Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

Há mais de 50 anos, foi levantada a hipótese de que células terminalmente diferenciadas, como fibroblastos da pele, poderiam ser forçadas a assumir um estado pluripotente semelhante às células-tronco embrionárias. A base para esse conceito foi a observação de que todos os tipos de células, com algumas pequenas exceções, têm o mesmo código genético e que a única diferença entre os tipos de células é como o código é lido. Essa capacidade de alterar a identidade celular de uma célula diferenciada para um estado pluripotente é denominada reprogramação celular.

Após meia década de pesquisa, foi recentemente demonstrado que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição pode reprogramar os fibroblastos da pele para se tornarem pluripotentes. O impacto dessa descoberta é enorme. Além da importância para a biologia básica, também supera as principais objeções éticas ao uso de células-tronco embrionárias humanas para terapia de transplante.

Para que a reprogramação aconteça, quatro genes que codificam os fatores de transcrição OC quatro, sox, dois cmic e K quatro precisam ser empacotados e colocados em uma cultura de tecidos de lentivírus. O meio contendo vírus purificado é então adicionado a uma placa de cultura de células contendo uma alta densidade de fibroblastos e, dentro dessa placa, algo surpreendente ocorre. Uma pequena fração de fibroblastos é infectada com todos os quatro vírus portadores do fator de transcrição e começa a se desdiferenciar.

Eles sofrem mudanças drásticas em sua morfologia e proliferação e começam a se dividir em grandes aglomerados espirituais de células-tronco pluripotentes formadas. Após duas a três semanas de cultivo em condições de células-tronco embrionárias, colônias de fibroblastos reprogramados podem ser isoladas manualmente e expandidas in vitro. Uma vez purificadas, essas células podem ser usadas para gerar camundongos quiméricos nos quais uma certa porcentagem de células derivadas daqueles de fibroblastos diferenciados podem contribuir para diferentes tecidos do camundongo.

Nos sinos em que o material genético dos fibroblastos originais contribuiu para a linha germinativa, o código genético é passado para a próxima geração e depois para a próxima e depois para a próxima. Embora o uso de um sistema de entrega viral seja atualmente um impedimento para aplicações clínicas, isso provavelmente será superado em pouco tempo. Neste vídeo, os membros do laboratório yin demonstrarão como as células-tronco potentes induzidas são derivadas de fibroblastos embrionários de camundongos.

Olá, sou Grant Welted do laboratório de Rudolph Jish no Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica em Cambridge, Massachusetts. E eu sou Tobias Bro brink também do laboratório ish. Hoje mostraremos a geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela introdução de quatro CDNAs, OCT, quatro SOX, dois CIC, KF, quatro, usando lentivírus que expressam esses quatro CDNAs de um promotor Tet OCMV.

Isso permite o controle preciso da expressão desses quatro transgenes após a infecção de fibroblastos embrionários de camundongos. O protocolo que estamos mostrando hoje envolve o manuseio de lentivírus que podem infectar células humanas. É fundamental que você sempre siga os procedimentos seguros e entre em contato com o escritório de segurança antes de tentar fazer isso sozinho.

Então, vamos gerar algumas células IPS para gerar lentivírus que converterão células mes em células IPS. 2 9 3 células devem ser transfectadas com três plasmídeos Paks dois, que fornecem os elementos genéticos necessários para o empacotamento viral. A espinha dorsal viral, que é um lentivírus FUW TE OCMV com um dos quatro auxiliares de CD T quatro SOX dois, KLA quatro ou CMIC PMDG, que expressa a glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular ou VSV.

Isso torna o vírus que gerará o vírus atrópico. Portanto, os procedimentos adequados de BL dois mais precisam ser seguidos. Neste vídeo em particular, não estamos realmente lidando com vírus infecciosos, então não estamos usando nossos aventais típicos e não estamos em nossas instalações BL two plus.

Antes da transfecção 2, 9 3 células são descongeladas de nitrogênio líquido e cultivadas para 90% de células de fluência de Co são então transfectadas com o gene FU e recebem de 48 a 72 horas para expressar o vírus, momento em que o meio que banha as células é filtrado usando um filtro de 0,45 mícron e concentrado usando ultracentrifugação após a concentração do vírus. Agora estamos prontos para infectar MES para gerar clusters IPS Durante as etapas de preparação viral, os fibroblastos embrionários de camundongos passam menos de três vezes e crescem até 90% de fluência em placas de 10 centímetros, aproximadamente duas vezes 10 elevado a seis células por placa. Neste protocolo experimental específico, estamos usando MES que expressam o RTTA, que é crítico para a expressão de doxiciclina e GFP do locus OC endógeno quatro.

