Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

Há mais de 50 anos, foi levantada a hipótese de que células diferenciadas terminalmente, como fibroblastos da pele, poderiam ser forçadas a assumir um estado pluripotente semelhante ao das células-tronco embrionárias. A base para esse conceito foi a observação de que todos os tipos celulares, com poucas exceções menores, possuem o mesmo código genético e que a única diferença entre os tipos celulares está na forma como o código é lido. Essa capacidade de alterar a identidade celular de uma célula diferenciada para um estado pluripotente é denominada reprogramação celular.

Após meio década de pesquisa, demonstrou-se recentemente que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição pode reprogramar fibroblastos da pele para se tornarem pluripotentes. O impacto dessa descoberta é enorme. Além da importância para a biologia básica, ela também supera as principais objeções éticas ao uso de células-tronco embrionárias humanas para terapia transplantar.

Para que a reprogramação ocorra, quatro genes que codificam os fatores de transcrição OC4, Sox2, c-Myc e K4 precisam ser empacotados e inseridos em um cultivo celular de lentivírus. O meio contendo o vírus purificado é então adicionado a uma placa de cultura celular contendo uma alta densidade de fibroblastos, e dentro dessa placa, algo surpreendente acontece. Uma pequena fração dos fibroblastos é infectada pelos quatro vírus carreadores dos fatores de transcrição e começa a desdiferenciar-se.

Eles passam por mudanças drásticas em sua morfologia e proliferação e começam a se dividir em grandes aglomerados esféricos formados por células-tronco pluripotentes. Após duas a três semanas de cultivo em condições de células-tronco embrionárias, colônias de fibroblastos reprogramados podem ser isoladas manualmente e expandidas in vitro. Uma vez purificadas, essas células podem ser utilizadas para gerar camundongos quiméricos, nos quais uma certa porcentagem das células derivadas dos fibroblastos desdiferenciados pode contribuir para diferentes tecidos do camundongo.

Em quimeras nas quais o material genético dos fibroblastos originais contribuiu para a linhagem germinativa, o código genético pode ser transmitido para a próxima geração, e então para a seguinte, e assim sucessivamente. Embora o uso de um sistema de entrega viral seja atualmente um entrave para aplicações clínicas, isso provavelmente será superado em breve. Neste vídeo, membros do laboratório de Yin demonstrarão como células-tronco pluripotentes induzidas são derivadas de fibroblastos embrionários de camundongo.

Olá, sou Grant Welted do laboratório de Rudolph Jish no Whitehead Institute for Biomedical Research em Cambridge, Massachusetts. E eu sou Tobias Bro brink, também do laboratório Ish. Hoje vamos mostrar a vocês a geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela introdução de quatro cDNAs: OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4, utilizando lentivírus que expressam esses quatro cDNAs a partir de um promotor Tet-OCMV.

Isso permite o controle preciso da expressão desses quatro transgenes após a infecção de fibroblastos embrionários de camundongo. O protocolo que estamos mostrando hoje envolve o manuseio de lentivírus que pode potencialmente infectar células humanas. É fundamental que você sempre siga procedimentos seguros e entre em contato com o seu departamento de segurança antes de tentar realizá-lo por conta própria.

Então, vamos gerar algumas células IPS para produzir lentivírus que converterão células ME em células IPS. Células 293 precisam ser transfectadas com três plasmídeos: Paks dois, que fornece os elementos genéticos necessários para o empacotamento viral; o esqueleto viral, que é um lentivírus FUW TE OCMV com um dos quatro auxiliares CD T quatro, SOX dois, KLA quatro ou CMIC; e PMDG, que expressa a glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular ou VSV.

Isso produz o vírus que irá gerar o vírus atrópico. Portanto, é necessário seguir os procedimentos adequados de nível de biossegurança 2 mais. Neste vídeo específico, não estamos manipulando realmente o vírus infeccioso, por isso não estamos usando nossos aventais típicos e não estamos em nossa instalação de nível de biossegurança 2 mais.

Antes da transfeção 2, as células 9 3 são descongeladas do nitrogênio líquido e cultivadas até atingirem 90% de confluência. Em seguida, as células são transfectadas com o gene FU e têm de 48 a 72 horas para expressar o vírus, momento em que o meio que banha as células é filtrado utilizando um filtro de 0,45 mícron e concentrado por ultracentrifugação após a concentração do vírus. Agora estamos prontos para infectar as CEM a fim de gerar aglomerados de CIPs. Durante as etapas de preparação viral, fibroblastos embrionários de camundongo com menos de três passagens são cultivados até 90% de confluência em placas de 10 centímetros, aproximadamente duas vezes 10 à sexta potência de células por placa. Neste protocolo experimental específico, estamos utilizando CEM que expressam o RTTA, o que é essencial para a expressão da doxiciclina e da GFP a partir do locus endógeno OC quatro.

