Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optagelse og analyse af multimodal neuronal ensembledynamik i stor skala på CMOS-integreret mikroelektrodearray med høj densitet

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66473
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden
* These authors contributed equally

Summary

Her anvender vi HD-MEA til at dykke ned i beregningsdynamikken i store neuronale ensembler, især i hippocampale, olfaktoriske pærekredsløb og humane neuronale netværk. Indfangning af rumlig tidsmæssig aktivitet kombineret med beregningsværktøjer giver indsigt i neuronal ensemblekompleksitet. Metoden øger forståelsen af hjernens funktioner og identificerer potentielt biomarkører og behandlinger for neurologiske lidelser.

Abstract

Store neuronale netværk og deres komplekse distribuerede mikrokredsløb er afgørende for at generere opfattelse, kognition og adfærd, der stammer fra mønstre af rumlig neuronal aktivitet. Disse dynamiske mønstre, der stammer fra funktionelle grupper af sammenkoblede neuronale ensembler, letter præcise beregninger til behandling og kodning af multiscale neurale oplysninger og derved driver højere hjernefunktioner. For at undersøge beregningsprincipperne for neurale dynamikker, der ligger til grund for denne kompleksitet og undersøge multiskalavirkningen af biologiske processer inden for sundhed og sygdom, er store samtidige optagelser blevet instrumentelle. Her anvendes et mikroelektrodearray med høj densitet (HD-MEA) til at studere to modaliteter af neural dynamik - hippocampus og olfaktoriske pærekredsløb fra ex-vivo musehjerneskiver og neuronale netværk fra in vitro-cellekulturer af humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). HD-MEA-platformen med 4096 mikroelektroder muliggør ikke-invasive, multi-site, label-fri optagelser af ekstracellulære affyringsmønstre fra tusindvis af neuronale ensembler samtidigt ved høj rumlig tidsmæssig opløsning. Denne fremgangsmåde muliggør karakterisering af flere elektrofysiologiske netværksdækkende funktioner, herunder enkelt/-multi-enhed spiking aktivitetsmønstre og lokale feltpotentielle svingninger. For at undersøge disse multidimensionelle neurale data har vi udviklet flere beregningsværktøjer, der inkorporerer maskinlæringsalgoritmer, automatisk hændelsesdetektion og klassificering, grafteori og andre avancerede analyser. Ved at supplere disse beregningsmæssige pipelines med denne platform leverer vi en metode til at studere den store, multiscale og multimodale dynamik fra cellesamlinger til netværk. Dette kan potentielt fremme vores forståelse af komplekse hjernefunktioner og kognitive processer inden for sundhed og sygdom. Forpligtelse til åben videnskab og indsigt i storskala beregningsmæssig neural dynamik kan forbedre hjerneinspireret modellering, neuromorfisk computing og neurale læringsalgoritmer. Desuden kan forståelse af de underliggende mekanismer for svækkede neurale beregninger i stor skala og deres indbyrdes forbundne mikrokredsløbsdynamik føre til identifikation af specifikke biomarkører, hvilket baner vejen for mere nøjagtige diagnostiske værktøjer og målrettede terapier til neurologiske lidelser.

Introduction

Neuronale ensembler, ofte kaldet cellesamlinger, er afgørende for neural kodning, hvilket letter indviklede beregninger til behandling af multiscale neural information 1,2,3. Disse ensembler understøtter dannelsen af ekspansive neuronale netværk og deres nuancerede mikrokredsløb4. Sådanne netværk og deres oscillerende mønstre driver avancerede hjernefunktioner, herunder opfattelse og kognition. Mens omfattende forskning har udforsket specifikke neuronale typer og synaptiske veje, er en dybere forståelse af, hvordan neuroner sammen danner cellesamlinger og påvirker rumlig tidsmæssig informationsbehandling på tværs af kredsløb og netværk, stadig undvigende5.

Akutte, ex-vivo hjerneskiver er afgørende elektrofysiologiske værktøjer til undersøgelse af intakte neurale kredsløb, der tilbyder en kontrolleret indstilling til sonde oscillerende aktivitetsmønstre af neurale funktioner, synaptisk transmission og tilslutningsmuligheder med konsekvenser i farmakologisk test og sygdomsmodellering 6,7,8. Denne undersøgelsesprotokol fremhæver to vigtige hjernekredsløb - hippocampal-kortikal (HC) involveret i lærings- og hukommelsesprocesser 9,10 og den olfaktoriske pære (OB), der er ansvarlig for lugtdiskrimination 11,12,13. I disse to regioner genereres nye funktionelle neuroner kontinuerligt af voksen neurogenese gennem hele livet i pattedyrhjerner14. Begge kredsløb demonstrerer multidimensionelle dynamiske neurale aktivitetsmønstre og iboende plasticitet, der deltager i omledning af det eksisterende neurale netværk og letter alternative informationsbehandlingsstrategier, når det kræves15,16.

Akutte, ex-vivo hjerneskivemodeller er uundværlige for at dykke ned i hjernens funktionalitet og forstå sygdomsmekanismer på mikrokredsløbsniveau. Imidlertid tilbyder in vitro-cellekulturer afledt af humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) neuronale netværk en lovende vej til translationel forskning, der problemfrit forbinder resultater fra dyreforsøg med potentiel human klinisk behandling17,18. Disse menneskecentrerede in vitro-assays tjener som en pålidelig platform til vurdering af farmakologisk toksicitet, muliggør præcis lægemiddelscreening og fremmer forskning i innovative cellebaserede terapeutiske strategier19,20. I erkendelse af iPSC-neuronmodellens centrale rolle har vi dedikeret det tredje modul i denne protokolundersøgelse til grundigt at undersøge de funktionelle egenskaber ved dets afledte netværk og finjustere de tilknyttede cellekulturprotokoller.

Disse elektrogene neurale moduler er blevet almindeligt undersøgt ved hjælp af teknikker som calcium (Ca2+ billeddannelse), patch-clamp optagelser, og low-density mikroelektrode arrays (LD-MEA). Mens Ca2+ billeddannelse tilbyder kortlægning af enkeltcelleaktivitet, er det en cellemærkningsbaseret metode, der hindres af dens lave tidsmæssige opløsning og udfordringer i langsigtede optagelser. LD-MEA'er mangler rumlig præcision, mens patch-clamp, der er en invasiv single-site teknik og besværlig, ofte giver en lav succesrate 21,22,23. For at løse disse udfordringer og effektivt undersøge netværksdækkende aktivitet er store samtidige neurale optagelser opstået som en central tilgang til forståelse af beregningsprincipperne for neurale dynamikker, der ligger til grund for hjernens kompleksitet og deres konsekvenser for sundhed og sygdom24,25.

I denne JoVE-protokol demonstrerer vi en storstilet neural optagelsesmetode baseret på MEA (HD-MEA) med høj densitet til opsamling af spatiotemporal neuronal aktivitet på tværs af forskellige hjernemodaliteter, herunder hippocampus og olfaktoriske pærekredsløb fra ex-vivo musehjerne akutte skiver (figur 1A-C) og in vitro humane iPSC-afledte neuronale netværk (figur 1D-E), tidligere rapporteret af vores gruppe og andre kolleger26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, der er bygget på CMOS-teknologi (complementary-metal-oxide-semiconductor), kan prale af on-chip-kredsløb og forstærkning, hvilket muliggør optagelser på under millisekunder på tværs af en 7 mm2 array-størrelse36. Denne ikke-invasive tilgang fanger multi-site, etiketfri ekstracellulære affyringsmønstre fra tusindvis af neuronale ensembler samtidigt ved hjælp af 4096 mikroelektroder ved en høj spatiotemporal opløsning, hvilket afslører den indviklede dynamik i lokale feltpotentialer (LFP'er) og multiunit spiking aktivitet (MUA)26,29.

