Name: Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos embrionários de camundongo usando sistema lentiviral induzível. Este protocolo demonstra reprogramação celular com quatro fatores de transcrição para aplicações em medicina regenerativa.

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Passo 1: Descongelar 293 células e placa para a produção de lentivírus. <ol><li> Prepare 9 ml de DMEM + em um tubo de 15 ml. </li><li> Remover um frasco de congelados 293 ações do tanque de nitrogênio líquido e colocar o frasco em banho-maria a 37 ° C até que a maioria das células (mas não todos) são descongeladas. </li><li> Remove as células de congelamento frasco e colocar no tubo de 15ml a partir do passo 1. </li><li> Centrifugar a 180g por 5 min, em seguida, descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células com 10 ml de DMEM +, e transferir para um prato de gelatina revestidos de 100 mm. Incubar as células a 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 até que sejam confluentes 80-90%. </li><li> Passagem dos 293 células: células de lavagem com PBS, aspirar o PBS, e adicionar 4 ml por 10 cm de prato de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubar por 1 min a 37 ° C. </li><li> Separar células de pratos tocando, ressuspender com 10 ml DMEM + médio, e transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar a 180g por 5 min, e aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar volume apropriado de DMEM + meio, e acabar com as células em uma suspensão única célula por pipetagem cima e para baixo várias vezes. </li><li> Contar o número de células e ajustar a concentração para 8x10 5 células por ml com meio de FP. </li><li> Células de semente de 8x10 6 células (10 ml) por 100 mm de prato, cultura e incubar durante a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Passo 2: Transfectar 293 células com plasmídeos lentivírus eo vírus da colheita <ol><li> Para cada placa de 10 cm, usar 10 mg de FUW-Teto-cDNA (Oct4, Sox2, KLF4 ou c-Myc) backbone lentivírus com 2.5ug de PMD-G e 7,5 mcg de pPax2. </li><li> Enquanto as três alíquotas plasmídeos em um tubo, entregar 30μl de Fugene reagente transfecção 6 em um segundo tubo contendo 500μl de DMEM sem soro e misture delicadamente com o dedo tocando e incubar por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicione a mistura de DNA gota a gota dentro do tubo Fugene 6/DMEM-containing, misture delicadamente tocando dedo e incubar por 20 min. </li><li> Adicione o DNA / Fugene 6 gotas complexo no prato de 293, e incubar durante a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Na manhã seguinte: Aspirar a transfecção reagentes contendo meio, adicionar 5 ml de meio fresco ES célula, e as células voltem para a incubadora. </li><li> Às 48 horas e 72 horas após a transfecção, recolher o meio do 293, usando um de 10 ml em seringa descartável estéril, filtrando-a através de um poro filtro de tamanho 0,45 mícrons acetato de celulose, e transferir para um tubo de 15 ml. </li><li> Concentrar o sobrenadante vírus por ultracentrifugação. Ressuspender o sedimento vírus no volume desejado e fazer amixture de partes iguais do meio contendo Oct-3/4-, Sox2, KLF4 e c-Myc-lentivírus. </li><li> Ao fazer o vírus, prepare Oct4-neo/rtTA ou Oct4-GFP/rtTA MEFs (passagem &lt;3) a 90% na confluência de 10 cm pratos (2x10 6 células por prato) </li><li> Aspirar o meio de cultura e lavar com 10 ml de PBS. </li><li> Descartar PBS, adicionar 1 ml para cada prato de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubar a 37 ° C por 10 min. </li><li> Adicionar 9 ml do meio de cultura, suspender as células de uma única célula, e transferir para um tubo de 15 ml. </li><li> Contar o número de células, e ajustar a concentração para 8x10 4 células por ml. Transferência de 10 ml de suspensão de células (8x10 5 células) para um prato de 10 cm revestidas com gelatina. Incubar o prato durante a noite a 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Aspirar o meio de um prato de fibroblastos, e adicione 10 ml do meio-vírus contém. Incubar as células a partir de 4 h durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Após 24 aspirar o médio de um prato de fibroblastos, e adicione 10 ml de meio fresco ES