskelligt modtagelige for aktiveringen af Heregulin 1 ß (HERß-1)-vejen, hvor HERß-1 fremmer organoiddannelse hos nogle, mens den hæmmer den i andre. For en delmængde af patientens prøver nødvendiggør optimal organoiddannelse og langvarig vækst tilsætning af fibroblastvækstfaktor 10 og R-Spondin 1 til mediet.
Desuden fremhæver vi de kritiske trin i vævsfordøjelse og stamcelleisolering og peger på eksempler, hvor kort dyrkning i 2D på plast er gavnlig for efterfølgende organoiddannelse i kældermembranekstrakt type 2-matrixen. Samlet set kræver optimal biobanking systematisk test af alle hovedforhold parallelt for at identificere et passende vækstmiljø for individuelle linjer. Protokollen beskriver også håndteringsproceduren for effektiv indlejring, sektionering og farvning for at opnå billeder i høj opløsning af organoider, hvilket er nødvendigt for omfattende fænotypning.
Introduction
Klinisk behandling af patienter med kræft i æggestokkene er fortsat udfordrende på grund af dets heterogene kliniske præsentation på fremskredne stadier og høje tilbagefaldsrater1. Forbedring af vores forståelse af udvikling af kræft i æggestokkene og biologisk adfærd kræver forskningsmetoder, der adresserer den patientspecifikke variabilitet i løbet af sygdommen, behandlingsrespons og histopatologiske såvel som molekylære træk2.
Biobanking, der er kendetegnet ved systematisk indsamling og langsigtet bevarelse af tumorprøver afledt af ovariecancerpatienter sammen med deres kliniske oplysninger, giver bevarelse af en stor patientkohorte i forskellige sygdomsstadier, herunder tumorprøver fra primære debulkingoperationer, efter neoadjuverende kemoterapi og fra tilbagevendende sygdom. Det rummer et værdifuldt potentiale for at fremme kræftforskning, der tjener som en ressource af lovende prognostiske biomarkører og terapeutiske mål3. Imidlertid er konventionelle biobankmetoder, såsom formalinfiksering og frysning, ikke modtagelige for at gennemføre funktionelle undersøgelser på de originale tumorprøver på grund af tab af levedygtighed og forstyrrelse af den oprindelige tredimensionelle vævsarkitektur 4,5.
Undersøgelser af molekylære mekanismer, i onkologi og videre, afhænger afgørende af brugen af passende eksperimentelle modeller, der nøjagtigt afspejler sygdommens biologi og opretholder in vitro-egenskaber af det væv, der observeres in vivo. Patientafledte organoider, baseret på bevarelsen af fornyelsespotentialet, reproducerer i laboratoriet epithelets oprindelige struktur og funktion og tillader test i en patientspecifik sammenhæng. Derfor har de vist sig som meget lovende værktøjer til kræftforskning og personlig medicin, der bygger bro mellem klinisk mangfoldighed og laboratorieforskning 6,7,8,9. Skræddersyede terapeutiske strategier baseret på individuelle lægemiddelresponser af organoidlinjer og test af den funktionelle relevans af molekylære profiler kan potentielt anvendes direkte til patientpleje10,11. Muligheden for langtidsdyrkning, herunder patientspecifikke karakteristika, og indsamling af relevante prospektive kliniske data over tid er meget lovende med hensyn til at identificere nye prognostiske og prædiktive faktorer, der er involveret i sygdomsprogression og resistensmekanismer 3,9.
Ikke desto mindre kræver opbygning af en biobank, der inkluderer organoider fra forskellige tumorprøver, en kombination af streng overholdelse af kompleks metode og opsætning af protokoller for nem vedligeholdelse12. Processtandardisering sikrer, at biobanken kan etableres og vedligeholdes effektivt af uddannet personale selv ved høj omsætning, samtidig med at de højeste kvalitetsstandarderoverholdes 13. Flere undersøgelser rapporterede den vellykkede generering af stabile organoide linjer for kræft i æggestokkene svarende til mutations- og fænotypisk profil af den oprindelige tumor med varierende effektivitetshastigheder. Alligevel er rutinemæssig biobank fortsat udfordrende i praksis, især for langsigtet stabil vækst af linjer, hvilket er en forudsætning for storstilet ekspansion eller vellykket genomisk redigering.
Især spørgsmålet om udvidelsesmuligheder er fortsat vagt defineret på området, da organoider, der viser langsomt og begrænset vækstpotentiale, lejlighedsvis tælles som etablerede linjer. Som oprindeligt påvist af Hoffmann et al., en undersøgelse, hvis hovedresultater dannede grundlag for denne videreudviklede protokol, kræver optimal håndtering af ovariecancervæv en unik strategi for at imødekomme heterogenitet14. Fænotypisk karakterisering af organoiderne opnået ved denne metode og tæt lighed med forældrenes tumorvæv blev bekræftet ved panel-DNA-sekventering og transkriptomisk analyse af modne kulturer (4-10 måneders dyrkning), der demonstrerer stabiliteten af modellen 8,9,12,14.