I betragtning af omfanget af de data, der genereres af denne metode, er en sofistikeret analytisk ramme afgørende, men indebærer udfordringer37. Vi har udviklet beregningsværktøjer, der omfatter automatisk hændelsesregistrering, klassificering, grafteori, maskinlæring og andre avancerede teknikker (figur 1F)26,29,38,39. Ved at integrere HD-MEA med disse analytiske værktøjer udtænkes en holistisk tilgang til at undersøge den indviklede dynamik fra individuelle cellesamlinger til bredere neurale netværk på tværs af forskellige neurale modaliteter. Denne kombinerede tilgang uddyber vores forståelse af beregningsdynamikken i normale hjernefunktioner og giver indsigt i anomalier til stede under patologiske tilstande28. Desuden kan indsigt fra denne tilgang drive fremskridt inden for hjerneinspireret modellering, neuromorfisk computing og neurale læringsalgoritmer. I sidste ende er denne metode lovende med hensyn til at afdække kernemekanismerne bag neurale netværksforstyrrelser, potentielt identificere biomarkører og vejlede oprettelsen af præcise diagnostiske værktøjer og målrettede behandlinger for neurologiske tilstande.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de gældende europæiske og nationale regler (Tierschutzgesetz) og blev godkendt af den lokale myndighed (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).

1. Ex-vivo hjerneskiver fra hippocampus-kortikale og olfaktoriske pærekredsløb på HD-MEA

  1. Fremstilling af forsøgsopløsninger til skæring og registrering (figur 2A)
    1. På forsøgsdagen fremstilles 0,5 l højsaccharoseskæringsopløsning og 1 liter optagelsesopløsning af kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) (tabel 1A, B).
      1. Tilsæt alle faste kemikalier til en tør målekolbe, og fyld derefter en del af vejen med dobbeltdestilleret (dd) vand.
      2. Der tilsættesMgCl2 ogCaCl2 fra 1 M stamopløsninger, og derefter fyldes resten med dd vand. Begynd konstant omrøring med en magnetisk omrører, indtil synlige faste stoffer er opløst ~ 5 min.
    2. Brug et frysepunktsosmometer til at validere osmolariteten mellem 350-360 mOsm for skæreopløsningen med højt saccharoseindhold og 315-325 mOsm for aCSF-optagelsesopløsningen.
    3. Brug en pH-måler til at validere pH-værdien mellem 7,3-7,4 for højsaccharoseskæringsopløsningen og 7,25-7,35 for aCSF-registreringsopløsningen. Begynd kontinuerligt at boble med 95%O2 og 5% CO2.
    4. Skæreopløsningen med højt saccharoseindhold anbringes på is i mindst 30 minutter, før den skæres i skiver, og boblen kontinuerligt med 95 %O2 og 5 % CO2.
    5. Efter 10 minutters carbogenation fyldes et 50 ml bægerglas med 30 ml skæreopløsning og opbevares i fryseren (-20 °C) i 20-30 minutter eller indtil det er delvist frosset.
      BEMÆRK: Alle opløsninger skal tilberedes friske til hvert forsøg. Det dd-vand, der anvendes her, er autoklaveret ultrarent vand, der opbevares ved stuetemperatur (RT). Mængden af forberedt opløsning skal skræddersys til det specifikke undersøgelsesspørgsmål.
  2. Forberedelse af hjerneskivearbejdsområdeområder (figur 2A)
    1. Bring dyret ind i forsøgsrummet.
      BEMÆRK: I denne protokol blev C57BL/J6 hunmus i alderen 8-16 uger anvendt som tidligere beskrevet 26,29,32. Dyret bør have lov til at akklimatisere sig i mindst 30 minutter efter transporten. Langdistanceoverførsler (dvs. mellem institutter) bør undgås samme dag som forsøget. Dyrets alder, køn og stamme skal bestemmes ud fra det specifikke undersøgelsesspørgsmål.
    2. Mens dyret akklimatiserer, og opløsningen med højt saccharoseindhold køler ned, skal du placere de nødvendige værktøjer i hvert udpeget arbejdsområde (se materialetabellen).
    3. Forbered arbejdsområdet til gendannelse og vedligeholdelse af hjerneskive. Skivegenvindingskammeret fyldes med carbogenated aCSF-optageopløsning, og kammeret anbringes i vandbadet indstillet til 32 °C. Oprethold kontinuerlig carbogenation gennem hele eksperimentet.
    4. Forbered arbejdsområdet til forberedelse af hjerneskive. Opsæt vibratomet - placer klingen i vibratomknivholderen, og kalibrer vibratomet til de korrekte indstillinger (klingens kørehastighed: 0,20 mm/s, højdeamplitude: 95 μm, klingevinkel: 45°). Fyld vibratomisbakken med is og bufferbakken med en skæreopløsning med højt saccharoseindhold, og begynd at karbogenere opløsningen i bufferbakken.
    5. Forbered arbejdsområdet til hjerneforberedelse. Fyld petriskålen med 150 mm glas med is og læg en 90 mm plastkulturskål med filterpapir i. Fyld plastkulturskålen med en skæreopløsning med højt saccharoseindhold, og begynd at karbogenere. Tilsæt en dråbe superlim til den afkølede prøveplade og fastgør agaroseformen.
      BEMÆRK: Agaroseskimmel fremstilles mindst dagen før med 3% agarose i vand i en brugerdefineret musehjerneform.
    6. Til sidst skal du forberede hjerneekstraktionsarbejdsområdet. Dæk aluminiumsfolie med silkepapir, hent et 50 ml bægerglas indeholdende sjap med høj saccharose-skæreopløsning, og tilsæt isofluran til anæstesikammeret.
      BEMÆRK: Anæstesi vil blive tilføjet til anæstesikammeret ~ 1 min før dyreplacering. Et 50 ml bægerglas med 30 ml sjap med høj saccharoseskæring fjernes fra -20 °C fryser ~2 minutter før halshugning.
  3. Ekstraktion og udskæring af musehjerne
    BEMÆRK: Hele denne procedure skal udføres så hurtigt som muligt for at undgå manglende iltning til hjernen. Hjernefjernelse bør kun tage 1-2 minutter fra halshugning til nedsænkning i høj-saccharose skæreopløsning slush.
    1. Bedøv dyret med den passende dosis isofluran (0,5 ml / 1 L anæstesikammer). Bestem dybden af anæstesi gennem en poteklemme; Bekræft manglen på poteudtagningsrefleks, inden du fortsætter.
    2. Overfør dyret til silkepapiret i hjernens ekstraktionsarbejdsområde og halshug det med kirurgisk saks.
    3. Indsæt irissaks i hjernestammen, og hold den nederste saks flush med calvaria. Skær langs sagittal sutur, indtil koronal sutur er nået. Placer irissaks i øjenhuler og skær gennem den metopiske sutur. Brug buede tang til at flytte siderne af calvaria ned og udsætte hele hjernen.
      BEMÆRK: Vær forsigtig med både irissaks og tang for ikke at punktere hjernen, mens du skærer gennem suturerne.
    4. Skub hjernen med den stumpe kant af de buede pincet ind i 50 ml bægerglasset med 30 ml højsaccharoseskæreopløsning. Lad det forblive i 1 min.
    5. Overfør hjernen til 90 mm plastkulturskålen med kølet carbogeneret skæreopløsning i hjernens forberedelsesarbejdsområde. Orienter hjernen til positionering i agaroseformen.
    6. Tilsæt en lille prik superlim til den rostrale ende af agaroseformen. Placer hjernen i formen med spatelen. Sørg for, at hjernen er placeret med den dorsale side nedad for vandret udskæring.
      BEMÆRK: Placeringen af lim i formen ændres afhængigt af interesseområdet (ROI). For hippocampal-kortikale (HC) og olfaktoriske pære (OB) skiver skal du sørge for, at OB er stabiliseret, og hjernens sider forbliver fri for lim. For meget lim vil påvirke skærekvaliteten og forårsage tårer under vibratomskæring.
    7. Flyt prøvepladen ind i bufferbakken, flyt bladet på plads med den korrekte vinkel, og øg bufferbakkens højde for at bringe bladet så tæt som muligt på hjernen.
    8. Skær med 0,20 mm/s hastighed 300 μm intervaller af HC- og OB-væv, og saml dem derefter efter hver udskæringsrunde med en Pasteur-pipette af glas.
    9. Lad skiverne stå i det aCSF-fyldte genvindingskammer i et 32 °C vandbad i 45 minutter efterfulgt af 1 time ved RT. Sørg for, at skiverne ikke overlapper hinanden og udsættes helt for den karbogenerede opløsning.
      BEMÆRK: Sørg for at opretholde kontinuerlig karbogenation af alle opløsninger og eventuelle nævnte kamre, der indeholder opløsningen. En trykregulator kan anvendes til at opretholde ensartet carbogenation.