celular. </li><li> Substituir médio de células ES regulares com meio contendo doxiciclina para iniciar a expressão dos quatro genes, ou seja, iniciar a reprogramação. </li><li> Se estiver usando um repórter Oct4-neo, em seguida, iniciar a seção de drogas a qualquer momento entre 6 e 9 dias. </li><li> Mudar o meio todos os dias até as colônias tornam-se grandes o suficiente para ser pego. Colônias deve primeiro tornar-se visíveis cerca de uma semana após o início da reprogramação. Eles devem tornar-se grande o suficiente para ser pego por volta do dia 20. </li></ol> Passo 3: Pegando as colônias iPS Dia antes de escolher: <ol><li> Semente do número necessário de gelatina revestido placas de 24 poços com γ-irradiados DR4 MEFs </li></ol> Escolher Clones no dia 1: <ol><li> Alimentam as colônias nas placas de 1-2 horas antes de escolher. </li><li> Adicionar 15 mL de PBS aos poços de uma antena V de fundo de 96 poços. </li><li> Lavar a cápsula contendo as colônias para ser escolhido uma vez com PBS e adicione 10 ml de PBS para o prato. </li><li> Escolha as colônias com as pequenas pontas de pipeta 5μl (definir o Pipetman P20 em 4 mL). Transferência de colonies a um poço no prato de 96 poços. </li><li> Adicionar 20 mL de tripsina a cada poço usando o multi-canal (12) pipetor. Pipeta cima e para baixo 3 vezes. Incubar a 37 ° C por 4 minutos. </li><li> Adicionar 100 l de meio de ES para as colônias tripsinizados. Pipeta cima e para baixo 10 vezes. Transferência de seis clones de uma vez do prato de 96 poços para um prato de 24 poços, utilizando uma ponta em todas as outras posições no pipetor lugar 12. </li><li> Cultivar as células na placa de 24 poços a 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 até alcançar as células confluência de 80-90%, a alimentação diária com ES meio celular. Células provavelmente irá estar pronto para expandir-se em 3-7 dias. </li></ol> Passo 4 <ol><li> Expansão de células iPS <ol><li> Aspirar o meio, e lavar as células com 1 ml de PBS. </li><li> Remover completamente PBS, adicionar 0,1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C por 10 min. </li><li> Adicionar 0,4 ml do meio de ES e suspender as células mediante pipetando para cima e para baixo para suspensão única célula. </li><li> Transferir a suspensão de célula para um poço de placa 6-bem, adicionar 1,5 ml de meio de células ES, e incubar a 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 até atingir 80-90% de células confluência em 6-lamelas. Neste ponto, preparar estoque congelado das células, como se segue. </li></ol></li><li> Preparação de ações congelar <ol><li> Aspirar o meio, e lavar as células com 2 ml de PBS. </li><li> Remover completamente PBS, adicionar 0,5 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C por 10 min. </li><li> Adicionar 2 ml do meio de ES e suspender as células mediante pipetando para cima e para baixo para suspensão única célula. </li><li> Transferir a suspensão celular a um tubo de 15 ml, contar o número de células e spin down das células. </li><li> Desprezar o sobrenadante, ressuspender as células com meio ES para a concentração em 2x10 6 células por ml. </li><li> Prepare 2 ES meio de congelamento de células (DMSO 20% em média ES) e alíquota é de 0,5 ml por frasco. </li><li> Transferência de 0,5 ml da suspensão de células para congelar os frascos e misture delicadamente. </li><li> Colocar os frascos em um recipiente de células de congelamento e mantê-lo a -80 ° C durante a noite; transferência para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento de longo prazo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

Neste vídeo, que demonstram como usar um sistema induzível, lentiviral para gerar GFP-positivas, células pluripotentes a partir de iPS MEFs derivadas de camundongos Oct4-GFP/R26-M2rtTA e Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Este procedimento é um método útil para gerar células iPS, pois permite o controle de expressão do transgene durante o processo de reprogramação. Embora o uso de vírus na geração de células iPS impede o uso dessas células em um ambiente clínico, este procedimento nos permite responder a algumas das grandes questões biológicas que sublinhar o processo ainda definido reprogramação.

