Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células

Supercomplexos (SCs) são associações supramoleculares entre complexos individuais da cadeia respiratória ^1,2. Desde a identificação inicial das CTs e a descrição de sua composição pelo grupo de Schägger ^2,3, posteriormente confirmada por outros grupos, estabeleceu-se que elas contêm complexos respiratórios I, III e IV (IC, CIII e CIV, respectivamente) em diferentes estequiometrias. Duas populações principais de SCs podem ser definidas, aquelas contendo CI (e CIII sozinho ou CIII e CIV) e com peso molecular muito alto (MW, começando ~ 1,5 MDa para o SC menor: CI + CIII₂) e aquelas contendo CIII e CIV, mas não CI, com tamanho muito menor (como CIII₂ + CIV com ~ 680 kDa). Esses SCs coexistem na membrana mitocondrial interna com complexos livres, também em diferentes proporções. Assim, enquanto o CI é encontrado principalmente em suas formas associadas (ou seja, em SCs: ~ 80% no coração bovino e mais de 90% em muitos tipos de células humanas)³, o CIV é muito abundante em sua forma livre (mais de 80% no coração bovino), com o CIII mostrando uma distribuição mais equilibrada (~ 40% em sua forma livre mais abundante, como um dímero, em coração bovino).

Embora sua existência seja agora geralmente aceita, seu papel preciso ainda está em debate 4,5,6,7,8,9,10. De acordo com o modelo de plasticidade, podem existir diferentes proporções de CTs e complexos individuais, dependendo do tipo de célula ou do estado metabólico ^1,7,11. Essa natureza dinâmica da montagem permitiria que as células regulassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS) em resposta às mudanças ambientais ^4,5,7. As CCs também podem contribuir para controlar a taxa de geração de espécies reativas de oxigênio e participar da estabilização e renovação de complexos individuais 4,12,13,14. Modificações do estado de montagem do CS têm sido descritas em associação com diferentes situações fisiológicas e patológicas^15,16 e com o processo de envelhecimento¹⁷.

Assim, mudanças nos padrões de SC têm sido descritas em leveduras dependendo da fonte de carbono utilizada para o crescimento² e em células de mamíferos cultivadas quando a glicose é substituída por galactose⁴. Modificações também foram relatadas no fígado de camundongos após jejum⁸ e em astrócitos quando a oxidação de ácidos graxos mitocondriais é bloqueada¹⁸. Além disso, uma diminuição ou alterações nas CSs e OXPHOS foram encontradas na síndrome de Barth¹⁹, insuficiência cardíaca²⁰, vários distúrbios metabólicos²¹ e neurológicos 22,23,24 e diferentes tumores 25,26,27,28. Se essas alterações na montagem e nos níveis de CS são uma causa primária ou representam efeitos secundários nessas situações patológicas ainda está sob investigação^15,16. Diferentes metodologias podem fornecer informações sobre a montagem e função dos SCs; Estes incluem medições de atividade ^8,29, análise ultraestrutural^30,31 e proteômica^32,33. Uma alternativa útil que está sendo cada vez mais empregada e é o ponto de partida para algumas das metodologias mencionadas anteriormente é a determinação direta do status de montagem do SC por eletroforese nativa azul (BN) desenvolvida para esse fim pelo grupo de Schägger^34,35.

Essa abordagem requer procedimentos reprodutíveis e eficientes para obter e solubilizar membranas mitocondriais e pode ser complementada por outras técnicas, como análise de atividade em gel (IGA), eletroforese de segunda dimensão e western blot (WB). Uma limitação nos estudos sobre a dinâmica do SC por eletroforese de BN pode ser a quantidade de células iniciais ou amostras de tecido. Apresentamos uma série de protocolos para a análise da montagem e função do SC, adaptados dos métodos de grupo de Schägger, que podem ser aplicados a amostras de células ou tecidos frescos ou congelados a partir de apenas 20 mg de tecido.

