Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Olá, meu nome é Brad Hamilton. Estou no departamento de pesquisa e desenvolvimento da STEM Gen. Hoje vamos mostrar um procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos embrionários de camundongo.

Este procedimento pode ser utilizado tanto para gerar células-tronco pluripotentes induzidas quanto para estudar o processo de reprogramação. Então, vamos começar. Inicie semeando fibroblastos embrionários de camundongo, ou células MET, em uma placa de 15 centímetros revestida com gelatina, numa densidade de quatro vezes 10 à quinta células por placa.

Agora, adicione 30 mililitros de meio de crescimento para metilação e incube as células por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que estejam aproximadamente 80% confluentes. Após a conclusão, aspire o meio e adicione 30 mililitros de meio de crescimento suplementado com lentivírus concentrado.

Balançar suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme do meio. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com a transdução viral concluída. Vamos prosseguir para a reprogramação induzida por doxiciclina.

Para iniciar a reprogramação, 20 a 24 horas após a transdução, trate as células transduzidas com tripsina e centrifugue-as a 200 ×g por cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio do pellet celular e ressuspenda as células em meio de crescimento. Após a suspensão, semeie as células mes transduzidas em uma concentração apropriada para o tamanho da placa de cultura celular que estiver utilizando.

Aqui estamos utilizando 2,5 vezes 10 à quinta células por placa de 10 centímetros para experimentos de eficiência de reprogramação e isolamento de colônias IPS e duas vezes 10 à quarta células por poço em placas de quatro poços para experimentos de imunoquímica. Para monitorar a eficiência de transdução, incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Nesta etapa, as células podem ser congeladas em nitrogênio líquido para análises futuras, se necessário.

No dia seguinte, aspire o meio e substitua-o por meio de crescimento fresco suplementado com doxiciclina numa concentração final de dois microgramas por mililitro. Incluímos um controle negativo contendo meio sem doxiciclina. Por fim, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Iniciamos o processo de reprogramação. Em geral, as colônias de células-tronco pluripotentes terão tamanho suficiente para isolamento após 16 a 22 dias.

Antes de demonstrarmos esse procedimento, precisamos primeiro verificar a eficiência de transdução utilizando química para determinar a eficiência de transdução. O teste de imunoquímica é realizado nas células replantadas em placas de quatro poços 48 horas após a indução com doxiciclina. Todos os volumes listados neste protocolo devem ser ajustados de acordo com o tamanho da placa de cultura celular; comece lavando suavemente as células.

Uma vez com PBS sem íons de magnésio ou cálcio, fixe as células com 500 microlitros de paraformaldeído 4% em PBS por 15 minutos. À temperatura ambiente, lave as células novamente suavemente duas vezes com PBS. Em seguida, permeabilize as células adicionando 500 microlitros de Tween 20 0,2% frio em PBS e incube por 10 minutos à temperatura ambiente.

Após lavar as células mais duas vezes, adicione 200 microlitros de tampão bloqueador por uma hora à temperatura ambiente para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos. Agora, adicione 200 microlitros do anticorpo primário desejado.

Aqui estamos utilizando os marcadores de pluripotência T 4K LF four, SOX two e cmic. Incube as células durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Após lavar as células suavemente duas vezes com PBS, incube-as com 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente, protegendo as placas da luz.

Aqui estamos utilizando os anticorpos secundários apropriados conjugados com fluorocromos para visualização, usando um microscópio invertido de fluorescência após a incubação. Lave as células mais duas vezes e, em seguida, adicione DPI e incube novamente por 10 minutos para visualizar os núcleos. Por fim, após uma última lavagem, adicione o suporte com antifa aqua antes de imagiar as células no microscópio invertido de fluorescência para determinar a eficiência de transdução.

Inicie o isolamento e a expansão de células-tronco pluripotentes. Após iniciar o processo de reprogramação, monitore as culturas diariamente e substitua o meio apropriado a cada 48 horas. Utilizamos meio suplementado com doxiciclina para cultivar as células durante os primeiros 12 dias e, posteriormente, removemos a doxiciclina do meio.

As colônias de células-tronco pluripotentes induzidas ou colônias IPS selecionadas manualmente para expansão são dependentes de doxiciclina. Células independentes devem ser monitoradas diariamente quanto a alterações morfológicas indicativas do processo de reprogramação. Cada experimento será diferente, mas as colônias geralmente apresentam tamanho suficiente para isolamento entre 16 e 22 dias após a indução por DS, no dia anterior ao início do processo de isolamento e tripsinização das colônias reprogramadas.

