Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Olá, meu nome é Brad Hamilton. Estou no departamento de pesquisa e desenvolvimento aqui na STEM Gen. Hoje mostraremos um procedimento de como gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos embrionários de camundongos.

Este procedimento pode ser usado tanto para gerar células-tronco pluripotentes induzidas quanto para estudar o processo de reprogramação. Então vamos começar. Comece semeando fibroblastos embrionários de camundongo ou células de metanfetamina em um prato revestido de gelatina de 15 centímetros a uma densidade de quatro vezes 10 das quintas células por prato.

Agora adicione 30 mililitros de meio de crescimento de metanfetamina e incube as células por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que estejam aproximadamente 80% confluentes. Quando terminar, incubar aspirar o meio e adicionar 30 mililitros de crescimento. Meio suplementado com lentivírus concentrado.

Balance o prato suavemente para garantir uma distribuição uniforme do meio. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com transdução viral completa. Vamos passar para a doxiciclina induzida

Para começar a reprogramar 20 a 24 horas após a transdução, a tripsina é a célula transduzida e centrifugá-las a 200 Gs por cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio do pellet celular e ressuspenda as células no meio de crescimento. Uma vez suspensa a semente, o mes transduzido em uma concentração apropriada para o tamanho da placa de cultura de células que você está usando.

Aqui estamos usando 2,5 vezes 10 elevado à quinta células por prato de 10 centímetros para experimentos de eficiência de reprogramação e isolamento de colônias IPS e duas vezes 10 elevado a quarta células por poço em placas de quatro poços para experimentos de imunoquímica. Para monitorar a eficiência da transdução, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Nesta fase, as células podem ser congeladas em nitrogênio líquido para análise futura, se necessário.

No dia seguinte, aspirar o meio e substituí-lo por meio de crescimento fresco que tenha sido suplementado com doxiciclina até uma concentração final de dois microgramas por mililitro. Incluímos um meio de controle negativo sem doxiciclina. Finalmente, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Iniciamos o processo de reprogramação. Em geral. As colônias de células-tronco pluripotentes serão grandes o suficiente para isolamento após 16 a 22 dias.

Antes de demonstrarmos esse procedimento, precisamos primeiro verificar a eficiência da transdução usando química para determinar a eficiência da transdução. O teste imunoquímico é realizado nas células replaqueadas em quatro placas de poços 48 horas após a indução da doxiciclina. Todos os volumes listados neste protocolo devem ser ajustados de acordo com o tamanho da placa de cultura de células, começando por lavar as células suavemente.

Uma vez com PBS não contendo íons de magnésio ou cálcio, fixe as células com 500 microlitros de aldeído paraforme a 4% em PBS por 15 minutos. À temperatura ambiente, lave as células novamente suavemente duas vezes com PBS. Em seguida, faça permanente nas células adicionando 500 microlitros de 0,2% gelada entre 20 em PBS incube por 10 minutos em temperatura ambiente.

Depois de lavar as células mais duas vezes. Adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente para bloquear a ligação de anticorpos não específicos. Agora adicione 200 microlitros do anticorpo primário desejado.

Aqui estamos usando os marcadores de pluripotência T 4K LF quatro, SOX dois e cmic. Incube as células durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Depois de lavar as células suavemente duas vezes com PBS, incube-as com 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora em temperatura ambiente, protegendo as placas da luz.

Aqui estamos usando os anticorpos secundários apropriados conjugados com fluoro fours para visualização, usando um microscópio fluorescente invertido após a incubação. Lave as células mais duas vezes e, em seguida, adicione DPI e incube novamente por 10 minutos para visualizar os núcleos. Finalmente, após uma última lavagem, adicione o suporte antifa aqua antes de obter imagens das células com o microscópio fluorescente invertido para determinar a eficiência da transdução.

Iniciar o isolamento e a expansão das células-tronco pluripotentes. Após iniciar o processo de reprogramação, monitore as culturas todos os dias e substitua o meio apropriado a cada 48 horas. Usamos meio suplementado com doxiciclina para cultivar as células nos primeiros 12 dias e, posteriormente, removemos a doxiciclina do meio para isso.