NOTA: A composição de todos os meios de cultura e tampões é especificada na Tabela 1 e os detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de mitocôndrias de cultura de células

NOTA: O volume mínimo de células analisadas foi de ~ 30-50 μL de células empacotadas (etapa 1.4). Isso pode corresponder aproximadamente a pelo menos duas ou três placas de cultura de células de 100 mm ou a uma placa de 150 mm a 80-90% de confluência, dependendo do tipo de célula (entre 5 × 10⁶ e 10⁷ células em células derivadas de L929 ou MDA-MB-468). A quebra celular eficiente é uma etapa crítica.

1. Cultive células aderentes a aproximadamente 80% de confluência ou células suspensas a uma densidade adequada.
2. Colher células por centrifugação a 500 × g por 5 min (diretamente da suspensão celular no caso de células não aderentes ou após tripsinização padrão com uma solução de tripsina-EDTA de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA em 1x PBS, no caso de células aderentes).
3. Lave as células 2x com PBS frio 1x e sedimente-as por centrifugação a 500 × g por 5 min.
   NOTA: A partir deste ponto, todas as etapas devem ser executadas a 4 °C. Portanto, todos os reagentes devem estar frios e os tubos contendo células ou mitocôndrias devem ser mantidos congelados.
4. Após a segunda centrifugação, rejeitar o sobrenadante, estimar o volume do sedimento celular (cpv) e congelar as células a -80 °C durante pelo menos 15 minutos para facilitar a ruptura da membrana no passo 1.8.
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e as células podem ser armazenadas a -80 °C por semanas. Normalmente, tubos graduados de 10 ou 15 mL com fundo cônico são apropriados.
5. Deixe as células descongelarem lentamente no gelo.
6. Ressuspenda o grânulo de células compactadas em um volume de tampão hipotônico igual a 7x o cpv (10 mM MOPS, 83 mM de sacarose, pH 7,2) (por exemplo, 100 μL de células compactadas em 700 μL de tampão).
   NOTA: O volume deve ser suficiente para obter estalos eficientes (consulte NOTA na etapa 1.8).
7. Transfira a suspensão celular para um homogeneizador Potter-Dounce do tamanho apropriado e deixe as células incharem incubando-as em gelo por 2 min. Por exemplo, para um volume de 700-800 μL de suspensão celular, um homogeneizador com capacidade de 1 mL é adequado.
8. Quebre as membranas celulares realizando de oito a dez golpes no homogeneizador acoplado a um pilão de Teflon acionado por motor girando a 600 rpm.
   NOTA: Ao fazer os traços, é importante criar um vácuo que aumente a eficiência da quebra celular junto com as ações hipotônicas e de congelamento para inchaço e fragilidade das membranas, respectivamente. Se for bem feito, um som de "pop" será ouvido ao puxar o homogeneizador para baixo com um movimento rápido a cada golpe.
9. Adicione o mesmo volume de tampão hipertônico à suspensão celular (7x o cpv) (MOPS 30 mM, sacarose 250 mM, pH 7,2) para gerar um ambiente isotônico.
10. Transferir o homogeneizado para um tubo de 10-15 ml e centrifugar num rotor fixo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: O tubo original contendo as células intactas pode ser usado para esta finalidade.
11. Transfira o sobrenadante, que contém a fração mitocondrial, para tubos de polipropileno de 1,5 mL.
12. OPCIONAL: Para aumentar o rendimento das mitocôndrias, ressuspenda o pellet da etapa 1.10 em 7x o volume do pellet celular do tampão A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sacarose, pH 7.4) pipetando para cima e para baixo e centrifugue a 1.000 × g por 5 min a 4 ° C. Combine o novo sobrenadante com o anterior antes de prosseguir para a etapa 1.13.
13. Centrifugue em uma microcentrífuga a 16.000 × g por 2 min a 4 ° C para coletar a fração bruta mitocondrial.
14. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender cada pellet enriquecido com mitocôndrias com 0,5 ml de tampão A, combinando o conteúdo de dois tubos num só, e centrifugar nas mesmas condições descritas no passo 1.13. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.
15. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet final com 300 μL de tampão A e quantifique a concentração de proteína mitocondrial usando o ensaio de Bradford. Centrifugue novamente como antes e prossiga para a seção 3.