Os MES são GFP negativos, mas as células IPS verdadeiras tornam-se GFP positivas. Este marcador permite um método pelo qual identificar mes reprogramados aspirar o meio de cultura dos fibroblastos e lavar com 10 mils de hippies, EDTA, descartar os hippies EDTA e adicionar cinco mils de uma vez tripsina e incubar a 37 graus por 10 minutos. A tripsina ajudará a levantar as células do fundo dos pratos.

Agora adicione nove mils do meio de cultura para ressuspender as células em uma única suspensão celular e transfira para um tubo de 15 mil. Essas células são então giradas para baixo e peletizadas. Após a suspensão do pellet, o número de células na suspensão é contado e a concentração é ajustada para oito vezes 10 elevado a quatro células por mil.

10 mils da suspensão celular são então transferidos para um prato de 10 centímetros revestido com gelatina. Incube o prato durante a noite a 37 graus Celsius 5% de CO2 após o meio de incubação noturno de um prato de fibroblastos ser aspirado e 10 mils do meio contendo vírus são adicionados à metanfetamina. Incube as células de quatro horas a uma noite a 37 graus Celsius, 5% de CO2.

No dia seguinte, aspire o meio de um prato de jato de fibra e adicione 10 mils de meio ESL fresco. Nesse estágio, as células podem ser congeladas, expandidas ou preparadas para o início da reprogramação. Para iniciar a reprogramação, substitua o meio ESL regular por meio contendo doxiciclina para iniciar a expressão dos quatro genes.

Coloque essas células na incubadora, troque o meio todos os dias até que as colônias se tornem grandes o suficiente para serem colhidas. As colônias devem primeiro se tornar visíveis aproximadamente uma semana após o início da reprogramação. Eles devem se tornar grandes o suficiente para serem coletados por volta do dia 20.

Agora que 20 dias se passaram, podemos ir em frente e escolher as colônias de IPS antes de escolher as colônias. Deve-se lembrar de ver o número necessário de placas de 24 poços revestidas com gelatina irradiada por gama DR quatro mitos uma a duas horas antes da colheita. Deve-se alimentar as colônias nas placas adicionando meio fresco imediatamente antes da colheita, adicionar 50 microlitros de tampão HEPA aos poços de um prato de fundo em V 96 Bem imediatamente antes de colher, lavar o prato contendo as colônias a serem colhidas uma vez com PBS e adicionar 10 ml de PBS ao prato, os aglomerados de células IPS podem ser colhidos em um microscópio estéreo ou invertido.

Escolha as colônias com uma pequena ponta de pipeta e transfira-as para um poço no prato de 96 poços contendo PBS para remover os cachos. Um círculo é desenhado com uma ponta de pipeta ao redor do cluster para quebrar a matemática. Agora as células reprogramadas podem ser extraídas agora usando o pipetador multicanal, 20 microlitros de tripsina são adicionados a cada uma.

Bem, canalize-o para cima e para baixo três vezes, incube a 37 graus C por quatro minutos. Após os quatro minutos de incubação, 100 microlitros de meio ES são adicionados às colônias tripps nice. Canalize-o para cima e para baixo 10 vezes e transfira seis clones de cada vez.

Do prato de 96 poços a um prato de 24 poços usando uma ponta em todas as outras posições nas células pipetadoras de 12 lugares são então cultivadas na placa de 24 poços em uma incubadora de 37 centavos, 5% de CO2 até que as células atinjam 80 a 90% de fluência de Co com células médias de células ES provavelmente estarão prontas para expandir em três a sete dias Alguns dias depois. Agora que as células IPS são confluentes, aspire o meio e lave as células com um mil de hippies completamente Remova os hippies e adicione 100 microlitros de tripsina e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação com tripsina, adicione 400 microlitros de meio ESL e suspenda as células pipetando para cima e para baixo e produza uma suspensão de célula única.

A suspensão de célula única de 500 microlitros do poço 24 é então transferida para um único poço de uma placa de seis poços e incubada em uma incubadora de 37 graus Celsius 5% CO2 até que as células atinjam 80 a 90% de fluência na placa de seis poços. Neste ponto, você pode prosseguir para amplificar as células para análise do sul, blastos, injeções, ensaios de teratoma ou ensaios de diferenciação in vitro. E você deve se lembrar de congelar as válvulas de estoque dessas células para não perder esse precioso estoque de células IPS.

Acabamos de mostrar como induzir a pluripotência em fibroblastos embrionários de camundongos usando um sistema antiviral induzível. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.