2. In-vitro humant iPSC-baseret neuronalt netværk på HD-MEA

BEMÆRK: Alle iPSC-neuroner, der anvendes i denne undersøgelse, opnås kommercielt (se materialetabel). Disse humane celler differentierede sig fra stabile iPS-cellelinjer, der blev afledt af humant perifert blod eller fibroblaster.

  1. Belægning af HD-MEA-chips til in vitro humane iPSC-cellekulturer (figur 2B)
    1. Placer HD-MEA-chippen på optagelsesplatformen, fyld beholderen med PBS, og test chippen inden belægning. Start Brainwave-software. Vælg Filer > ny optagelsessession. Indstil optagelsesparametrene til at have en optagefrekvens på 50 Hz og en samplingfrekvens på 18 kHz / elektrode. Skift forstærkerforskydningen for at kalibrere chippen. Se tip til fejlfinding i tabel 2 .
      BEMÆRK: Parametrene for registreringsfrekvens og samplingfrekvens afhænger af datatype og individuelle systemkrav.
    2. Steriliser og prækonditioner HD-MEA'er.
      1. Under emhætten tørres chippen og glasringen af med væv fugtet med 96% ethanol (EtOH), placer derefter hver enhed i en steril 100 mm x 20 mm petriskål og fyld MEA-beholderen med 70% EtOH i 20 minutter.
      2. Opsug EtOH og vask reservoiret med sterilt, filtreret dd-vand 3 gange. Der tilsættes 1 ml prækonditioneringsmedier, og der inkuberes natten over ved 37 °C og 5 % CO2.
        BEMÆRK: Forkonditioneringsmedier skal være en saltbaseret løsning for at gøre HD-MEA-overfladen mere hydrofil. Dette kan omfatte tidligere forberedte BrainPhys (BP) komplette medier (ikke >3 måneder gamle) (tabel 1C).
    3. Frakke HD-MEA'er. Den næste dag, aspirer prækonditioneringsmedier. Tilsæt 1 ml 0,1 mg / ml poly-dl-ornithin (PDLO) for at belægge hele det aktive område. Der inkuberes ved 37 °C natten over i en inkubator.
    4. Forbered og varm medier til RT. Protokollerne her udnytter funktionelle humane iPSC-neuroner fra to kommercielle kilder; Således varierer mediekomponenter for hver leverandør. En protokol er beskrevet i (tabel 1C, D) .
    5. Aspirer PDLO, vask 3 gange med dd-vand og lad spånerne tørre under emhætten i 10 min.
    6. Fyld en 35 mm x 10 mm petriskål med sterilt, filtreret dd-vand og placer den ved siden af chippen for at opretholde korrekt fugtighed og undgå fordampning af de frøede celler i de næste trin.
  2. Plating og vedligeholdelse af humane iPSC-neuroner i HD-MEA'er (figur 2B)
    1. Optø og fortynd celler til ønskede celler pr. mikroliterkoncentration (dvs. 1000 celler / μL for at opnå 50.000 celletæthed i et fald på 50 μL på HD-MEA) (tabel 1C).
    2. Cellesuspensionen pipetteres på overfladen af chippens aktive område ved hjælp af medier med høj laminindotting (tabel 1D).
    3. Der inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 45-60 min.
    4. Fyld forsigtigt 2 ml medier i HD-MEA-beholderen (tabel 1C).
    5. Udfør 100 % medieskift på dag 1 (DIV1) efter seedning ved hjælp af RT-medier (tabel 1C). Skift 50% af medierne hver 3-4 dage. Hold HD-MEA'er inkuberet ved 37 °C med 5% CO2 under hele eksperimentet.
      BEMÆRK: Afpipette forsigtigt for at undgå at løsne cellerne. Kontroller mediets farve for eventuel forurening. Intervallet og mængden af medieskift kan bestemmes af individuelle undersøgelsesspørgsmål eller cellebehov/specifikationer.
    6. Valgfrit: Kontroller udviklingen i cellekulturvækst mellem DIV4-DIV8 under et opretstående differenskontrastmikroskop (DIC) efter rengøring af scenen med >70% EtOH.