2. Isolamento de mitocôndrias de pequenas quantidades de tecidos animais

NOTA: A quantidade mínima de tecido para aplicar este protocolo com certa confiança depende do tipo de célula e sua abundância mitocondrial, mas pode ser ~ 20-30 mg de tecido para a maioria dos casos. As amostras de tecido podem ser de material fresco ou amostras congeladas. Neste último caso, deixe as amostras descongelarem em tampão de homogeneização colocado no gelo antes de iniciar o procedimento.

1. Pesar ou estimar o mais próximo possível a quantidade (mg) de tecido.
2. Corte o tecido com uma tesoura e faça 3-4 lavagens em tampão de homogeneização com a ajuda de uma peneira, tomando cuidado para não perder os pedaços menores.
   NOTA: Esta etapa é mais importante em tecidos como músculo esquelético ou coração do que no cérebro ou tecidos mais moles cujas células podem ser facilmente desagregadas diretamente pela etapa de homogeneização.
3. Adicione meio de homogeneização fresco (4 mL por grama de fígado, 10 mL por grama de coração, tecido adiposo marrom (BAT) ou músculo e 5 mL por grama de cérebro ou rim; veja a composição específica do tampão para cada caso na Tabela 1).
4. Transfira os pedaços de tecido com tampão para o homogeneizador e siga o protocolo ideal de homogeneização e isolamento de mitocôndrias, dependendo do tecido selecionado.
5. Isolamento de mitocôndrias do fígado, baço e rim
   1. Homogeneizar com quatro a seis movimentos para cima e para baixo no Elvehjem-Potter com um pilão de Teflon acionado por motor a 600 rpm.
   2. Transfira o tecido homogeneizado para um tubo de centrífuga estéril. Centrifugue em um rotor oscilante a 1.000 × g por 5 min a 4 °C.
   3. Encha os tubos de polipropileno de 1,5 mL com o sobrenadante obtido na etapa anterior. Centrifugue por 2 min a 16.000 × g em uma microcentrífuga a 4 °C e proceda a seguir conforme descrito anteriormente (etapas 1.13 a 1.15)
6. Isolamento de mitocôndrias de amostras de coração e músculo
   1. Homogeneizar com seis a oito golpes no Elvehjem-Potter com um pilão de Teflon acionado por motor a 600 rpm. Transfira o tecido homogeneizado para um tubo de centrífuga estéril.
   2. Centrifugue em um rotor oscilante a 1.000 × g por 5 min a 4 °C. Despeje o sobrenadante em tubos limpos de polipropileno de 1,5 mL.
      NOTA: Uma segunda homogeneização do pellet obtida na etapa 2.6.2 pode ser realizada com 4-5 golpes adicionais e 1/2 volume de tampão de homogeneização para aumentar o rendimento mitocondrial. O novo sobrenadante (após centrifugação novamente a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C) pode ser combinado com o anterior antes de se avançar para o passo 2.6.3. Uma alternativa para aumentar o rendimento bruto das mitocôndrias é dissociar as amostras de tecido cardíaco e muscular em solução de tripsina antes da homogeneização^36,37. Nesse caso, a tripsina deve ser inativada/removida de forma eficiente antes que as membranas mitocondriais sejam solubilizadas com digitonina (etapa 3.2).
   3. Centrifugar a 16.000 × g em uma microcentrífuga por 2 min a 4 ° C para obter a fração mitocondrial bruta.
   4. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender cada sedimento enriquecido com mitocôndrias com 0,5 ml de tampão AT, combinando o conteúdo de dois tubos num só, e centrifugar nas mesmas condições descritas no passo 2.6.3. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.