I modsætning til det parakrinmiljø, der regulerer homeostase i de sunde æggeledere, epitellaget, som sandsynligvis giver højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC), kræftregenereringspotentiale og organoid dannelseskapacitet, er mindre afhængig af eksogent Wnt-tilskud. Desuden viste aktiv knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, karakteriseret ved fraværet af Noggin i organoidmedium, sig at være gavnlig for etablering af langsigtede kulturer fra ovariecancer faste vævsaflejringer14,15. Under systematisk biobanking af faste forekomster af kræft i æggestokkene har vi bekræftet disse resultater og oprettet rørledningen med detaljer skitseret i denne protokol, der sikrer vedvarende langsigtet ekspansion i de fleste tilfælde. Vi finder, at parallel afprøvning af forskellige mediesammensætninger og såningsmetoder, når der arbejdes med primære isolater, er afgørende for at forbedre etableringen af langsigtede stabile organoidlinjer og for at øge udbyttet, hvilket muliggør robust formering og udvidelse til multibrøndformater, der kræves til downstream-forsøg16.
Desuden er renheden og kvaliteten af de prøver, der indsamles under operationen, af afgørende betydning for translationspotentialet af ovariecancerorganoider i grundforskning og molekylær diagnostik. Kompleksiteten af den kliniske præsentation af HGSOC kræver et tæt samarbejde mellem kirurgerne, onkologerne og forskerne i laboratoriet for at sikre, at relevant materiale identificeres korrekt, transportbetingelserne holdes konstante, og organoide linjer genereres med høj effektivitet, der repræsenterer de vigtigste egenskaber ved sygdommen hos hver patient. Denne protokol giver en standardiseret, men tilpasningsdygtig ramme til at fange det fulde potentiale af ovariecancerorganoider i betragtning af den heterogenitet, der karakteriserer kræft i æggestokkene16,17. Denne protokol muliggør især pålidelig biobanking af det brede spektrum af klinisk præsentation af kræft i æggestokkene, herunder forskellige histologiske typer (højkvalitets og lavgradig ovariecancer, LGSOC), forskellige aflejringer fra de samme patienter, der udviser forskelle i stemnessregulering, væv fra operationer i postneoadjuverende indstilling, biopsimateriale og prøver fra operationer i den tilbagevendende fase af sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorvævsprøver fra ovariecanceroperationer blev indsamlet, og patientafledte organoider blev genereret i overensstemmelse med den etiske komité for LMU University (17-471) i overensstemmelse med de eksisterende gældende EU-, nationale og lokale regler. Hver patient, der er involveret i undersøgelsen, har givet skriftligt samtykke. Ved arbejde med friske vævsprøver kræves biosikkerhedsniveau 2 sikkerhedstilladelse og Laminar Flow-skabe. I betragtning af vævsprøvernes potentielt infektiøse karakter, som ikke kan udelukkes på grund af manglende rutinemæssig testning af relevante infektionssygdomme, er det nødvendigt at sikre, at de institutionelle biosikkerhedsbestemmelser overholdes nøje, og at der er passende personlige værnemidler til rådighed for det personale, der udfører forsøgene.
1. Forberedelser
- Medium forberedelse
- Forbered 2D- og 3D-medierne frisk en gang om ugen og opbevar dem ved 4 °C.
BEMÆRK: Den nøjagtige sammensætning af ingredienserne for hvert medium er angivet i tabel 1. Både ovariecancer medium 1 (OCM1) og OCM2 kan yderligere suppleres med HER1ß (endelig koncentration: 50 ng / ml), hvilket resulterer i fire forskellige tilstande: OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2, OCM2 + HER1ß. - Der fremstilles stamopløsninger af vækstfaktorreagenserne, og de opbevares ved 20 °C og A83-01 og nikotinamid (opbevaring ved +4 °C). På grund af vækstfaktorernes temperaturfølsomhed anvendes optøede stamopløsninger straks til medium tilberedning og undgås gentagne optøningscyklusser ved at skabe alikvoter.
BEMÆRK: Medieforberedelse er et kritisk trin, der skal kontrolleres strengt. - Fremstilling af RSPO-1-konditioneret substrat
- HA-R-Spondin1-Fc 293 T-celler (opbevares hurtigt ved -80 °C) ved 37 °C. Vask dem med 10 ml basalkulturmedium, suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), fremover benævnt basalkulturmedium++.
- Resuspender cellepelleten i 12 ml basalkulturmedium++ og frø den i en T75-kolbe.
- Opdel cellerne i forholdet 1:6 med et dissociationsreagens indeholdende trypsin (4 min ved 37 °C), når cellerne når sammenløb. Frø dem i en ny T75-kolbe.
- Den næste dag tilsættes phleomycin D1 (1,25 μL/ml) til mediet.
- Opdel cellerne i forholdet 1:20 med trypsin (4 min ved 37 °C), når cellerne når sammenløb. Cellerne hældes i flere T75-kolber (antal kolber i henhold til det tilsigtede slutvolumen) i 30 ml basalkulturmedium++ (indeholdende 10 % FCS) tilsat phleomycin D1.
- Start den konditionerede medieproduktion, når cellerne når ca. 50% af sammenløbet: Udskift mediet med 40 ml basalkulturmedium suppleret med 5% FCS uden phleomycin D1.
- Den første supernatant indsamles efter 3 dage. For at fjerne snavset centrifugeres i 10 minutter ved 1.200 × g. Supernatanten opbevares i en steril beholder ved 4 °C.
- Tilsæt nyt basalkulturmedium suppleret med 5% FCS til cellerne. Den anden supernatant opsamles efter 3-4 dage. Centrifuger i 10 min ved 1.200 × g. Den anden supernatant føjes til den første supernatant.