3. Ex-vivo og in vitro store neurale optagelser med HD-MEA'er

  1. Forberedelse af arbejdsområdet til registrering af hjerneskive (figur 2A)
    1. Mens hjerneskiver er ved at komme sig, skal du placere de nødvendige værktøjer i hvert udpeget arbejdsområde (se materialetabel).
      BEMÆRK: Hovedsystemopsætningen skal optimeres og testes i god tid før hjerneskiveforsøgsdagen. Perfusionssystemet (indløbsledninger, pumpeudløbsledninger, slanger og jordforbindelse) skal testes med PBS eller aCSF og en HD-MEA på optageplatformen for at sikre et rent signal, øget signalstøjforhold og mangel på perfusionsstøj.
    2. Overtræk HD-MEA-chippen med 0,1 mg/ml PDLO for at forbedre vævschipkoblingen og inkubere ved 37 °C i 20 minutter.
    3. Under chipinkubation skal du fylde det tyngdekraftsbaserede perfusionssystem og linjer med optagelse af aCSF. Sørg for kontinuerlig carbogenation af perfusionssystemet. Indstil en flowhastighed på 4,5 ml/min og en temperatur på 37 °C.
    4. Placer HD-MEA-chippen på optagelsesplatformen, fyld reservoiret med aCSF, test perfusionssystemet, og fejlfind eventuel resterende systemstøj.
      1. Start Brainwave-software. Vælg Filer > ny optagelsessession. Indstil optagelsesparametrene til at have en optagefrekvens på 1 Hz og en samplingfrekvens på 14 kHz / elektrode. Skift forstærkerforskydningen for at kalibrere chippen. Se tip til fejlfinding i tabel 2 .
        BEMÆRK: Parametrene for registreringsfrekvens og samplingfrekvens afhænger af datatype og individuelle systemkrav.
    5. Sørg for, at optagelsesområdet er mørkt gennem et rumbelysningssystem eller et skyggefuldt bur på det optiske bord.
    6. Juster stereomikroskopet med HD-MEA-chipbeholderen og det aktive område til billedoptagelse.
    7. Placer ankeret i spånbeholderen for at afbalancere.
      BEMÆRK: Anker er en specialfremstillet platinharpe med minimale ledninger for at fremme iltning; Nogle kommercielle er dog tilgængelige.
    8. Tilsæt farmakologiske forbindelser til de relevante perfusionsrør.
      BEMÆRK: I denne protokol blev både spontane og 100 μM 4-aminopyridin (4-AP) farmakologisk inducerede optagelser opnået som tidligere beskrevet. Farmakologiske forbindelser kan skræddersys til det specifikke undersøgelsesspørgsmål.
    9. I arbejdsområdet med forberedelse af hjerneskive placeres en ny 90 mm plastkulturskål i en 150 mm petriskål af glas. Tilføj aCSF og begynd carbogenating.
  2. Optagelser i hele kredsløbet fra HC- og OB-skiver ved hjælp af HD-MEA'er
    BEMÆRK: Skivekobling skal udføres så hurtigt som muligt for at undgå manglende iltning til skiven. Kobling bør kun tage ~ 1 min fra den indledende placering af den mikrodissekerede skive på chipets aktive område til den endelige perfusionssystemstart.
    1. Fjern skiven fra hjerneskivens genvindingskammer med en glaspipette og læg den i en 90 mm plastkulturskål med kontinuerlig carbogenation. Brug et mikrodissektionsværktøj til at isolere HC eller OB fra det omgivende hjerneskivevæv.
    2. Flyt de isolerede HC- eller OB-akutskiver med en glaspipette ind i HD-MEA-beholderen. Juster forsigtigt skiven på MEA's aktive område med en fin pensel. Sug alle opløsninger fra HD-MEA-chippen godt med et aspirationssystem.
    3. Placer ankeret forsigtigt oven på skiven med pincet.
      BEMÆRK: Ankeret skal placeres uden skivebevægelse for at undgå tab af kobling.
    4. Tilsæt forsigtigt opløsning til chipbeholderen og start perfusionssystemet.
      BEMÆRK: Sørg for laminært flow fra perfusionsindløbet og pumpeudløbet for optimale registreringsparametre.
    5. Sørg for, at optagelsesområdet er tilstrækkeligt dæmpet gennem rumbelysningssystemet eller med et skyggefuldt bur på en optisk bordopsætning.
    6. Lad skiven akklimatisere sig i 10 minutter, før optagelser eller yderligere farmakologisk modulering påbegyndes.
    7. Start Brainwave-software. Vælg Filer > ny optagelsessession. Indstil optagelsesparametrene til at have en optagefrekvens på 1 Hz og en samplingfrekvens på 14 kHz / elektrode. Skift forstærkerforskydningen for at kalibrere chippen.
      BEMÆRK: Som angivet tidligere i punkt 3.1.4.1 skal du sørge for at anvende de samme registreringsparametre, når du udfører systemtest.
    8. Tryk på Optag for at starte anskaffelsen med de forudindstillede eksperimentelle betingelser.
    9. Umiddelbart efter den endelige optagelse skal du tage lysbilleddannelse af den akutte hjerneskive. Flyt skiven tilbage til skivens genvindingskammer, fjern alt organisk materiale, der er koblet til chippen, med en pensel, og fortsæt med den næste skive. HD-MEA'erne rengøres som beskrevet i pkt. 3.4.
  3. Forberedelse af menneskelige iPSC-optagelsesarbejdspladser og netværksdækkende optagelser på HD-MEA (figur 2B)
    BEMÆRK: Skift medie enten dagen før optagelsen eller umiddelbart efter human iPSC-optagelse (tabel 1C). I undersøgelser med de funktionelle neuroner blev medier skiftet hver 4. dag, og på 4, 8, 16 og 24 DIV-medier skiftes umiddelbart efter iPSC-optagelser.
    1. Sørg for et sterilt arbejdsmiljø ved at rengøre HD-MEA-opkøbsplatformen med >70% EtOH.
    2. Anbring forsigtigt en polydimethylsiloxan (PDMS)-basehætte med reference på HD-MEA-ringen under emhætten. Flyt HD-MEA-chippen til iPSC-optagelsesarbejdsområdet, og tilslut HD-MEA-chippen til anskaffelsesplatformen.
    3. Sørg for, at optagelsesområdet er tilstrækkeligt dæmpet gennem et rumbelysningssystem eller et skyggefuldt bur på et optisk bord.
    4. Lad HD-MEA-chippen ekvilibrere i 10 minutter, før optagelser eller yderligere farmakologisk modulering påbegyndes.
    5. Start Brainwave-software. Vælg Filer > ny optagelsessession. Indstil optagelsesparametrene til at have en optagefrekvens på 50 Hz og en samplingfrekvens på 18 kHz / elektrode. Skift forstærkerforskydningen for at kalibrere chippen.
      BEMÆRK: Som angivet tidligere i punkt 2.1.1 skal du sørge for at anvende de samme registreringsparametre, mens du udfører en systemtest før belægning og plettering.
    6. Registrer spontan affyringsaktivitet eller farmakologisk inducerede reaktioner fra det humane iPSC-netværk hver dag i forsøgsplanen (dvs. 4, 8, 16, 24 DIV'er).
      BEMÆRK: Lad ikke chippen forblive uden for inkubatoren i >30 minutter for at opretholde stabil temperatur og fugtighed og forhindre temperaturchok for celler.
    7. HD-MEA'er inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i løbet af eksperimentet.
    8. Efter eksperimentets afslutning fastgøres neuronnetværket på chips og pletter for yderligere optisk billeddannelse eller rengøres HD-MEA'erne direkte, som beskrevet i trin 3.4.
  4. Rengøring af HD-MEA-chips
    1. Efter forsøget kasseres opløsningen i henhold til korrekt bortskaffelse af affald og skylles med dd-vand.
    2. Tilsæt det valgte vaskemiddel, rengør det aktive område og hele beholderen med en Q-tip, og kassér vaskemidlet. Påfyld vaskemiddel, inkuber i 20 min, og kassér derefter vaskemidlet.
    3. Skyl grundigt med vand af laboratoriekvalitet. Skyl derefter 3-4 gange med dd-vand.
    4. Brug lufttrykket til at tørre HD-MEA-chippen grundigt.

4. Analyse af store neurale optagelser fra HD-MEA'er

BEMÆRK: Mens trin 4.1 er Brainwave-softwarespecifikt, kan trin 4.2 ændres baseret på hver brugers kommercielt tilgængelige HD-MEA-enhedstype.