   5. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet final com 300 μL de tampão A (sem BSA) e quantifique a concentração de proteína mitocondrial usando o ensaio de Bradford. Centrifugue novamente como antes e prossiga para a seção 3.
7. Isolamento das mitocôndrias do cérebro
   1. Homogeneizar as peças do cérebro com 10-15 golpes usando um homogeneizador de vidro do tipo Dounce com um pilão de vidro acionado manualmente. Transfira o tecido homogeneizado para um tubo de centrífuga estéril.
   2. Centrifugue em um rotor oscilante a 1.000 × g por 5 min a 4 °C.
   3. Recolher o sobrenadante num tubo de centrifugação limpo.
   4. Ressuspender o pellet obtido na etapa de centrifugação anterior no mesmo volume de meio AT utilizado na primeira homogeneização. Homogeneizar novamente o pellet repetindo o processo descrito na etapa 2.7.1 usando 5-10 passagens e centrifugar a suspensão em um rotor oscilante a 1.000 × g por 5 min a 4 °C.
   5. Retirar o sobrenadante e adicioná-lo ao tubo preparado no passo 2.7.3. Centrifugar a 10.000 × g num rotor de ângulo fixo durante 10 min a 4 °C para obter a fracção mitocondrial bruta.
   6. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1/2 do volume de homogeneização inicial (passo 2.7.1) do meio AT. Distribua a suspensão mitocondrial em tubos limpos de polipropileno de 1,5 mL e centrifugue a 16.000 × g em uma microcentrífuga por 2 min a 4 ° C.
   7. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender cada pellet enriquecido com mitocôndrias com 0,5 ml de tampão AT, combinando o conteúdo de dois tubos num só, e centrifugar nas mesmas condições descritas no passo 2.7.6. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.
   8. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet final com 300 μL de tampão A (sem BSA) e quantifique a concentração de proteína mitocondrial usando o ensaio de Bradford. Centrifugue novamente como antes e prossiga para a seção 3.
8. Isolamento das mitocôndrias a partir de MTD
   1. Homogeneizar com oito a dez movimentos para cima e para baixo no Elvehjem-Potter com um pilão de Teflon acionado por motor a 600 rpm. Transfira o tecido homogeneizado para um tubo de centrífuga estéril.
   2. Centrifugue em um rotor oscilante a 1.000 × g por 5 min a 4 °C.
   3. Encha os tubos de polipropileno de 1,5 mL com o sobrenadante obtido na etapa anterior, evitando a camada superior de gordura.
      NOTA: Uma segunda homogeneização do pellet obtida na etapa 2.8.2 pode ser realizada para aumentar o rendimento mitocondrial. O novo sobrenadante (após centrifugação novamente a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C) pode ser combinado com o anterior antes de se avançar para o passo 2.8.4.
   4. Centrifugue por 2 min a 16.000 × g por 2 min em uma microcentrífuga a 4 °C.
   5. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender cada pellet enriquecido com mitocôndrias com 0,5 ml de tampão AT2, combinando o conteúdo de dois tubos num só, e centrifugar nas mesmas condições descritas no passo 2.8.4. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.
   6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet final com 300 μL de tampão A (sem BSA) e quantifique a concentração de proteína mitocondrial usando o ensaio de Bradford. Centrifugue novamente como antes e prossiga para a seção 3.