MES são negativos para GFP, mas as células IPS verdadeiras tornam-se positivas para GFP. Este marcador permite um método pelo qual se pode identificar as células reprogramadas. Aspire o meio de cultura dos fibroblastos e lave com 10 mL de PBS, EDTA, descarte o PBS-EDTA e adicione cinco mL de tripsina 1x e incube a 37 graus por 10 minutos. A tripsina ajudará a destacar as células do fundo das placas.

Agora, adicione nove mililitros do meio de cultura para ressuspender as células em uma suspensão de células isoladas e transfira para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, essas células são centrifugadas e formam um pellet. Após a ressuspensão do pellet, o número de células na suspensão é contado e a concentração é ajustada para oito vezes 10 à quarta potência de células por mililitro.

10 mL da suspensão celular são então transferidos para uma placa de 10 centímetros revestida com gelatina. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Após a incubação noturna, o meio de uma placa de fibroblastos é aspirado e 10 mL do meio contendo o vírus são adicionados ao meio. Incube as células de quatro horas a durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de CO₂.

No dia seguinte, aspire o meio de um prato de fibroblastos e então adicione 10 mL de meio ESL fresco. Nesta etapa, as células podem ser congeladas, expandidas ou preparadas para o início da reprogramação. Para iniciar a reprogramação, substitua o meio ESL comum por meio contendo doxiciclina para induzir a expressão dos quatro genes.

Coloque essas células no incubador e troque o meio a cada dia até que as colônias fiquem grandes o suficiente para serem selecionadas. As colônias devem tornar-se visíveis aproximadamente uma semana após o início do reprogramamento. Elas devem atingir um tamanho adequado para serem selecionadas por volta do dia 20.

Agora que se passaram 20 dias, podemos prosseguir e selecionar colônias IPS antes de colher as colônias. Deve-se lembrar de verificar o número necessário de placas de 24 poços revestidas com gelatina e irradiadas com gama DR quatro mitos uma a duas horas antes da seleção. Deve-se alimentar as colônias nas placas adicionando meio fresco imediatamente antes da seleção, adicionar 50 microlitros de tampão HEPA aos poços de uma placa de 96 poços com fundo em V imediatamente antes da seleção, lavar o recipiente contendo as colônias a serem selecionadas uma vez com PBS e adicionar 10 ml de PBS ao recipiente. Os agregados de células IPS podem ser selecionados sob microscópio estereoscópico ou invertido.

Escolha as colônias com uma ponteira pequena de pipeta e transfira-as para um poço da placa de 96 poços contendo PBS para remover os agregados. Um círculo é desenhado com a ponteira da pipeta ao redor do agregado para dispersar os aglomerados. Agora, as células reprogramadas podem ser coletadas usando o pipetador multicanal; são adicionados 20 microlitros de tripsina a cada poço.

Pipeteie para cima e para baixo três vezes, incube a 37 °C por quatro minutos. Após a incubação de quatro minutos, adicionam-se 100 microlitros de meio ES às colônias tripps nice. Pipeteie para cima e para baixo 10 vezes e transfira seis clones de cada vez.

Da placa de 96 poços para uma placa de 24 poços, utilizando uma ponteira em cada posição alternada no pipetador de 12 posições, as células são então cultivadas na placa de 24 poços em um incubador a 37 °C, com 5% de CO₂, até que as células atinjam 80 a 90% de confluência. Reponha com meio para células ES. As células provavelmente estarão prontas para expansão em três a sete dias. Alguns dias depois, agora que as células iPS estão confluentes, aspire o meio e lave as células com 1 mL de HBSS. Remova completamente o HBSS e adicione 100 microlitros de tripsina 1x e incube a 37 °C por 10 minutos. Após a incubação com tripsina, adicione 400 microlitros de meio ES e suspenda as células pipetando para cima e para baixo, obtendo uma suspensão de células individuais.

A suspensão simples de células de 500 microlitros da placa de 24 poços é então transferida para um único poço de uma placa de seis poços e incubada em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ até que as células atinjam 80 a 90% de confluência na placa de seis poços. Nesse momento, você pode prosseguir para amplificar as células para análise de Southern, blastocistos, injeções, ensaios de teratoma ou ensaios de diferenciação in vitro. E você deve lembrar de congelar alíquotas dessas células para não perder esse estoque precioso de células iPS.

Acabamos de mostrar como induzir pluripotência em fibroblastos embrionários de camundongo utilizando um sistema antiviral indutível. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.