As células-tronco pluripotentes induzidas ou colônias de IPS escolhidas manualmente para expansão são doxiciclina. As células independentes devem ser monitoradas diariamente quanto a alterações morfológicas indicativas do processo de reprogramação. Cada experimento será diferente, mas as colônias geralmente são grandes o suficiente para isolamento entre 16 a 22 dias após a indução da SD, um dia antes de iniciar o processo de isolamento e reprogramação de tripsina

Prepare uma placa de 24 poços semeando com uma camada alimentadora irradiada por gama de mets a uma densidade de cinco vezes 10 elevado a quatro células por poço. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, escolha manualmente cada colônia IPS e trips-a para dissociar os agregados celulares, substitua as células IPS em meio de células-tronco embrionárias de camundongo nos poços individuais da placa de 24 poços precedida incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Mudando a mídia a cada 24 horas. Monitore as colônias IPS diariamente quanto ao crescimento e fluorescência de GFP. Incubamos nossas culturas por seis dias antes de embalá-las em placas de quatro poços para análise de pluripotência.

Determine quais poços da placa de roda 24 estão expressando uniformemente GFP Os poços que têm boa expressão de GFP podem ser disparados, inizados e passados de um a oito em quatro placas de poços que foram precedidas por camadas alimentadoras irradiadas por gama de mes. Essas placas podem então ser usadas para análise de ICC para pluripotência para iniciar a análise de pluripotência. Lave suavemente as células duas vezes com PBS que não contenha íons de magnésio ou cálcio.

Adicione 0,5 mililitros por poço de 0,2% geladoentre 20 em PBS e incube as células por 10 minutos. Após mais três lavagens em bloco PBS, ligação não específica com 200 microlitros de tampão bloqueador por uma hora em temperatura ambiente. Agora adicione 200 microlitros do anticorpo primário desejado.

Aqui usamos SSEA um nanog e OCT quatro incubam as células durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de lavar as células suavemente duas vezes, incube-as com 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora em temperatura ambiente, mantendo-as longe da luz. Aqui estamos usando os anticorpos secundários apropriados conjugados com força de flúor para visualização, usando um microscópio fluorescente invertido após mais duas lavagens, adicione DPI e incube as células por 10 minutos.

Agora, após uma lavagem final, adicione o suporte antifa aqua antes de obter imagens das células com o microscópio fluorescente invertido. As colônias de IPS também podem ser analisadas quanto à atividade da fosfatase alcalina usando kits disponíveis comercialmente. O conjunto de lentivírus TF de camundongo induzível por stem gent docs pode ser usado para reprogramar mes em células IPS após a transdução da expressão MES de fatores de transcrição.

T quatro, SOX dois, KLF quatro e seic podem ser detectados em células tratadas com doxiciclina, mas pouca ou nenhuma expressão pode ser detectada em células não tratadas. As mudanças morfológicas progredirão ao longo do tempo para gerar colônias maiores, semelhantes a células ES, com bordas de colônia definidas e crescimento tridimensional. Quando o docs é removido, há uma reversão perceptível da morfologia celular para algumas colônias semelhantes a células ES.

No entanto, muitas das colônias mantiveram sua morfologia IPS. Essas colônias IPS, quando escolhidas e passadas, são exibidas. Expressão típica do marcador de pluripotência da fosfatase alcalina, nano T quatro e SSEA uma.

O tipo de células de metanfetamina usadas neste experimento expressou GFP do locus de nag endógeno. Quando reprogramada para o estado de pluripotência, a expressão GFP pode, portanto, ser usada como um indicador preliminar para uma reprogramação bem-sucedida. Acabamos de mostrar como induzir a reprogramação de fibroblastos embrionários de camundongos para induzir células-tronco pluripotentes usando um sistema antiviral induzível por doxiciclina de quatro fatores de transcrição.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que, ao projetar experimentos de reprogramação, várias variáveis devem ser consideradas para otimizar a eficiência da reprogramação. Primeiro, é possível modificar a proporção de vírus ativo para célula-alvo durante a etapa de infecção primária para aumentar ou diminuir a eficiência de transdução, afetando assim o número de vírus integrados na população de células-alvo. Em segundo lugar, ajustar o período de tempo em que as células são expostas a documentos pode afetar o número de colônias IPS geradas.

Em terceiro lugar, a capacidade proliferativa das células-alvo pode afetar a reprogramação, pois as células, que estão crescendo e se dividindo ativamente, são mais passíveis de reprogramação. Por fim, ao modificar o protocolo para diferentes números de células ou placas de cultura de tecidos de tamanhos diferentes, recomenda-se que os números de células-alvo sejam ajustados proporcionalmente à área de superfície da placa de cultura. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.