<table><tbody><tr><td>Doxiciclina hyclate</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de ips a partir de células mefs através da expressão forçada de sox-2, oct-4, c-myc e klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotência pode ser induzida em murinos diferenciados por transdução viral de Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Nós planejamos uma estratégia de reprogramação em que estes quatro fatores de transcrição são expressos de doxiciclina (Dox)-induzível lentivirais (Brambrink et al., 2008). Usando essas construções induzível, podemos derivar-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células de fibroblastos de rato embrionárias (MEFs). Neste vídeo, demonstramos o procedimento para a geração de lentivírus induzível que expressam os quatro fatores de transcrição e mostrar como a infectar MEFs com estes vírus, a fim de produzir células iPS. Usando lentivírus induzível, a expressão dos quatro fatores na controlada pela adição de doxicilina ao meio de cultura. A vantagem deste sistema sobre a infecção retroviral tradicionais é a capacidade de transformar os genes dentro e fora de forma que a cinética de reprogramação e os requisitos de expressão gênica podem ser analisados ​​em detalhe.

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

A pluripotência pode ser induzida em células murinas diferenciadas por transdução viral de Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

Há mais de 50 anos, foi levantada a hipótese de que células diferenciadas terminalmente, como fibroblastos da pele, poderiam ser forçadas a assumir um estado pluripotente semelhante ao das células-tronco embrionárias. A base para esse conceito foi a observação de que todos os tipos celulares, com poucas exceções menores, possuem o mesmo código genético e que a única diferença entre os tipos celulares está na forma como o código é lido. Essa capacidade de alterar a identidade celular de uma célula diferenciada para um estado pluripotente é denominada reprogramação celular.Após meio década de pesquisa, demonstrou-se recentemente que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição pode reprogramar fibroblastos da pele para se tornarem pluripotentes. O impacto dessa descoberta é enorme. Além da importância para a biologia básica, ela também supera as principais objeções éticas ao uso de células-tronco embrionárias humanas para terapia transplantar.Para que a reprogramação ocorra, quatro genes que codificam os fatores de transcrição OC4, Sox2, c-Myc e K4 precisam ser empacotados e inseridos em um cultivo celular de lentivírus. O meio contendo o vírus purificado é então adicionado a uma placa de cultura celular contendo uma alta densidade de fibroblastos, e dentro dessa placa, algo surpreendente acontece. Uma pequena fração dos fibroblastos é infectada pelos quatro vírus carreadores dos fatores de transcrição e começa a desdiferenciar-se.Eles passam por mudanças drásticas em sua morfologia e proliferação e começam a se dividir em grandes aglomerados esféricos formados por células-tronco pluripotentes. Após duas a três semanas de cultivo em condições de células-tronco embrionárias, colônias de fibroblastos reprogramados podem ser isoladas manualmente e expandidas in vitro. Uma vez purificadas, essas células podem ser utilizadas para gerar camundongos quiméricos, nos quais uma certa porcentagem das células derivadas dos fibroblastos desdiferenciados pode contribuir para diferentes tecidos do camundongo.Em quimeras nas quais o material genético dos fibroblastos originais contribuiu para a linhagem germinativa, o código genético pode ser transmitido para a próxima geração, e então para a seguinte, e assim sucessivamente. Embora o uso de um sistema de entrega viral seja atualmente um entrave para aplicações clínicas, isso provavelmente será superado em breve. Neste vídeo, membros do laboratório de Yin demonstrarão como células-tronco pluripotentes induzidas são derivadas de fibroblastos embrionários de camundongo.Olá, sou Grant Welted do laboratório de Rudolph Jish no Whitehead Institute for Biomedical Research em Cambridge, Massachusetts. E eu sou Tobias Bro brink, também