  1. Forbehandling af rådata og hændelsesregistrering
    1. Åbn en optaget rådatafil (.brw) i Brainwave-softwaren. Vælg Analyse > LFP-registrering eller Spike-registrering.
      BEMÆRK: LFP Detection anvender IIR-filtrering med et lavt pass 4. ordens Butterworth-filter (1-100 Hz). Hårde tærskelalgoritmer inkluderer en høj tærskel på 150 μV, en lav tærskel på -150 μV, et energivindue mellem 70-120 ms, en ildfast periode på 10 ms og en maksimal begivenhedsvarighed på 1 s. Single og MUA Spike Detection anvender IIR-filtrering med et højt pass 4. ordens Butterworth-filter (300-3500 Hz). En PTSD-algoritme anvendes med en standardafvigelsesfaktor på 8, en maksimal levetidsperiode på 2 ms og en ildfast periode på 1 ms.
    2. For HC- og OB-kredsløbsoptagelser skal du tilføje indstillingen Avanceret arbejdsområde i den registrerede hændelsesfil (.bxr) for at importere det strukturelle lysbillede, der er taget fra stereomikroskopet. Når du undersøger store HC-kredsløb, skal du oprette strukturelle lag, der indeholder dentate gyrus (DG), hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), entorhinal cortex (EC) og perirhinal cortex (PC). Når du undersøger OB-kredsløb i stor skala, skal du oprette strukturelle lag, der indeholder det olfaktoriske nervelag (ONL), glomerulære lag (GL), eksterne plexiformlag (EPL), mitralcellelag (MCL) og granulatcellelag (GCL). Overvej EPL og MCL som projektionslaget (PL), herunder den olfaktoriske cortex (OCx).
  2. Databehandling med en brugerdefineret Python-beregningspipeline
    1. Denoising
      1. Læs .bxr-filen ved hjælp af et specialskrevet Python-script 26,29,32 og h5py 3.6.0 python-pakke.
      2. Udtræk spidstog vedrørende iPSC-netværksoptagelser og LFP-begivenhedstog vedrørende HC- og OB-hjerneskivekredsløbsoptagelser.
      3. Karakteriser hændelser med et samlet antal aktive elektroder mindre end 0,1% eller 10% af de gennemsnitlige aktive elektroder pr. Gennemsnitlig hændelse eller detekterede hændelser, der falder uden for et statistisk rimeligt affyringshastighedsområde som tilfældige hændelser, og fjern dem. Anvend desuden grænseværdier for amplitude og hændelsesvarighed.
        BEMÆRK: For affyringshastighedsområdet overvejes 0,1-15 spikes / s og 0,1-60 LFP begivenheder / min. Dette er eksempler på tærskelværdier for satser, der bruges til de analyserede datasæt. Tærsklerne for hastighed, amplitude og varighed afhænger af individuelle data.
      4. Gem de resulterende hændelsestogdata med de ledsagende spatiotemporale oplysninger i .npy-filformat.
    2. Rastergrammer
      1. Læs filtrerede .npy- og .bxr-filer, og generer et rasterplot ved hjælp af Matplotlib-pyplotfunktionen (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. For hjerneskiveoptagelser med lagspecificitet skal du desuden sortere og gruppere elektrode-id'erne baseret på de lag, der er produceret i trin 4.1.2.
    3. Gennemsnitlig fyringsaktivitet
      1. Behandl tidsseriedataene fra .bxr-filen, og beregn hver elektrodes gennemsnitlige affyringshastighed (antal hændelser/registreringstid).
      2. Konstruer en datamatrix, hvor rækkerne og kolonnerne repræsenterer koordinaterne for elektroder i HD-MEA 64 x 64-arrayet, hvor hver matrixværdi angiver den gennemsnitlige affyringshastighed.
      3. Brug et plottebibliotek som Matplotlibs imshow eller Seaborns varmekortfunktioner i Python.
      4. Brug det 'varme' farvekort her, og skab et informativt varmekort, der visuelt indkapsler den rumlige fordeling af gennemsnitlige affyringshastigheder på tværs af elektrodearrayet.
    4. Repræsentative bølgeformspor
      1. Læs tidsseriedata fra .brw-filen, og generer en bølgeformsporing ved hjælp af Matplotlib pyplot-funktionen. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Indtast ønsket elektrode-id, tidsbeholder og frekvensbånd for en repræsentativ bølgeformsporing. Frekvensbånd, der er defineret i disse analyser, omfatter lavfrekvente LFP-svingninger (1-100 Hz) med båndpasfiltrerede δ-, θ-, β- og γ frekvensbånd; skarpe bølgekrusninger (SWR) (140-220 Hz); og højfrekvent single og MUA (300-3500 Hz). Frekvensbåndene δ, θ, β og γ er henholdsvis 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz og 35-100 Hz.
    5. Effektspektral tæthed
      1. Læs tidsseriedata fra .brw-filen, og beregn periodogrammerne for at skelne de dominerende frekvenser, der ligger til grund for den oscillerende aktivitet inden for hver tidsserie.
      2. Konstruere pseudofarvespektrogrammer af frekvens-tidsdynamikken.
        BEMÆRK: Spektre beregnes ved hjælp af Welchs metode ved at bruge Fast Fourier Transform af registrerede LFP'er til at estimere spektral effekttæthed41.
      3. Indtast ønsket elektrode-id, tidsbeholder og frekvensbånd til et spektraldensitetskort. De frekvensbånd, der er defineret i disse analyser, omfatter dem, der er beskrevet i trin 4.2.4.
    6. Funktionelle tilslutningsmuligheder
      1. For hjerneskivekredsløbsoptagelser skal du følge trin 4.2.6.2-4.2.6.4.
      2. Aflæs tidsseriedata fra .brw-filen, og beregn krydskovariansen mellem par aktive elektroder i 64 x 64-arrayet, der anvender Pearsons korrelationskoefficient (PCC)42.
      3. Tilpas en vektor autoregressiv model til tidsserien ved hjælp af Multivariate Granger kausalitet for at kvantificere indflydelsen af en tidsserie på en anden.
      4. Anvend DTF (Directed Transfer Function) til at vurdere retningsbestemt informationsstrøm inden for de korrelerede links.
        BEMÆRK: Funktionel forbindelse i det flerlagede netværk etableres ved at indstille en korrelationsværditærskel baseret på dem over middelværdien og to standardafvigelser for alle krydskovariansværdier43,44.
      5. Følg trin 4.2.6.6-4.2.6.8 for iPSC-optagelse.
      6. Læs spiketrains-data fra .bxr-filen, og beregn en 64x64-matrix af PCC-korrelationskoefficienterne mellem alle kombinationer af binned spike-tog ved hjælp af spike_train_correlation funktioner (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
        BEMÆRK: Funktionel forbindelse i netværket med flere lag etableres ved at indstille en korrelationsværditærskel baseret på dem over middelværdien og to standardafvigelser for alle krydskovariansværdier.
      7. Desuden skal du implementere filtreringsprocedurer for rumlige og tidsmæssige filtre (STF) og afstandsafhængige latenstærskler (DdLT) på forbindelsesmatrixen for at eliminere potentielle parrede forbindelser, der overstiger den maksimale udbredelseshastighed (indstillet til 400 mm/s)45.
      8. Udtræk negative toppe fra resulterende krydskorrelationsmatricer med filtrerings- og tærskeloperationer for at identificere de hæmmende forbindelser ved hjælp af filtreret og normaliseret krydskorrelationshistogram (FNCCH) algoritme45.
      9. Transformér hver forbindelsesmatrix til en dynamisk graffil (.gexf).
    7. Kort over netværksforbindelse
      1. Åbent datalaboratorium i Gephi program 9.2 version (https://gephi.org) for den dynamiske graf til at plotte specifikke tidsbakker.
      2. Anvend Geolayout i layoutvinduet til rumlig kortlægning.
      3. Placer parameterbegrænsninger på Gradinterval og Kantvægt til sammenligning.
      4. Tildel nodalfarve, kantstørrelse og gradstørrelse for bedre visualisering.