3. Preparação de amostras para análise Blue Native

1. Ressuspenda as frações mitocondriais (obtidas de culturas de células ou tecidos de mamíferos) em tampão de amostra de BN (50 mM de NaCl, 50 mM de Imidazol, 5 mM de ácido aminocapróico, 4 mM de PMSF) para obter uma concentração de proteína de cerca de 10 mg / mL. Ver quadro 2 para os rendimentos esperados para os diferentes tipos de amostras.
2. Solubilizar as membranas mitocondriais adicionando digitonina (solução estoque a 10%) para obter uma proporção de 4 g de digitonina / g de proteína mitocondrial (4 μL de digitonina 10% estoque para 10 μL da suspensão mitocondrial preparada na etapa 3.1).
   NOTA: A relação detergente/proteína (g/g) deve ser otimizada para cada tipo de amostra para obter resultados reprodutíveis; 2-8 g de digitonina/g de proteína mitocondrial foram considerados ótimos para a maioria dos tecidos^34,35.
3. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo. Incube as amostras no gelo por 5 min.
   NOTA: Após esta etapa, a suspensão mitocondrial deve ficar mais clara (mudança de opaca para translúcida); caso contrário, pode indicar que a quantidade de detergente é insuficiente para a solubilização correta da membrana.
4. Centrifugue em velocidade máxima em uma microcentrífuga (20.000 × g aprox.) por 25 min a 4 ° C para remover o material insolúvel.
5. Recolher o sobrenadante num tubo novo. Adicione ao sobrenadante um volume de 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% em ácido aminocapróico 0,75 M) equivalente a 1/3 do volume inicial de ressuspensão (etapa 3.1, isso corresponderia a uma proporção final de 1,6 g de Coomassie / g de proteína) e misture por pipetagem.
6. Manter no gelo antes de colocar o gel ou congelar alíquotas a -80 °C.

4. Eletroforese em gel nativo azul

NOTA: A eletroforese é realizada na câmara fria (4-8 °C). Se não houver instalação de câmara fria, um bloco de resfriamento pode ser introduzido no tanque de eletroforese. Utilizam-se géis comerciais de poliacrilamida nativa de 3-13%²⁹, mas também podem ser utilizados géis caseiros com as concentrações de gradiente desejadas^38,39.

1. Carregue as câmaras superior e inferior com o cátodo frio A e os tampões anódicos, respectivamente. Em alternativa, colocar as amostras nos alvéolos antes de encher cuidadosamente a câmara superior com tampão catódico A.
   NOTA: Tampões de eletroforese comerciais são usados em nosso laboratório, mas podem ser preparados conforme indicado na Tabela 1.
2. Carga entre 30 e 100 μg de proteína mitocondrial.
   NOTA: Normalmente, 30-50 μg de proteína (para WB) ou 40-100 μg de proteína (para IGA) são carregados por poço em um gel de 10 pistas (poços de 0,5 x 0,15 cm). O tampão do cátodo A contém Coomassie Blue G-250 e tem uma cor azul intensa que dificulta a visualização dos poços de gel para carregamento da amostra. É conveniente marcar o centro de cada poço, com um marcador vermelho, por exemplo, para ajudar na colocação da ponta da pipeta durante esta etapa. Marcadores de peso molecular nativos podem ser úteis ao configurar a técnica BN-PAGE para confirmar que os géis gradientes estão formados corretamente e que os complexos e o padrão SCs são os corretos.
3. Execute a 80-100 V por 25-30 min e depois a 160-180 V, limitando a corrente a 12 mA/gel, até que o corante atinja o fundo do gel (~125-165 min no total).
4. Se forem realizados ensaios de atividade em gel (IGAs), substitua o tampão catódico A pelo tampão catódico B quando a frente do corante estiver no meio do gel (~ 1 h após o início da corrida).
   NOTA: Embora os géis possam ser documentados sem qualquer coloração logo após a execução, uma vez que algumas bandas são visíveis (principalmente o complexo V, que pode ser considerado um fabricante "interno" com um MW de ~ 600 kDa) devido à sua ligação ao corante G-250, geralmente, SCs e complexos individuais não serão visíveis sem coloração ou ensaios IGA. Os géis a serem usados em ensaios IGA ou para WB não devem ser corados ou fixados.
5. Desmonte o gel do e continue com a coloração com azul de Coomassie (seção 5), análise de IGA (seção 6) ou imunodetecção de WB (seção 7).