do laboratório Ish. Hoje vamos mostrar a vocês a geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela introdução de quatro cDNAs: OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4, utilizando lentivírus que expressam esses quatro cDNAs a partir de um promotor Tet-OCMV.Isso permite o controle preciso da expressão desses quatro transgenes após a infecção de fibroblastos embrionários de camundongo. O protocolo que estamos mostrando hoje envolve o manuseio de lentivírus que pode potencialmente infectar células humanas. É fundamental que você sempre siga procedimentos seguros e entre em contato com o seu departamento de segurança antes de tentar realizá-lo por conta própria.Então, vamos gerar algumas células IPS para produzir lentivírus que converterão células ME em células IPS. Células 293 precisam ser transfectadas com três plasmídeos: Paks dois, que fornece os elementos genéticos necessários para o empacotamento viral; o esqueleto viral, que é um lentivírus FUW TE OCMV com um dos quatro auxiliares CD T quatro, SOX dois, KLA quatro ou CMIC; e PMDG, que expressa a glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular ou VSV.Isso produz o vírus que irá gerar o vírus atrópico. Portanto, é necessário seguir os procedimentos adequados de nível de biossegurança 2 mais. Neste vídeo específico, não estamos manipulando realmente o vírus infeccioso, por isso não estamos usando nossos aventais típicos e não estamos em nossa instalação de nível de biossegurança 2 mais.Antes da transfeção 2, as células 9 3 são descongeladas do nitrogênio líquido e cultivadas até atingirem 90% de confluência. Em seguida, as células são transfectadas com o gene FU e têm de 48 a 72 horas para expressar o vírus, momento em que o meio que banha as células é filtrado utilizando um filtro de 0,45 mícron e concentrado por ultracentrifugação após a concentração do vírus. Agora estamos prontos para infectar as CEM a fim de gerar aglomerados de CIPs. Durante as etapas de preparação viral, fibroblastos embrionários de camundongo com menos de três passagens são cultivados até 90% de confluência em placas de 10 centímetros, aproximadamente duas vezes 10 à sexta potência de células por placa. Neste protocolo experimental específico, estamos utilizando CEM que expressam o RTTA, o que é essencial para a expressão da doxiciclina e da GFP a partir do locus endógeno OC quatro.MES são negativos para GFP, mas as células IPS verdadeiras tornam-se positivas para GFP. Este marcador permite um método pelo qual se pode identificar as células reprogramadas. Aspire o meio de cultura dos fibroblastos e lave com 10 mL de PBS, EDTA, descarte o PBS-EDTA e adicione cinco mL de tripsina 1x e incube a 37 graus por 10 minutos. A tripsina ajudará a destacar as células do fundo das placas.Agora, adicione nove mililitros do meio de cultura para ressuspender as células em uma suspensão de células isoladas e transfira para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, essas células são centrifugadas e formam um pellet. Após a ressuspensão do pellet, o número de células na suspensão é contado e a concentração é ajustada para oito vezes 10 à quarta potência de células por mililitro.10 mL da suspensão celular são então transferidos para uma placa de 10 centímetros revestida com gelatina. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Após a incubação noturna, o meio de uma placa de fibroblastos é aspirado e 10 mL do meio contendo o vírus são adicionados ao meio. Incube as células de quatro horas a durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de CO₂.No dia seguinte, aspire o meio de um prato de fibroblastos e então adicione 10 mL de meio ESL fresco. Nesta etapa, as células podem ser congeladas, expandidas ou preparadas para o início da reprogramação. Para iniciar a reprogramação, substitua o meio ESL comum por meio contendo doxiciclina para induzir a expressão dos quatro genes.Coloque essas células no incubador e troque o meio a cada dia até que as colônias fiquem grandes o suficiente para serem selecionadas. As colônias devem tornar-se visíveis aproximadamente uma semana após o início do reprogramamento. Elas devem atingir um tamanho adequado para serem selecionadas por volta do dia 20.Agora que se passaram 20 dias, podemos prosseguir e selecionar colônias IPS antes de colher as colônias. Deve-se lembrar de verificar o número necessário de placas de 24 poços revestidas com gelatina e irradiadas com gama DR quatro mitos uma a duas horas antes da seleção. Deve-se alimentar as colônias nas placas adicionando meio fresco imediatamente antes da seleção, adicionar 50 microlitros de tampão HEPA aos poços de uma placa de 96 poços com fundo em V imediatamente antes da seleção, lavar o recipiente contendo as colônias a serem selecionadas uma vez com PBS e adicionar 10 ml de PBS ao recipiente. Os agregados de células IPS podem ser selecionados sob microscópio estereoscópico ou invertido.Escolha as colônias com uma ponteira pequena de pipeta e transfira-as para um poço da placa de 96 poços contendo PBS para remover os agregados. Um círculo é desenhado com a ponteira da pipeta ao redor do agregado para dispersar os aglomerados. Agora, as células reprogramadas podem ser coletadas usando o pipetador multicanal; são adicionados 20 microlitros de tripsina a cada poço.Pipeteie para cima e para baixo três vezes, incube a 37 °C por quatro minutos. Após a incubação de quatro minutos, adicionam-se 100 microlitros de meio ES às colônias tripps nice. Pipeteie para cima e para baixo 10 vezes e transfira seis clones de cada vez.Da placa de 96 poços para uma placa de 24 poços, utilizando uma ponteira em cada posição alternada no pipetador de 12 posições, as células são então cultivadas na placa de 24 poços em um incubador a 37 °C, com 5% de CO₂, até que as células atinjam 80 a 90% de confluência. Reponha com meio para células ES. As células provavelmente estarão prontas para expansão em três a sete dias. Alguns dias depois, agora que as células iPS estão confluentes, aspire o meio e lave as células com 1 mL de HBSS. Remova completamente o HBSS e adicione 100 microlitros de tripsina 1x e incube a 37 °C por 10 minutos. Após a incubação com tripsina, adicione 400 microlitros de meio ES e suspenda as células pipetando para cima e para baixo, obtendo uma suspensão de células individuais.A suspensão simples de células de 500 microlitros da placa de 24 poços é então transferida para um único poço de uma placa de seis poços e incubada em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ até que as células atinjam 80 a 90% de confluência na placa de seis poços. Nesse momento, você pode prosseguir para amplificar as células para análise de Southern, blastocistos, injeções, ensaios de teratoma ou ensaios de diferenciação in vitro. E você deve lembrar de congelar alíquotas dessas células para não perder esse estoque precioso de células iPS.Acabamos de mostrar como induzir pluripotência em fibroblastos embrionários de camundongo utilizando um sistema antiviral indutível. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

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Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

O fibroblasto embrionário de camundongo pode ser reprogramado em células-tronco pluripotentes induzidas com baixa eficiência pela expressão forçada dos fatores de transcrição Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Os raros intermediários da reação de reprogramação são FACS isolados por meio de marcação com anticorpos contra os fabricantes de superfície celular Thy-1.2, Ssea-1 e Epcam.

Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Descrevemos aqui um protocolo para a geração de iCMs usando entrega mediada por retrovírus de Gata4, Tbx5 e Mef2c em uma construção policistrônica. Este protocolo produz uma população relativamente homogênea de células reprogramadas com eficiência e qualidade aprimoradas e é valioso para estudos futuros de reprogramação de iCM.

Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos embrionários de camundongo usando sistema lentiviral induzível. Este protocolo demonstra reprogramação celular com quatro fatores de transcrição para aplicações em medicina regenerativa.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

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