Representative Results

Multimodel spatiotemporal kortlægning og ekstraktion af oscillerende fyringsfunktioner
For at kvantificere netværksdækkende LFP- og spike-hændelser, der opstod fra dynamiske neuronale ensembler, undersøgte vi synkrone store affyringsmønstre i HC- og OB-kredsløb og humane iPSC-netværk. Registrerede hjerneskivekredsløb fra trin 3.2 og optagede iPSC-netværk fra trin 3.3 blev analyseret i henhold til trin 4.1-4.2 i protokollen. For det første blev hændelsesdetektering og denoising udført for alle registrerede datasæt og løst regionalt i henhold til kredsløbsspecifikationer. Dernæst blev topografisk pseudo-farve rumlig kortlægning af gennemsnitlige storskala LFP og spike fyringsmønstre, rastergrammer af detekterede begivenheder og repræsentative 5-s spor af filtrerede bølgeformer plottet (figur 3 A-I). Topografisk pseudofarvekortlægning af store LFP- og spike-affyringshastighedsmønstre blev overlejret på de respektive mikroskopoptagne optiske billeder af HC (figur 3A), OB (figur 3B) og humant iPSC-neuronalt netværk (figur 3C). Dette muliggør undersøgelse af individuelle kredsløb og netværksbaserede oscillerende mønstre og reaktioner. HC- og OB-rastergrammer indeholder registrerede LFP-hændelsestal sorteret over DG-, Hilus-, CA3-, CA1-, EC- og PC-lagene i HC-kredsløbet og ONL-, OCx-, GL-, PL- og GCL-lagene i OB-netværket over en 60-s tidsbeholder (figur 3D, E). Det menneskelige iPSC-rastergram viser synkront registrerede spidshændelser i det sammenkoblede dyrkede netværk over en tidsbeholder på 20 s (figur 3G). Dernæst viser 5s repræsentative hændelsesspor fra store HD-MEA-optagelsessteder en række registrerede oscillerende frekvenser i HC (dvs. valgt elektrode i CA3) (figur 3G) og OB (dvs. udvalgt elektrode i GL) (figur 3H) kredsløb og multiunit spike bursting aktivitet i det menneskelige iPSC-netværk fra fire udvalgte aktive elektroder i arrayet (figur 3I). Disse eksemplariske signaler viser biosignalsignaturer, herunder lavfrekvente LFP-svingninger (1-100 Hz) med båndpasfiltrerede δ-, θ-, β- og γ frekvensbånd; skarpe bølgekrusninger (SWR) (140-220 Hz); og højfrekvent single og MUA (300-3500 Hz). Endelig blev effektspektraltæthedsanalyse (PSD) anvendt til samtidig at kvantificere et specifikt oscillerende bånds effektstyrke i det sammenkoblede HC- og OB-kredsløb registreret fra HD-MEA (figur 3J, K).

Multimodal netværksdækkende funktionel Connectome
For at udlede den store forbindelse mellem flerlagede neurale netværk fra samtidige affyringsmønstre af samtidigt aktive neuronale ensembler blev krydskovariansen mellem par aktive elektroder i detekterede hændelser beregnet i henhold til trin 4.2.6 i protokollen. Her blev korrelationskoefficienten sorteret baseret på lag i HC- og OB-kredsløbet eller usorteret i iPSC-netværket og derefter gemt i en symmetrisk matrix. Funktionelle forbindelser af HC- og OB-kredsløb blev genereret ved at anvende Multivariate Granger-kausalitet og rettet overførselsfunktion (DTF) for at kvantificere indflydelsen af en tidsserie på en anden og vurdere den retningsbestemte informationsstrøm inden for de korrelerede forbindelser i de forskellige netværk. Connectome-kortlægning af HC (figur 4A) og OB (figur 4B) og netværksvisualisering blev udført ved hjælp af Gephi-programmet 9.2-version (https://gephi.org). Lignende parameterbegrænsninger blev placeret på de funktionelle links for at sammenligne HC- og OB-hjerneskivekredsløbene og illustrerede 100 s af den funktionelle forbindelse mellem detekterede LFP-hændelser. Noder skaleres efter gradstyrke med nodalfarve, der angiver lag- og linkfarve, der identificerer intra- og mellemlagsforbindelserne. Funktionelle forbindelser af humane iPSC-netværk blev genereret ved at anvende rumlige-tidsmæssige filtre (STF) og afstandsafhængige latenstærskler (DdLT) for at forbedre udvælgelsen af signifikante links og forfine identifikationen af meningsfulde forbindelser ved at anvende filtreret og normaliseret krydskorrelationshistogram (FNCCH) analyse. Connectome-kortlægning af humane iPSC-netværk på hele HD-MEA-chipvisualiseringen (figur 4C) udført ved hjælp af Gephi. Nodalfarve angiver excitatorisk eller hæmmende input, og linkfarve identificerer forbindelser.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over den eksperimentelle og beregningsmæssige platform på HD-MEA i stor skala. (A) Isometrisk skematisk repræsentation af vores multimodale biohybride neuroelektroniske platforme realiseret med CMOS-baseret HD-MEA til at fange neural dynamik fra HC, OB og humane iPSC neuronale kredsløb og netværk. (B) Skematisk arbejdsgang til udskæring af musehjerner og dens arbejdslandskab for at opnå HC- og OB-udsnit. (C) Topografiske repræsentationer af de store affyringsmønstre, der er registreret samtidigt fra hele HC- og OB-skiverne overlejret med de ekstraherede ekstracellulære bølgeformer til skiveoptiske billeder. (D) Skematisk gengivelse af iPSC neuronalt netværk opnået fra mennesker. (E) Fluorescensmikrografier, der viser cellulære c-fos og somatisk/dendritisk MAP-2 af hele det humane neuronale netværk på HD-MEA-chip (venstre) matchet med hele det gennemsnitlige affyringsaktivitetskort (højre). (F) Computational framework, herunder avanceret dataanalyse, konnektivitetskortlægning og AI-maskinlæringsværktøjer til analyse af multidimensionelle neurale data opnået fra storskalaoptagelser på HD-MEA'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Layout for ex-vivo hjerneskive og in vitro human iPSC-kulturforberedelse og optagelse arbejdsområder. (A) Skematisk arbejdsgang, der illustrerer opsætningen til forberedelse af HC- og OB-udsnit med de nødvendige værktøjer og udstyr i hvert arbejdsområde. B) Skematisk gengivelse af human iPSC-kultur, herunder de nødvendige værktøjer og anordninger. En komplet liste over materialer er inkluderet i trin 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 og materialetabellen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kortlægning og udtrækning af rumlige tidsmønstre for netværksdynamik. (A-C) Gennemsnitlige LFP- og spike rate-rumlige kort, beregnet over fem minutters optagelser, overlejret på mikroskopets lysbillede. (D-F) Rasterplot, der viser detekterede, denoiserede LFP-hændelser i en 60-sekunders datadelprøve og spidser i en 20-sekunders datadelprøve. (G-I) Repræsentativ bølgeformsporekstraktion fra et 5-sekunders segment af rasterplotdatadelprøven (fremhævet rødt i rasterplottet), vist som rå LFP-oscillerende bånd (1-100 Hz); δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) og γ (35-100 Hz) frekvensbånd; stålwirer (140-220 Hz); og højfrekvent enkelt- og MUA-spiking (300-3500 Hz). (J,K) Effektspektraltæthedskort over hurtige og langsomme oscillerende LFP'er (1-100 Hz) og SWR (140-220 Hz). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Organisering af multimodale netværksdækkende funktionelle forbindelser. (A-C) Gephi-kort, der illustrerer nodal funktionel forbindelse, hvor noder svarer til en af eksemplerne på farvebjælkeforklaringer (nedenfor), mens linkene (eller kanterne) er skraverede for at matche forbindelsesnoder. Eksempler på forklaringer for (A) HC-, (B) OB- og (C) iPSC-lag vises på et 64 x 64-system. HC- og OB-lag plottes over en tidsbeholder på 100 sekunder for effektivt at reducere antallet af synlige noder og links til visualiseringsformål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Løsninger til forberedelse af hjerneskiver og medier til iPSC neuronale kulturer. A) Skæreopløsning med højt saccharoseindhold til ex vivo-tilberedning af hjernesnitter. B) aCSF-registreringsopløsning til forberedelse og registrering af hjernesnit ex vivo. (C-D) Human neuronal iPSC Media Protocol, hvor (C) er BrainPhys komplette medier, der bruges til celleoptøning, HD-MEA-chipbelægning og dyrket HD-MEA-vedligeholdelse, og (D) prikmediet, der bruges til HD-MEA-cellebelægning. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Fejlfinding af almindelige problemer med optagelse af HD-MEA-optagelse. En liste over almindelige problemer, deres potentielle årsager og fejlfindingsløsninger relateret til HD-MEA-chips, optageplatform, systemstøj og software. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Den indviklede dynamik i spatiotemporal neuronal aktivitet, der stammer fra sammenkoblede neuronale ensembler, har længe været genstand for intriger inden for neurovidenskab. Traditionelle metoder, såsom patch-clamp, standard MEA og Ca2+ billeddannelse, har givet værdifuld indsigt i hjernens kompleksitet. De kommer dog ofte til kort med at fange den omfattende netværksdækkende beregningsdynamik 21,22,23. Den tekniske protokol for HD-MEA-platformen, som beskrevet i denne JoVE-undersøgelse, repræsenterer et betydeligt spring fremad, der giver et panoramaudsigt over neurale dynamikker på tværs af forskellige modaliteter, fra cellesamlinger til ekspansive netværk (dvs. akutte, ex-vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-netværk)26,29,30,32.