- Sil det konditionerede medium ved hjælp af et 0,2 μm flasketopfilter.
- Til kvalitetskontrol og RSPO1-kvantificering tilsættes det producerede medium til en 293T-cellelinje (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, stabilt transduceret med GFP-plasmid, der bærer Wnt-reporter18.
BEMÆRK: Afhængigt af mængden og intensiteten af GFP-signalet testes aktiviteten af RSPO1 som en agonist af Wnt-vejen ved kvantificering af Wnt-reportercellelinjen. - Opbevar alikvoter på 15 ml til øjeblikkelig brug (inden for 1 uge) ved 4 °C. Ved længere opbevaring (6 måneder) opbevares det konditionerede substrat ved -20 °C.
- Forbered 2D- og 3D-medierne frisk en gang om ugen og opbevar dem ved 4 °C.
2. Indledning af en organoid kultur af kræft i æggestokkene
- Primær vævsisolering
- Transport frisk og levedygtigt væv, helst umiddelbart efter operationen, og udfør isolering inden for højst 20 timer efter opsamling. Sørg for korrekt transporttilstand i vævsopsamlingsmediet med en transportkasse udstyret med kolde pakninger ved ca. 4 °C.
- I laboratoriet skal du forberede de nødvendige reagenser og udstyr for at lette rettidig prøvebehandling:
- Thaw Basement Membrane Extract Type II matrix (BME 2 matrix) på is (ca. 2 timer).
- Forbered engangsskalpeller, steriliserede dissektionsværktøjer (saks og pincet) og filterindsatser i størrelse 400 μm til 50 ml rør.
- Forbered en beholder med en lille mængde flydende nitrogen til snapfrysning og et forvarmet vandbad ved 37 °C.
BEMÆRK: Arbejd inden for en cellekultur laminar flow hætte.
- Vask det friske væv i en petriskål grundigt i fosfatbufret saltvand (PBS) (uden Ca++ og Mg++). Inde i petriskålen fragmenteres vævet ved hjælp af engangsskalpeller og/eller saks i små stykker på 3-5 mm.
- Adskil det opnåede væv i tre sektioner til følgende formål:
- Saml væv i kryogene rør. Overfør de kryogene rør til den forberedte beholder fyldt med flydende nitrogen til stødfrysning.
- Væv (2-3 mm) samles i en histologisk prøvebeholder fyldt med formalin til fiksering (24 timer) og indlejres i paraffin til farvningsformål19,20.
- Homogeniser endvidere vævet før enzymatisk fordøjelse. Maksimer den mekaniske dissociation med en skalpel og overfør den til et 50 ml vævsrør.
BEMÆRK: Sørg for, at vævet altid er gennemblødt i PBS under homogenisering for at undgå udtørring af vævet.
- Det homogeniserede væv kombineres med en fordøjelsesblanding indeholdende PBS (uden Ca++ og Mg++), collagenase I (stamopløsning 5 E/μL, slutkoncentration 1 E/μL) og en selektiv ROCK1- og 2-hæmmer (3 μM slutkoncentration) (komponenter anført i tabel 1). Brug 15 ml fordøjelsesblanding i et 50 ml rør for hver 2 cm3 af tumoren.
BEMÆRK: Begrænset materiale (f.eks. biopsiprøver) kræver kun små mængder (ca. 2-3 ml) fordøjelsesblanding for at sikre enzymatisk dissociation. - Ved enzymatisk dissociation inkuberes røret i 1,5 time i et vandbad ved 37 °C. Udfør sporadisk og kraftig hvirvelstrøm (ca. hvert 20. minut i 10-15 s) for at understøtte mekanisk dissociation.
- Efter inkubation tilsættes 15 ml koldt basalkulturmedium++ til røret. Centrifuger 5 min ved 300 × g.
- Efter fjernelse af supernatanten tilsættes 5 ml nyt basalkulturmedium++. Sil cellesuspensionen ved hjælp af et 400 μm filter i et frisk 50 ml rør.
- Centrifuger i 5 min ved 300 × g. Supernatanten fjernes, og cellepelletsen opbevares.
- Til fjernelse af erytrocytter tilsættes 5 ml Red Blood Cell Lysing (RBC) buffer til cellepelleten. Der inkuberes i vandbad i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 5 ml basalkulturmedium ++ til lysisinaktivering. Centrifuger i 5 min ved 300 × g. Tilsæt 3 ml basalkulturmedium++ til cellepelleten.
- Tæl levedygtige celler efter 1:1 fortynding med trypanblå pletopløsning (f.eks. 10 μL af prøven + 10 μL trypanblå pletopløsning) i en automatisk celletæller eller manuelt i et Neubauerkammer.
- Beregn antallet af celler, der er nødvendige til direkte 3D-såning. For hver tumoraflejring frø i en 48-brønds formatplade mindst 2-3 brønde pr. ovariecancermedium, hvilket svarer til i alt 8-12 brønde i en såmatrix (OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2, OCM2 + HER1ß). Beregn 30.000 celler for hver brønd i en dråbe på 25 μL BME Type 2-matrix. Du kan også vælge et format med 24 huller med 50 μL BME 2-matrix og 50.000 seedede celler pr. brønd.
- Seed de resterende celler i 2D (se trin 2.1.13).
- Pipetter mængden af basalkultur medium++ suspension, der indeholder det samlede antal nødvendige celler i et nyt rør, og centrifuger i 5 minutter ved 300 × g. Supernatanten fjernes, og cellepelletsen opbevares.