5. Coloração em gel

1. Manchar o gel por 10-15 min em temperatura ambiente (RT) usando soluções de corante azul de Coomassie (corante Coomassie R-250 a 0,25% em 40% de metanol, 10% de ácido acético; corar por 10-15 min).
2. Destain com várias lavagens (normalmente 4-5 x 15 min) em 40% de metanol mais 10% de ácido acético em RT.
3. Documente o gel.

6. Em ensaios de atividade em gel (IGA)

1. Prepare soluções IGA para a análise dos diferentes complexos respiratórios antes do final da eletroforese e mantenha-os no escuro (usando caixas plásticas de cor escura ou cobrindo-as com papel alumínio, por exemplo). A composição de cada tampão é detalhada na Tabela 1.
2. Coloque o gel ou as pistas a serem usadas em uma caixa plástica o menor possível para acomodá-lo.
3. Adicione volume suficiente da solução apropriada para cobrir o gel (geralmente 5 ou 10 mL para 5 ou 10 faixas de gel, respectivamente) e incube em RT com agitação suave (60-80 rpm) e longe da luz.
   NOTA: O tempo de incubação depende do complexo a ser analisado e da natureza e quantidade de amostra carregada; CI e CIV são os mais fáceis e rápidos de dar resultados. Assim, a atividade do IC geralmente começa a se tornar visível após alguns minutos, enquanto o CII e o CIV precisam de ~ 30 min para serem observados e o CV ~ 1,5-2 h. A reação pode continuar por horas em todos os casos e a taxa de intensificação do sinal pode ser reduzida movendo a incubação para uma câmara fria (4-6 °C), por exemplo, para uma incubação noturna (ON). A atividade CIII funciona apenas para eletroforese nativa clara (CN), não para BN³⁴.
4. Quando as bandas apropriadas se desenvolverem, pare as reações removendo as soluções de ensaio, lavando 2x com água destilada e fixando o gel com 40% de metanol mais 10% de ácido acético (exceto para CV que é fixado apenas com metanol) por 30 min.
   1. Para analisar a atividade do CIV após a detecção do IC por IGA, lave o gel 2x com água destilada, documente a atividade do CI, incube o gel (sem fixá-lo!) com tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,2) 2x por 30 min e, em seguida, com o tampão de reação CIV completo até que as bandas IV complexas apareçam (geralmente incubando ON em RT ou 4 °C).
5. Documente os géis.
   NOTA: Para a atividade ATPase, como as bandas reveladas são brancas, ao documentar o gel, coloque-o em um fundo escuro para que as bandas claras fiquem visíveis.

7. Análise de Western blot

1. Preparar o tampão de transferência de acordo com o quadro 1 e manter a 4 °C até ao final da electroforese.
2. Coloque o gel em uma bandeja e adicione o tampão de transferência. Incubar em RT por 10-15 min.
3. Corte um pedaço de membrana de PVDF do mesmo tamanho do gel e ative-o em metanol por 10 s sob agitação. Lave várias vezes com água destilada e adicione tampão de transferência. Incube em RT por 10-15 min com agitação suave.
4. Prepare o sanduíche de transferência, de baixo para cima, evitando bolhas entre o gel e a membrana, na seguinte ordem: lado preto do-esponja-papel absorvente-gel-membrana-papel absorvente- esponja-lado transparente do.
5. Feche e trave o e coloque o sanduíche no tanque de transferência na orientação correta para transferência (lado preto em direção ao pólo negativo).
6. Encha o tanque de transferência com tampão de transferência, adicione um agitador magnético para agitar o tampão e conecte a fonte de alimentação a 80 V por 2 h ou a 100 V por 1 h. Realize a transferência entre 4 e 8 °C (por ex.ample na câmara fria) e com um bloco de resfriamento no sistema de transferência.
7. Recupere a membrana e continue com um protocolo padrão de western blot, usando anticorpos específicos para os diferentes complexos respiratórios a serem detectados²⁹.

Os rendimentos das mitocôndrias obtidos seguindo os protocolos descritos acima variam dependendo de vários fatores, como a linha celular ou tipo de tecido, a natureza das amostras (ou seja, se são usados tecidos frescos ou congelados) ou a eficiência do processo de homogeneização. Os rendimentos esperados de mitocôndrias de diferentes linhagens celulares e tecidos são coletados na Tabela 2. Uma vez obtidas as frações mitocondriais, o próximo passo é a análise do padrão das CTs respiratórias, que é realizada após a solubilização da amostra mitocondrial bruta e separação eletroforética por BN-PAGE, seguida de análise de IGA ou imunodetecção de WB. A Figura 1 mostra o aspecto das faixas de gel não coradas logo após a corrida e o padrão de bandas após a coloração padrão de Coomassie de uma linha celular cultivada e uma amostra mitocondrial de fígado de camundongo.

Na Figura 2A, B, podem ser observadas diferenças claras entre os padrões de montagem SC em células humanas e de camundongo após o uso de ensaios de IGA. Assim, o complexo livre I é observado em células de camundongos, enquanto não é detectável nas mitocôndrias humanas. O padrão complexo IV-IGA é muito semelhante em ambas as linhagens de células humanas (Figura 2B), embora apresente diferenças entre as duas linhagens de células de camundongos analisadas na Figura 2A. Essas diferenças se devem ao fato de que as células BL6 expressam uma variante mutante do SCAF18.

Os padrões SC, obtidos com o protocolo de isolamento mitocondrial aqui descrito para trabalhar com amostras pequenas, são mantidos em relação aos protocolos "convencionais" usados para amostras maiores. Isso pode ser visto na Figura 2C, comparando as pistas 1 e 6 (obtidas após isolamento mitocondrial usando um protocolo convencional de 3 g de fígado e 1,1 g de BAT) com, respectivamente, as pistas 2 e 5 (obtidas usando os protocolos aqui apresentados de cerca de 0,1 g de ambos os tecidos). Conforme proposto no modelo de plasticidade, a proporção relativa de complexos respiratórios e SCs varia dependendo do tipo de célula e do estado metabólico. Conforme mostrado na Figura 2C, D, os diferentes tecidos mostram diferentes padrões de montagem SC. Assim, as mitocôndrias cerebrais apresentam níveis muito baixos de complexo livre I e maior proporção de CTs quando comparadas com os demais tecidos, e o BAT é caracterizado por seus baixos níveis de CV (Figura 2A) e altas quantidades de SC III + IV (Figura 2D). As mitocôndrias cardíacas apresentam altos níveis de SCs e CV. Os padrões de montagem CV são muito semelhantes entre a linhagem celular cultivada e uma amostra mitocondrial de fígado de camundongo (Figura 2E).

A montagem de SC também pode ser analisada por WB, conforme mostrado na Figura 3 , para duas amostras obtidas de células de controle de baço e tumorais. Nesse caso, 30-50 μg de proteína mitocondrial geralmente são suficientes para detectar os diferentes complexos e SCs com os anticorpos específicos. A Figura 4 mostra algumas das principais armadilhas que podem acontecer durante a aplicação desses protocolos. Gradientes de gel errados podem produzir padrões de migração anormais e indesejados, como na Figura 4A, pista 1, onde os SCs permanecem próximos ao poço na parte superior da pista devido a uma concentração de acrilamida acima do normal no gel. A incubação das amostras, mesmo por tempos relativamente curtos, em altas temperaturas (aqui 37 ° C e 40 ° C por 10 min) causa degradação de SCs e CI (Figura 4A pistas 2-4). Da mesma forma, a proporção detergente-proteína é crítica para bons resultados e resolução adequada do gel. Abaixo de uma proporção de 2 g de digitonina/g de proteína, a resolução da banda é progressivamente reduzida e na concentração mais baixa (0,5 g/g) apenas um esfregaço na área correspondente aos SCs é visível (Figura 4B).

Figura 1: Padrão de complexos e supercomplexos mitocondriais após a separação de BNGE de mitocôndrias permeabilizadas por digitonina de uma linha celular de cultura (L929Balbc) e fígado de camundongo. As faixas à esquerda (1 e 2) representam o aspecto do gel não corado logo após a corrida, onde apenas o CV é detectável, enquanto as faixas à direita (3 e 4) mostram o padrão das faixas após a coloração de Coomassie. Abreviaturas: BNGE = eletroforese em gel Blue Native; CV = complexo V; SCs = supercomplexos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise IGA de mitocôndrias isoladas de diferentes linhagens celulares e tecidos de camundongos. (A, B) Atividade em gel dos complexos indicados em mitocôndrias isoladas de (A) linhagens celulares de camundongo ou (B) humanas. L929Balbc é uma linha celular transmitocondrial, gerada em nosso laboratório pela transferência de mitocôndrias de plaquetas de camundongo Balb/cJ para células ρ°L929neo, conforme descrito anteriormente40,41. Os fibroblastos BL6 são uma linhagem celular imortalizada gerada em nosso laboratório a partir de uma biópsia de orelha de um camundongo BL6. (C) Padrões de CI-IGA de mitocôndrias de camundongos isoladas usando um método convencional começando com 3 g de fígado (pista 1) e com 1,1 g de BAT (pista 6) ou o protocolo apresentado aqui e começando com cerca de 0,1 g de tecido em todos os casos (pista 2, fígado; pista 3, coração; pista 4, cérebro e pista 5 BAT). (D) Padrões CIV-IGA (realizados após CI-IGA mostrados no painel 2C, pistas 2-5) no fígado de camundongo, coração, cérebro e mitocôndrias BAT. (E) Atividade CV-IGA analisada em células cultivadas em camundongos e fígado. Cerca de 60-75 μg de proteína mitocondrial por pista foram carregados. Abreviaturas: IGA = atividade no gel; SCs = supercomplexos; IC = complexo I; BAT = tecido adiposo marrom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imunodetecção de WB dos diferentes complexos e supercomplexos mitocondriais em amostras de baço. Após a separação Blue Native PAGE de complexos mitocondriais e SCs obtidos de amostras de controle de baço (Baço M9) e tumor (Tumor M9), eles foram transferidos para uma membrana de PVDF e hibridizados sequencialmente com anticorpos que reconhecem as subunidades CI, CIII, CIV e CII indicadas (painéis AD, respectivamente). Cerca de 50 μg de proteína mitocondrial foram carregados por pista. Os asteriscos indicam o sinal restante de um western blot anterior. Abreviaturas: SC = supercomplexo; IC = complexo I; CIII = complexo III; CIV = complexo IV; CII = complexo II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Armadilhas na análise SC por Blue-Native PAGE. CI IGA-análise de mitocôndrias isoladas de (A) fígado de camundongo fresco e (B) fígado de rato congelado sob diferentes condições de solubilização. (A) Pista 1, concentração errada de gradiente de gel (8-13% em vez dos 3-13% normais). Pistas 2-4, amostras incubadas por 10 min no gelo ou a 37 °C e 40 °C antes do carregamento, respectivamente. (B) Padrão após IGA para IC de mitocôndrias obtidas de fígado de rato congelado usando diferentes proporções de digitonina/proteína para solubilização. Abreviaturas: SC = supercomplexo; PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida; IC = complexo I; IGA = atividade no gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Buffers e composição de mídia.

Tabela 2: Rendimentos esperados de mitocôndrias de diferentes tipos de células e tecidos de camundongos. As frações mitocondriais obtidas do coração ou do músculo esquelético são mais puras do que as obtidas de outros tecidos. Assim, quantidades menores podem ser carregadas nos géis (*).

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.