Akutte, ex-vivo musehjerneskiver har været et grundlæggende værktøj i neuronal forskning, hvilket letter molekylære undersøgelserog kredsløbsniveau 6,7. Udfordringen med at opretholde vævets levedygtighed har imidlertid været en vedvarende flaskehals. Protokollen beskrevet i denne undersøgelse introducerer kritiske ændringer for at optimere kvaliteten og levetiden af disse skiver for at udnytte deres fordele på HD-MEA-platformen. Denne protokol understreger vigtigheden af - i) At opnå skiveensartethed, hvor brugen af et vibratomt foretrækkes frem for en vævshakker på grund af dens præcision og minimerede vævsskade på trods af afvejningen af længere udskæringstider. ii) Sikring af konstant carbogenation gennem hele processen, fra ekstraktion til optagelse, for at opretholde vævets levedygtighed. iii) Regulering af temperaturen og tilladelse til tilstrækkelig restitutionstid før optagelse. iv) Brug af en agaroseblok eller skimmelsvamp til at stabilisere hjernen, forhindre rivning og minimere limkontakt. v) Opretholdelse af optimale strømningshastigheder for carbogeneret aCSF i HD-MEA-reservoiret for at sikre skivesundhed, samtidig med at problemer som afkobling, støj og afdrift undgås (tabel 2).

For både musehjerneskiver og humane iPSC-præparater er forbedring af elektrodevævsgrænsefladekobling altafgørende 30,46,47. Vores protokol understreger vigtigheden af at udnytte det vedhæftningsfremmende molekyle Poly-dl-ornithin (PDLO). Dette molekyle øger ikke kun overfladearealet til detektering af elektriske signaler, men øger også elektrisk ledningsevne46. Ved at gøre dette fremmer det cellulær vedhæftning, vækst og udvikling af funktionelle netværksegenskaber. En sådan optimering spiller en afgørende rolle i at øge effektiviteten af HD-MEA-platformen. Dette sikrer igen nøjagtig og konsistent analyse af mikroskala ex-vivo og in vitro connectomer og deres spatiotemporale affyringssekvenser. Især har PDLO vist sig at overgå andre substrater som polyethyleneimin (PEI) og poly-l-ornithin (PLO) i at fremme spontan fyringsaktivitet og lydhørhed over for elektriske stimuli i neuronale kulturer. Derudover er PDLO blevet brugt til overfladefunktionalisering på HD-MEA og vist sig at forbedre elektrode-skivekoblingsgrænsefladen og øge signal-støjforholdet i både OB- og HC-skiver26,29. Tilføjelsen af et specialbygget platinanker forstærker yderligere elektrode-skive-interfacekoblingen, hvilket fører til optagelser med et højere signal-støj-forhold.

Brugen af HD-MEA til både ex-vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-netværk introducerer en metode, der er dygtig til at udforske omfattende, multiscale og multimodal dynamik. Denne innovative tilgang medfører imidlertid betydelige udfordringer, især inden for datastyring 48,49,50,51. En enkelt HD-MEA-optagelse, der optages ved 18 kHz/elektrodesamplingfrekvens, genererer svimlende 155 MB/s data. Datamængden eskalerer hurtigt, når der tages højde for flere udsnit, forskellige farmakologiske tilstande eller længere registreringsperioder. En sådan tilstrømning af information kræver robuste lagringsinfrastrukturer og avancerede beregningsværktøjer til strømlinet behandling. HD-MEA-platformens evne til samtidig at indsamle data fra tusindvis af neuronale ensembler er både en velsignelse og en forhindring. Det giver suveræn indsigt i hjernefunktionernes beregningsdynamik, men det kræver også en raffineret analytisk ramme. I denne JoVE-protokol har vi givet eksempler på beregningsstrategier, herunder hændelsesregistrering i stor skala, klassificering, grafteori, frekvensanalyse og maskinindlæring. Disse metoder understreger den intensive indsats, der gøres for at tackle udfordringerne ved at analysere komplekse neurale data. Ikke desto mindre er der stadig betydelig plads til udvikling af mere avancerede beregningsværktøjer til at analysere disse multidimensionelle neurale datasæt. Bevæbnet med de rette værktøjer og metoder forstørres potentialet i HD-MEA-platformen, hvilket giver dyb indsigt i hjernefunktionernes forviklinger under både raske og patologiske tilstande.