- På isen tilsættes den samlede mængde kold BME 2-matrix (25 μL for hver brønd i en 48-brønds formatplade; derfor 100 μL for 4 brønde) til pelleten og blandes godt for at opnå en jævn fordeling af celler pr. brønd ved forsigtigt at pipettere pelleten op og ned uden at skabe bobler.
- Frø cellerne i dråber af BME 2 matrix (25 μL) til den forvarmede, tomme 48-brønd plade. For at opnå en jævn fordeling mellem hullerne skal pipetten forsigtigt og langsomt bevæge sig op og ned (3-4x) inde i røret, før BME 2-matrixdråben overføres til hvert hul for at forhindre celleudfældning under fordelingen.
- Efter inkubation af pladen ved 37 °C i mindst 30 minutter for at konsolidere dråberne i BME 2-matrixen pipetteres 250 μL af hvert af de fire ovariecancermedier (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) i de tilsvarende huller.
- Parallelt med den direkte 3D-såningsprocedure skal du bevare de resterende isolerede celler ved at starte en 2D-kultur.
- Efter centrifugering i 5 minutter ved 300 × g tilsættes pelleten til 2D-mediet. Vælg formatet (T75-kolbe eller T25-kolbe), afhængigt af antallet af tilgængelige celler efter 3D-såning.
- Kolben inkuberes i 3-5 dage ved 37 °C for celleadhæsion. Opbevar det samme medium i de første 72 timer.
- Når cellerne når sammenløb, overføres kulturen til BME 2-matrixen. Udvid ikke primære isolater i 2D-kultur ved opdeling, da langvarig formering på 2D er skadelig for stammepotentialet.
- Overførsel fra 2D-kultur til 3D-kultur
- I T75- eller T25-kolben vaskes monolaget 2x med 5 ml PBS for at løsne cellerne fra bundoverfladen. Der inkuberes med 1 ml trypsin i 10 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 5 ml koldt basalkulturmedium++ til inaktivering af dissociationsreagenset. Centrifuger i 5 min ved 300 × g.
- Tilsæt 3 ml basalkulturmedium++ til pelleten. Tæl cellerne som beskrevet i trin 2.1.12-2.1.13. Frø til de forskellige mediesammensætninger (se figur 1) som beskrevet i trin 2.1.16-2.1.18.
- Evaluering af organoid vækst
- Tag billeder af brøndene mindst en gang om ugen for at dokumentere organoid vækst. Lav sammenlignelige billeder af høj kvalitet af 2D / 3D-kultur og direkte såplader efter fasekontrastmikroskop. Sørg for konsistens i forstørrelse og brug 4x til et overblik over brøndene (kvantificering) og 10x og 20x til at dokumentere organoidernes morfologi.
- Organiser lagring af billeder i mapper dedikeret til individuelle linjer.
- Vælg den bedste organoidlinje til langvarig dyrkning ved sammenlignende vurdering af organoiddannelse ved de forskellige såningsmetoder (2D efterfulgt af 3D-såning versus direkte 3D-såning) og forskellige mediesammensætninger (OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2 og OCM2 + HER1ß).
- I gennemsnit vurderer 14-21 dage efter isolering det organoiddannende potentiale (mængde) samt størrelsen og den cellulære fænotype af organoider dyrket under forskellige forhold. Se efter følgende funktioner: fravær af vakuoler, membranblødning eller tab af vedhæftning og afrunding af celler.
3. Langsigtet organoid dyrkning
- Organoid passaging
- Undgå at opdele organoider for ofte og i proliferativ fase. Udfør mekaniske og enzymatiske fordøjelsesprocedurer med intervaller på mere end 10 dage.
- For at forstyrre hver BME 2-matrixdråbe tilsættes 250 μL (48-brøndformat) eller 500 μL (24-brøndformat) iskoldt basalkulturmedium ++. Sørg for fuldstændig opløsning af dråben og pipetten intermitterende op og ned og skrab bunden af pladen. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør og læg den på is. Tilsæt 1 ml iskold basalkultur medium++.
BEMÆRK: BME 2-matrixens fjernelseseffektivitet afhænger stærkt af medietemperaturen, da den bedste opløsning opnås under 4 °C. - Pool 2-3 tekniske replikate brønde til jævn ekspansion. Centrifuger i 5 min ved 300 × g. Undersøg suspensionens indhold i forhold til lyskilden for at se, om BME 2 gel stadig er synlig. Supernatanten fjernes og vaskes igen med et iskoldt medium, hvis BME 2-matrixen stadig er synlig.
- Der inkuberes med 1 ml trypsin (opbevares ved 20-25 °C) i vandbad ved 37 °C i 7-10 minutter. Vortex sporadisk i 10 s for at forbedre dissociation. Undersøg røret med jævne mellemrum visuelt for at se, om dissociationen skrider frem.
- Træk cellesuspensionen op og ned med en sprøjte gennem en kanyle med en størrelse fra 23 G til 27 G. Kontroller, om der stadig er store celleklumper, og gentag proceduren om nødvendigt.
BEMÆRK: Fragmentering gennem en sprøjte er valgfri, og kanylestørrelsen afhænger af den krævede dissociationseffekt. En homogen cellesuspension fører til jævn fordeling mellem brøndene. - Tilsæt 1 ml koldt basalkulturmedium++ for at inaktivere reaktionen.
- VALGFRIT: Tæl cellerne som beskrevet i trin 2.1.12-2.1.13, og bestem opdelingsforholdet til forældrepassagen (f.eks. 1:3-huller).
- Centrifuger i 5 minutter ved 300 × g. Supernatanten fjernes.
- Udfør såning som beskrevet i trin 2.1.16-2.1.18 og anvend det respektive optimale organoidmedium for ovariecancer i henhold til den allerede etablerede langsigtede kultur. Skift æggestokkræftmediet hver 3-4 dage.
- I tilfælde af forstyrrelse af BME 2-matrixdråben under medium ændring, overveje gensåning uden enzymatisk fordøjelse. For at undgå forstyrrelse af dråben skal du omhyggeligt udføre mediumskifteproceduren uden direkte pipettering på BME 2-matrixdråben. Undgå desuden at efterlade en for stor mængde resterende basalkulturmedium++ på pelleten før fortynding med BME 2-matrixen i trin 2.1.16, da det kan påvirke dråbernes skrøbelighed.
- Kryopræservering af organoider
BEMÆRK: Udfør kryopræservering af organoiderne under proliferationsfasen i den første uge efter passage.- BME 2-matrixdråben afbrydes med iskold basalkulturmedium++ i henhold til trin 3.1.2. Efter centrifugering og kassering af supernatanten som beskrevet i trin 3.1.3 arbejdes der på isen, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml iskold kryopræserveringsmedium. Overfør cellesuspensionen til præmærkede 1,8 ml kryogene reagensglas.
- Glassene opbevares i en forkølet frysebeholder indeholdende isopropylalkohol, og de anbringes ved -80 °C natten over.
- Opbevar stamrørene ved -80 °C i højst 2 måneder. Overfør til flydende nitrogen til langvarig stabil opbevaring.
- Optøning af organoidbestande
- Forvarm 9 ml basalkulturmedium++ i et 37 °C vandbad i et mærket 15 ml rør.
- Overfør det ønskede hætteglas fra opbevaringsrummet ved -80 °C eller til flydende nitrogen til en transportbeholder fyldt med flydende nitrogen.
- Kryorøret overføres til et vandbad ved 37 °C, og det omrystes forsigtigt, indtil det frosne materiale nær rørets vægge begynder at tø op.
- Fordel organoidsuspensionen langsomt i det mærkede rør fyldt med 9 ml medium. Ryst forsigtigt røret. Der centrifugeres i 5 minutter ved 300 × g , og supernatanten fjernes.
- Udfør såning som beskrevet i trin 2.1.16-2.1.18 og anvend det respektive optimale organoidmedium for ovariecancer i henhold til de allerede bestemte langsigtede dyrkningsbetingelser for den enkelte linje.
- Fiksering af organoider
- Udfør organoidopsamling som beskrevet i trin 3.1.2-3.1.3.
- Tilsæt 3 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 7,4) og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Der udvaskes 2x med 5 ml PBS, centrifugeres i 3 minutter ved 300 × g, og supernatanten fjernes. Tilsæt 4 ml frisk PBS til pelleten og opbevar den ved 4 °C indtil indlejring.
BEMÆRK: Faste organoider er stabile, og opbevaring ved 4 °C er mulig i 1 måned før indlejring. - Den histologiske gel (opbevaret ved -20 °C) opvarmes ved 65 °C, indtil den er flydende.
- Opdag de faste organoider, der er bundfældet og synlige i bunden af røret. Supernatanten fjernes. Hvis der er tale om et forstyrret cellepellet, centrifugeres der i 3 minutter ved 300 × g , og supernatanten PBS kasseres.
- Pellet suspenderes i 100 μL varm gel ved forsigtigt pipettering op og ned. Overfør dråben til et stykke tætningsfilm, og lad størkning ske efter ~ 15 minutter ved stuetemperatur.
- Flyt den faste geldråbe til vævsparaffinkassetten. Udfør standard vævsindlejringsprotokoller19,20.
- Skær 5-10 μm tykke skiver med et skæreværktøj med mikrosektionering. Overfør snittene til histologiglas. Objektglassene tørres i 1 time ved 65 °C; Opbevar dem på et tørt sted.
- Immunofluorescensfarvning af organoide sektioner
- Flyt de forberedte dias gennem glasbakker med følgende fortyndingsserie: 2 x 15 min clearingmiddel til histologi; 15 min 100% ethanol; 1 min 100% ethanol; 10 min 96% ethanol; 5 min 70% ethanol; 5 min 50% ethanol.
- Tilsæt PBS og hold 5 min på rysteren ved 100 o / min. Gentag vasken 2x.
- Tilsæt antigenhentningsopløsning (Tris (hydroxymethyl) aminomethan-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)-buffer [pH 9,0] eller citrat [pH 6,0]) til diasene, der er placeret i det termostabile kammer. I en dampkoger opbevares beholderen med diasene i 30 minutter, efterfulgt af afkøling til stuetemperatur.
- Gentag trin 3.5.2.
- Overfør kammeret med objektglassene i 15 minutter til 1% permeabiliseringsopløsning af vaskemiddel (i PBS).
- Gentag trin 3.5.2.
- Konturer placeringen af organoider på diasene med en immunfarvningsvokspen for at opretholde dråben under de følgende trin.
- På hvert objektglas tilsættes 100 μL 10% serum i et fortyndingsmedium, afhængigt af arten af det sekundære antistof.
- Gentag trin 3.5.2.
- De primære antistoffer fortyndes i et medium, hvilket fører til et slutvolumen på 100 μl. Opbevares ved 4 °C i mindst 16 timer i en inkubationsbakke/et fugtighedskammer.
- Gentag trin 3.5.2.
- Fortynd de sekundære antistoffer i et medium, hvilket fører til 100 μL dråber, og opbevar i 2 timer ved stuetemperatur i en inkubationsbakke.
- Gentag trin 3.5.2.
- Der tilsættes nuklear modpletopløsning DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dihydrochlorid) fortyndet i et fortyndingsmedium 1:1,000. Opbevares i 10 minutter ved stuetemperatur til inkubation.
- Gentag trin 3.5.2.
- Tilføj monteringsmedium og dæk med dæksedlen. Fastgør diasene med gennemsigtig neglelak, når de er tørre (ca. efter 8-12 timer).
- Billede med et konfokalmikroskop eller andet fluorescensmikroskop. Lav oversigtsbilleder samt detaljerede billeder af subcellulære strukturer, der fanger de vigtigste egenskaber ved organoid morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter indledende vævsdissociation, filtrering og tælling podes celler parallelt direkte i 3D-format, som forklaret ovenfor, såvel som suspensionen i kolben for kort 2D-ekspansion. I nogle tilfælde påvirker den forbigående 2D-ekspansion positivt organoiddannelsen, og den langsigtede linje etableres med succes via denne rute, mens komparativ parallel 3D-såning kan resultere i vækststop (figur 1). For hvert donorvæv, der behandles, testes cellerne i henhold til mediematrixen. Efter denne strategi indeholder vores biobank nu linjer, der er repræsentative for hver standardvækstbetingelse som vist i figur 2. Ved streng implementering af denne mini-screeningsplatform til test af forskellige medier og såningsmetoder har vi med succes genereret organoidlinjer fra forskellige histologiske typer og stadier af sygdomsudvikling af ovariecancer (figur 3) af primære højkvalitets serøse, postneoadjuverende intervaloperationer og fra tilbagevendende sygdom. Fænotypisk karakterisering af organoidlinjerne ved immunofluorescensfarvning af hovedmarkører sammenlignet med forældrevæv viser overbevisende, at kendetegn ved epiteltumorrum bevares i organoidmodellen: epitelarkitektur og vedhæftning markeret med (EpCAM), afstamningsidentitet (PAX8) og typisk TP53-punktmutation, der er karakteristisk for HGSOC, der fører til akkumulering i kernen (figur 4).
Nogle vigtige metodologiske punkter skal også overvejes for effektiv beslutningstagning under organoid biobanking. Organoid vækstpotentiale bestemmes ikke kun af stigningen i organoid diameter. Derudover bestemmer fænotypiske egenskaber ekspansionspotentialer såsom farve, mørke og konturintegritet. Dannelsen af cytoplasmatiske stressvakuoler indikerer suboptimale forhold. Indledende problemer med hensyn til vækst og organoiddannende potentiale kan opstå på grund af uhensigtsmæssige transportforhold og forsinkelse af vævsprocession. Da der observeres en høj interindividuel variation i ekspansionspotentiale inden for tumorlinjerne, anbefaler vi at vente mindst 14 dage, før der træffes en endelig beslutning om vækstpotentialet. Hvis lignende vækstmønstre oprindeligt observeres i forskellige medier, bør flere betingelser udvides. Fra vores erfaring er en klar sondring mellem langsigtet stabilt vækstpotentiale ofte kun mulig efter dyrkning af flere uger eller måneder.
Figur 1: Fordele ved kortvarig såning i 2D af primære isolater til efterfølgende organoidgenerering. (A) Skema for det eksperimentelle layout, der viser tovejs, parallel såningsstrategi: 2D / 3D og direkte 3D-såning i fire forskellige medier. (B) Billede af vedhængende primære isolater før trypsinisering og 3D-overførsel. (C) Et eksempel på den primære aflejring, hvor parallel såning afslørede den klare fordel ved 2D/3D-ruten, da langsigtet organoidekspansion kun var mulig fra forfædre, der oprindeligt var isoleret på plast. Billedet øverst til venstre viser en 3D-kultur 7 dage efter isolation ved passage 0 (kaldet P0) med utilstrækkelig organoiddannelse efter den første passage (kaldet P1) nederst til venstre. Efter 2D-såning på plast (se figur 1B) efterfulgt af overførsel til en 3D-kultur er en bedre organoiddannelse allerede tydelig ved P0, mens langsigtet ekspansionspotentiale bekræftes ved passage 4 (P4). Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Patientspecifikt mediumbehov. Eksempler på fire forskellige langsigtede stabile udvidede linjer, der hver vokser i et andet medium. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelser: OCM = ovariecancer medium; her = heregulin 1β; HGSO = højkvalitets serøs kræft i æggestokkene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Organoid generation fra alle stadier af sygdommen. Billeder af langsigtede stabile ekspanderende linjer, fra højkvalitets serøs og lavgradig serøs ovariecancer i primær sygdomspræsentation, fra intervalkirurgi (postneoadjuverende kemoterapi) og fra tilbagevendende kræftvæv. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelser: HGSOC = højkvalitets serøs kræft i æggestokkene; LGSOC = lavgradig serøs kræft i æggestokkene; NACT = neoadjuverende kemoterapi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tæt match af fænotype af organoider og forældrecancervæv. Konfokale billeder af immunofluorescensfarvning af (A) kræftvæv og (B) parret organoidlinje viser meget høj lighed i farvningsmønster og ekspressionsniveau for alle markører, EpCAM (grøn), PAX8 (rød), TP53 (magenta). Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætning af medier og fordøjelsesblanding, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den designede protokol adresserer tidligere udfordringer ved organoid biobanking af ovariecancer med hensyn til organoiddannelse og langsigtet passagepotentiale og sikrer generering af fuldt udvidelige linjer fra størstedelen af solide tumoraflejringer. Den kirurgiske indsamlingsproces af tumorprøver, der skal anvendes til organoidgenerering, påvirker udbyttet og ekspansionspotentialet betydeligt. Tumorvævsprøver kan opnås under forskellige procedurer, herunder multivisceral kirurgi, diagnostisk laparoskopi eller biopsi. Den erfarne gynæko-onkologiske kirurg bør prioritere at opnå rene tumorprøver fra peritoneale steder. Det er især blevet observeret, at makroskopisk nekrotiske områder inden for store tumoraflejringer er mindre egnede til en vellykket generering af organoidkulturer. Da prøverenhed er afgørende for at afspejle molekylære og fænotypiske egenskaber til downstream-applikationer, kræves synkroniseret indsats fra både de kliniske og laboratorieholdene for optimal biobanking, hvilket sikrer, at linjerne oprettes fra de mest relevante regioner i tumoren.
Mens denne protokol dækker variationer i vækstfaktorafhængigheder, som vi har observeret i løbet af 2 års biobanking, er det klart, at yderligere forfining er berettiget til yderligere at øge effektiviteten, da vi stadig ikke observerede nogen organoidvækst i 20% af tilfældene, og antallet af linjer, der viste begrænset ekspansionspotentiale, antydede suboptimal vedligeholdelse af stammen. Selvom vores organoid biobank i øjeblikket kun omfatter ovariecancerprøver af serøs histologi (HGSOC og LGSOC), viste vores erfaring med prøver fra forskellige epitelial ovariecancerhistologier forud for det strukturerede biobankprogram sammenlignelige succesrater uden specifikke forskelle. Især deler størstedelen af epitelial ovariecancerundertyper en lignende søjleformet pseudostratificeret morfologi med væv, der udviklede sig fra Mullerian-kanalen (æggeleder, livmoder, livmoderhals), mens selve ovarieepitelet derimod stammer udviklingsmæssigt fra kønsryggen og mesonephros, der er dækket af et enkelt lag kuboidt epitel. Da udviklingsveje, der regulerer epitelhomeostase, spiller en central rolle i kontrollen af voksne stamcellers potentiale, bør forskellene i embryonal oprindelse tages i betragtning ved udviklingen af protokoller for biobankning af organoider. Således mener vi, at forfædre fra overfladen af æggestokken sandsynligvis kræver organspecifikke dyrkningsforhold for at opretholde langsigtet stabil vækst.
Især i vores laboratorium har protokollen vist sig at være vellykket også for post-neoadjuverende ovariecancerprøver, selvom den neoadjuverende kemoterapi påvirker cellelevedygtigheden og vævsfænotypen. Disse prøver udviser mere affald og ekstracellulære vævsaggregater sammenlignet med prøver, der stammer fra kemoterapi-naivt væv fra primære debulking-operationer, som kan påvirke organoiddannelsespotentialet. I disse tilfælde oplevede vi, at en passende mængde kirurgisk væv og streng overholdelse af de anbefalede transportbetingelser er afgørende for vellykket organoidgenerering, da de post-neoadjuverende prøver kan være mere følsomme.
Et meget interessant fænomen af den gavnlige virkning af kort ekspansion på plast i 2D af frisk isolerede forfædre på efterfølgende organoidvækst, som vi gentagne gange har observeret og derfor inkluderet i den standardiserede eksperimentelle procedure, er en vigtig tilføjelse til metoden for kræftorganoidforskningsfelt, som i vid udstrækning er afhængig af direkte såningsstrategier. Det er fristende at spekulere i, at forfædrenes følsomhed efter enzymatisk fordøjelse og vækstfaktorernes evne til at prime dem tilstrækkeligt kan være de underliggende mekanismer bag denne forskel, som i nogle tilfælde er en afgørende faktor, hvis linjen kan etableres. Der er dog behov for mere forskning for at etablere klare afhængigheder.
For at imødekomme udfordringerne ved høj celleadhæsion og funktionelle krydsninger i 3D ovariecancerorganoider, som er vanskelige at fordøje, kan en kombination af mekanisk og enzymatisk dissociation med nål og sprøjte hjælpe, når store klumper forbliver efter trypsinisering. Eksperimentering med forskellige enzymatiske tilstande kan føre til yderligere forbedringer.
Efter langtidsopbevaring kan organoide linjer optøes og bringes i kultur i henhold til det eksperimentelle design og anvendes til efterfølgende applikationer. Dette giver til enhver tid adgang til allerede genererede organoide linjer til specifikke forskningsformål og er især interessant for at undersøge den langsigtede adfærd af visse linjer i lyset af patientens sygdomsprogression. Kryopræservering af organoider i æggestokkene er dog fortsat en udfordring. Temperaturvariationer under fryse- og optøningscyklusser kan påvirke organoids levedygtighed, funktionalitet og ekspansionspotentiale negativt. Langtidsopbevaring er mere stabil i flydende nitrogen, hvor meget lave temperaturer minimerer risikoen for nedbrydning, så organoidernes integritet kan opretholdes. Imidlertid er løbende optimering berettiget til at etablere ensartede procedurer for frysning, opbevaring og optøning for yderligere at forbedre disse processer.
På trods af de nævnte udestående problemer demonstrerer denne protokol evnen til konsekvent at generere stabile organoidlinjer fra solide tumorprøver af patienter med kræft i æggestokkene. I vores laboratorium behandlede vi til dato 120 primære ovariecancervævsprøver, der opnåede succes i ca. 50% af tilfældene, herunder en bred vifte af histologiske undertyper og stadier af sygdommen med primær debulking, tilbagevendende sygdom og postneoadjuverende kirurgiske prøver. Ved at tilvejebringe en struktureret ramme for generering af organoider afledt af forskellige patientprøver, parallel såning i forskellige medier og implementering af forskellige såningsstrategier giver denne protokol mulighed for at vurdere individuelle forskelle i stamhedspotentiale og dermed give yderligere information om tumorbiologi. Så vidt vi ved, følger langt de fleste undersøgelser normalt den omvendte tilgang med at teste mediekomponenterne på et lille antal prøver og for nemheds skyld vælge for det meste et optimalt medium. Vores systematiske test af effekten af HER1ß, effekten af RSPO1- og FGF10-tilskud og 2D/3D-såning viser endegyldigt, at ovariecancervæv har en grad af interpatient variabilitet i stamhedsegenskaber, og det optimale medium er faktisk patientspecifikt. Derfor er systematisk parallel test af forskellige mediesammensætninger, der giver forskellige eksogene parakrinsignalmiljøer, afgørende.
Etablering af en levende biobank med et omfattende panel af organoider afledt af forskellige ovariecancerpatienter sammen med deres prospektivt indsamlede kliniske oplysninger tjener som en værdifuld ressource for en bred vifte af forskningsanvendelser og afspejler det heterogene kliniske landskab, der potentielt kan anvendes til en større patientpopulation17. Langsigtet dyrkning og kryopræservering muliggør eksperimentel konsistens og gentagen tilgængelighed af den samme organoidlinje over tid, hvilket tjener som base for langsgående eksperimentelle designs med uændret tumorlinjecellulære egenskaber.
Ved at bevare epitelarkitektur og polarisering er organoidlinjerne en passende model til at studere celle-cellekommunikation og kontekstafhængig beslutningstagning om celleskæbne medieret af parakrin signalveje. Indlejring af organoiderne i den histologiske gel er et praktisk og effektivt mellemliggende trin for at undgå tab af materiale efter fiksering og sikrer, at downstream-behandling (indlejring i paraffin og sektionering) kan udføres parallelt med vævsprøver. Tabet af organoider under fikseringsproceduren er et kritisk problem, når antallet af organoider er meget begrænset. Dette tab kan imidlertid modvirkes ved grundigt at fjerne organoiderne fra den ekstracellulære matrix ved vask i et koldt basalkulturmedium og ved at samle mindst to fuldvoksne brønde i en 24-brønds formatplade før fiksering. Immunofluorescensfarvningsprotokollen tillader konfokal billeddannelse med høj opløsning at svare til molekylære og fænotypiske egenskaber ved ovariecancerorganoiderne med forældretumorvævet, men er også et værdifuldt værktøj til at studere det cellulære respons på kemiske forbindelser eller karakterisering af genetisk modificerede linjer. Metoden er også velegnet til histologifarvning uden specifikke ændringer. Afhængigt af formålet med undersøgelsen bør tyndere sektioner skåret med et mikrotomt (2-3 μm) overvejes.
Det er vigtigt, at stabil langsigtet kultur er en forudsætning for genredigeringseksperimenter og funktionelle assays om lægemiddelrespons og resistens over for nye og standardterapier17,21. Især organoider genereret fra rebiopsier, der udføres under sygdomsprogression og tilbagefald, giver mulighed for direkte komparative analyser mellem den terapinaive oprindelige tumor og de nyerhvervede egenskaber, der observeres under tilbagefald. Identifikation af patientspecifikke behandlingsresponser og dannelsen af behandlingsresistens in vitro fremmer præcisionsmedicin inden for ovariecancerforskning21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.K. er opført som opfinder på et patent relateret til et medium for organoider af kræft i æggestokkene. F.T. modtog forskningsmidler, advisory board, honorarer og rejseudgifter fra AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics og Tesaro/GSK. S.M. modtog forskningsmidler, advisory board, honorære eller rejseudgifter: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Acknowledgments
Studiet er finansieret af det tyske kræftforskningscenter DKTK, partnersite München, et partnerskab mellem DKFZ og University Hospital LMU München. Undersøgelsen er også støttet af det tyske kræfthjælpstilskud (#70113426 og #70113433). Paraffinindlejring af væv og organoider er blevet udført på kernefaciliteten ved Institut for Anatomi, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, LMU München, München. Confocal Imaging er blevet udført på Core facilitet Bioimaging på Biomedical Center (BMC). Forfatterne takker Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink og Martina Rahmeh for teknisk hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021).
- Thermo Scientific. Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