Prepare uma placa de 24 poços semeando uma camada alimentadora de mets irradiados com raios gama numa densidade de cinco vezes 10 à quarta células por poço. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, selecione manualmente cada colônia de IPS e tripsinize-a para dissociar os agregados celulares; replique as células IPS em meio para células-tronco embrionárias de camundongo nos poços individuais da placa de 24 poços preparada anteriormente e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Trocando o meio a cada 24 horas. Monitore diariamente as colônias de IPS quanto ao crescimento e à fluorescência GFP. Incubamos nossas culturas por seis dias antes de acondicioná-las em placas de quatro poços para análise de pluripotência.

Determine quais poços da placa de 24 poços estão expressando GFP de forma uniforme; poços que apresentam boa expressão de GFP podem ser triplicados, inativados e passados na proporção de um para oito em placas de quatro poços que foram previamente revestidas com camadas de alimentadores irradiadas com gama de mes. Essas placas podem então ser usadas para análise de ICC para pluripotência, a fim de iniciar a análise de pluripotência. Lave suavemente as células duas vezes com PBS não contendo íons de magnésio ou cálcio.

Adicione 0,5 mililitros por poço de PBS gelado contendo 0,2% entre 20 e incube as células por 10 minutos. Após mais três lavagens em PBS, bloquee a ligação não específica com 200 microlitros de tampão bloqueador durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 200 microlitros do anticorpo primário desejado.

Aqui utilizamos SSEA um, nanog e OCT quatro para incubação das células durante a noite a quatro graus Celsius. Após lavar as células suavemente duas vezes, incube-as com 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente, mantendo-as protegidas da luz. Estamos utilizando aqui os anticorpos secundários apropriados conjugados com fluoro force para visualização, usando um microscópio fluorescente invertido; após mais duas lavagens, adicione DPI e incube as células por 10 minutos.

Agora, após uma lavagem final, adicione o meio de montagem antifa aqua antes de imaginar as células com o microscópio invertido de fluorescência. As colônias de IPS também podem ser analisadas quanto à atividade de fosfatase alcalina utilizando kits comercialmente disponíveis. O conjunto de lentivírus induzível para camundongo stem gent docs pode ser usado para reprogramar MES em células IPS após a transdução da expressão dos fatores de transcrição MES.

T quatro, SOX dois, KLF quatro e seic podem ser detectados em células tratadas com doxiciclina, mas pouca ou nenhuma expressão pode ser detectada em células não tratadas. As alterações morfológicas progredirão ao longo do tempo, gerando colônias maiores e semelhantes a células ES, com bordas bem definidas e crescimento tridimensional. Quando o docs é removido, ocorre uma reversão visível da morfologia celular em algumas colônias semelhantes a células ES.

No entanto, muitas das colônias mantiveram sua morfologia de IPS. Essas colônias de IPS, quando isoladas e subcultivadas, exibem expressão típica de marcadores de pluripotência, como fosfatase alcalina, Nanog, Oct4 e SSEA-1.

O tipo de células metiladas utilizado neste experimento expressava GFP a partir do locus endógeno nag. Quando reprogramadas para o estado de pluripotência, a expressão de GFP pode, portanto, ser usada como um indicador preliminar de reprogramação bem-sucedida. Acabamos de mostrar como induzir a reprogramação de fibroblastos embrionários de camundongo para gerar células-tronco pluripotentes utilizando um sistema antiviral induzível por doxiciclina com quatro fatores de transcrição.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, ao planejar experimentos de reprogramação, diversas variáveis devem ser consideradas para otimizar a eficiência da reprogramação. Primeiro, é possível modificar a razão entre vírus ativo e número de células durante a etapa de infecção primária para aumentar ou diminuir a eficiência de transdução, afetando assim o número de vírus integrados na população celular-alvo. Segundo, ajustar o tempo de exposição das células aos docs pode afetar o número de colônias de IPS geradas.

Terceiro, a capacidade proliferativa das células-alvo pode influenciar a reprogramação, pois células que estão ativamente em crescimento e divisão são mais suscetíveis à reprogramação. Por último, ao modificar o protocolo para diferentes números de células ou diferentes tamanhos de placas de cultura celular, recomenda-se que o número de células-alvo seja ajustado proporcionalmente à área de superfície da placa de cultura. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.