I bund og grund tilbyder HD-MEA-platformen, når den integreres med de detaljerede protokoller og beregningsværktøjer, der diskuteres, en transformativ tilgang til forståelse af hjernens indviklede funktion. Ved at registrere storstilet, multiskala og multimodal dynamik giver det uvurderlig indsigt i processer som læring, hukommelse og informationsbehandling. Desuden har dets anvendelse i in vitro humane iPSC-netværk potentialet til at revolutionere lægemiddelscreening og personlig medicin. Selvom denne platform repræsenterer et betydeligt fremskridt inden for neurovidenskabelig forskning, er det imidlertid afgørende at anerkende og tackle de iboende tekniske udfordringer. Med løbende forbedringer og integration af avancerede beregningsværktøjer står HD-MEA-platformen klar til at indlede en ny æra med præcise diagnostiske værktøjer, identifikation af specifikke biomarkører og målrettede behandlinger for neurologiske lidelser.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af institutionelle fonde (DZNE), Helmholtz Association inden for Helmholtz Validation Fund (HVF-0102) og Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). Vi vil også gerne anerkende platformen for adfærdsmæssige dyreforsøg på DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther og Jens Bergmann) for deres støtte. Vi vil gerne anerkende, at en del af figur 1 blev oprettet ved hjælp af platformen BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150 mm Glass Petri Dish generic generic Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
0.22 μm Sterile Filter Unit  Assorted Assorted Assorted
90 mm Plastic Culture Dish TPP 93100 Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Agarose Roth 6351.5 Brain Preparation Workspace
Agarose Mold CUSTOM CUSTOM Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Aluminum Foil generic generic Brain Extraction Workspace
Anesthesia chamber generic generic Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4544-25G Solution Preparation Workspace
Assorted Beakers generic generic Solution Preparation Workspace; 50 mL
Assorted Luers Cole Parmer 45511-00 Brain Slice Recording Workspace
Assorted Volumetric flasks generic generic Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L
B27 Supplement Life Technologies 17504-044 BrainXell Commercial Supplier Protocol
BDNF Peprotech 450-02 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Biological Safety Cabinet with UV Lamp Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
BrainPhys Neuronal Medium  STEMCELL Technologies  05790  CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol
Brainwave Software 3Brain AG Version 4 Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay  BrainXell  BX-0300  BrainXell Commercial Supplier Protocol
CaCl2 Sigma Aldrich 21115-100ML Solution Preparation Workspace
Carbogen generic generic All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture
Cell Culture Incubator  Assorted Assorted Assorted
CMOS-based HD-MEA chip 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes)  STEMCELL Technologies  38010  CDI Commerical Supplier Protocol
Crocodile Clip Grounding Cables JWQIDI B06WGZG17W Brain Slice Recording Workspace
Curved Forceps FST 11052-10 Brain Extraction Workspace
DMEM/F12 Medium Life Technologies  11330-032 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) STEMCELL Technologies  37350  CDI Commerical Supplier Protocol
Filter Paper Macherey-Nagel 531 011 Brain Preparation Workspace
Fine Brush Leonhardy 773 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Forceps VITLAB 67895 Brain Slice Recording Workspace
GDNF Peprotech 450-10 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Geltrex Life Technologies A1413201 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Glass pasteur pipette Roth 4518 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Solution Preparation Workspace
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Gravity-based Perfusion System ALA VC3-8xG Brain Slice Recording Workspace
HD-MEA Recording platform 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Heater Warner Instruments TC-324C Brain Slice Recording Workspace
Hemocytometer or Automated Cell Counter Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Hypo Needles Warner Instruments 641489 Brain Slice Recording Workspace
iCell GlutaNeurons Kit, 01279  CDI R1061  CDI Commerical Supplier Protocol
Iris Scissors Vantage V95-304 Brain Extraction Workspace
Isoflurane Baxter HDG9623 Brain Extraction Workspace
KCl Sigma Aldrich P5405-250G Solution Preparation Workspace
Laminin  Sigma-Aldrich  L2020  CDI Commerical Supplier Protocol
Liquid Nitrogen Storage Unit  Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Magnetic Stirrer generic generic Solution Preparation Workspace
Metal Screws Thorlabs HW-KIT2/M Brain Slice Recording Workspace
MgCl2 Sigma Aldrich M1028-100ML Solution Preparation Workspace
MgSO4 Sigma Aldrich 63138-250G Solution Preparation Workspace
Microdissection Tool Holder  Braun 4606108V Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Microdissection Tool Needle Braun  9186166 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Modular Stereomicroscope Leica CUSTOM Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications
N2 Supplement Life Technologies 17502-048 CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol
NaCl Sigma Aldrich S3014-1KG Solution Preparation Workspace
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751-100G Solution Preparation Workspace
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761-500G Solution Preparation Workspace
Neurobasal Medium  Life Technologies 21103-049 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Optical Cage System Thorlabs Assorted Brain Slice Recording Workspace
Optical Table w/Breadboard Thorlabs SDA7590 Brain Slice Recording Workspace
PDLO Sigma Aldrich P0671 HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace
Penicillin-streptomycin, 100x  Thermo Fisher Scientific  15140-122  CDI Commerical Supplier Protocol
Pipette tips TipONE S1120-8810 Brain Slice Recording Workspace
Pipettors  Assorted Assorted Assorted
Platinum Anchor CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recording Workspace
Polyethylene Tubing Assorted Assorted Brain Slice Recording Workspace
Pump MasterFlex 78018-22 Brain Slice Recording Workspace
Razor Blade Apollo 10179960 Brain Preparation Workspace
Reference Electrode Cell Culture Cap CUSTOM CUSTOM Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Rubber Pipette Bulb Duran Wheaton Kimble 292000205 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL Assorted Assorted Assorted
Slice Recovery Chamber CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Spatula ISOLAB 047.06.150 Brain Preparation Workspace
Sucrose Sigma Aldrich 84100-1KG Solution Preparation Workspace
Super Glue UHU 358221 Brain Slice Preparation Workspace
Surgical Scissors Peters Instruments BC 344 Brain Extraction Workspace
Tabletop Centrifuge  Assorted Assorted Assorted
TGF-β1 Peprotech 100-21C BrainXell Commercial Supplier Protocol
Tissue Paper generic generic Brain Extraction Workspace
Trypan Blue STEMCELL Technologies  07050  CDI Commerical Supplier Protocol
Upright Microscope Olympus CUSTOM Imaging Workspace; Custom specifications and modifications
Vacusip Integra 159010 Brain Slice Recording Workspace
Vibratome Leica VT1200s Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool
Vibratome Blade Personna N/A Brain Slice Preparation Workspace
Water Bath Lauda L000595 Brain Slice Recovery Workspace

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
  2. Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
  3. Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
  4. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  5. Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
  6. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  7. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  8. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  9. Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
  10. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
  11. Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
  12. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  13. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  14. Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
  15. Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
  16. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  19. Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
  20. Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
  21. Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265 (2022).
  22. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
  23. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442 (2021).
  24. Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638 (2023).
  25. Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
  26. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834 (2022).
  27. Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752 (2017).
  28. Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460 (2017).
  29. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471 (2023).
  30. Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121 (2016).
  31. Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672 (2017).
  32. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
  33. Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  34. Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  35. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  36. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
  37. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  38. Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
  39. Altuntac, E., et al. Bottom-up neurogenic-inspired computational model. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  40. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  41. Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
  42. Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046 (2011).
  43. Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33 (2016).
  44. Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
  45. Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381 (2018).
  46. Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
  47. Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
  48. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  49. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  50. Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
  51. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 205 HD-MEA store neurale optagelser neurale kredsløb / netværk hippocampal-kortikale skiver olfaktoriske pæreskiver iPSC-neuroner væv-elektrodegrænseflade connectome grafteori cellesamlinger beregningsmæssig neurovidenskab kunstig intelligens maskinindlæring
Optagelse og analyse af multimodal neuronal ensembledynamik i stor skala på CMOS-integreret mikroelektrodearray med høj densitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X.,… More

Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Klütsch, D., Amin, H. Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array. J. Vis. Exp. (205), e66473, doi:10.3791/66473 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter