Modelagem Colite murino utilizando Dextran Sulfato de Sódio (DSS)

Dextran sulfato de sódio (DSS), administrada na água de beber é um modelo de lesão inflamatória estabelecida murino de colite aguda. Este protocolo descreve o método para o tratamento DSS ea preparação dos tecidos.

Os camundongos recebem 3% de DSS na libido por quatro dias. Enquanto o peso e a presença de diarreia e sangue fecal são registrados diariamente, o TSS é substituído por água em autoclave após o quarto dia. Após três dias na água, os camundongos são sacrificados e seus cólons são removidos.

Os dois pontos são medidos e pesados. Os dois pontos são então formados em pãezinhos suíços ou salsichas e examinados ao microscópio. Este artigo em vídeo demonstrará a colheita e o processamento de cólon em um modelo murn de colite.

Este procedimento é usado para estudar a colite no laboratório do Dr. Christopher Williams, do Departamento de Biologia do Câncer da Universidade Vanderbilt, antes de iniciar o tratamento com sulfato de dextrina sódica. Os pesos da linha de base são obtidos ao longo do experimento. Os pesos diários são medidos após a pesagem dos camundongos, a produção de uma solução de sal de sódio de 3% de peso por volume, sulfato de dextrina ou DSS em água.

O DSS deve ser de baixo peso molecular para que este modelo seja eficaz, faça uma solução DSS suficiente para encher uma garrafa de água para cada gaiola de camundongos e filtre a solução com um filtro de acetato de celulose de 0,45 micrômetro. Substitua a garrafa de água potável na gaiola do mouse por uma garrafa contendo solução de 3% de DSS. Se sua instituição usa um sistema de irrigação automatizado, coloque dicas de exclusão nos bicos de irrigação para garantir que os ratos não tenham acesso a nenhuma outra fonte de água.

Após quatro dias, os camundongos são pesados novamente para quantificar as consequências sistêmicas da colite. A perda de peso é comum com lesões graves, no entanto, pode não ser aparente por mais alguns dias no mesmo dia. No quarto dia, substitua a solução DSS por água por mais três dias para permitir alguma recuperação epitelial do cólon.

Três dias depois, dia sete, os ratos são pesados novamente. O cólon pode então ser colhido dos camundongos sacrificados, conforme mostrado na próxima seção. Para colher o cólon, exponha o lado ventral do camundongo sacrificado para garantir o acesso desobstruído ao abdômen.

Molhe o abdômen completamente com etanol 70%. Segure a linha média do abdômen com uma pinça de tecido e eleve. Assim, cubra a pele usando uma tesoura de ponta fina.

Incisar o abdômen para expor o conteúdo abdominal. Estenda a incisão até a ponta do processo xifóide na linha média e, em seguida, estenda ao longo da face inferior das margens costais bilateralmente. Identifique o intestino delgado, ceco e cólon.

Disseque cuidadosamente o cólon do mesentério circundante. Depois disso, transecto o cólon aprofunda a pelve para liberar. O cólon distal do reto.

Deve-se tomar cuidado para que nenhuma artéria ou veia seja cortada. Além disso, esteja ciente de que o cólon pode rasgar facilmente. Portanto, remova suavemente o cólon do mesentério.

Passe o cólon na margem da sequência de Colona para liberar o cólon proximal. Remova o cólon e o total usando uma agulha de alimentação de calibre 20 e uma seringa de 10 mililitros para intubar e lave o cólon com PBS gelado até que o EIT esteja completamente livre das fezes. É importante manter a orientação correta do cólon, mantendo a extremidade distal do cólon mais próxima de você.

Comece medindo o comprimento do cólon usando um paquímetro digital. O comprimento do cólon é outro indicador da gravidade da lesão. A colite aumenta o edema e encurta o comprimento total do cólon.

Neste ponto, os cólons colhidos podem ser processados como salsichas para análise macroscópica ou transformados em rolo suíço para análise histológica de colite aguda. Demonstraremos essas técnicas nas seções a seguir para processar o cólon como uma salsicha Para análise macroscópica de todo o cólon, é importante manter a orientação correta do cólon. Portanto, mantenha a extremidade distal do cólon mais próxima de você.

Corte dois pedaços de sutura não absorvível, um de aproximadamente uma polegada de comprimento e o outro de duas polegadas de comprimento. Use o pedaço de sutura de duas polegadas para amarrar a extremidade distal do cólon o mais próximo possível da margem, mantendo uma boa vedação. Em seguida, coloque uma agulha de alimentação de calibre 20 contendo cinco mililitros de fosfato de formalina tamponado a 10% na extremidade proximal do cólon.

Amarre frouxamente o pedaço restante da sutura imediatamente proximal ao bulbo da agulha de alimentação. Agora segure o cólon firmemente no bulbo da agulha de alimentação e infunda quantidade suficiente de formalina, garantindo que o cólon seja expandido. Aperte o nó na sutura ao retirar a agulha de alimentação, deixando assim o cólon expandido infundido.

Como salsicha, encha um tubo cônico de 15 mililitros com 10% tamponado, formal e fosfato, e rotule o tubo. Coloque o cólon no tubo e fixe por 24 horas. Após 24 horas, despeje a formina em um recipiente de lixo apropriado e substitua-a por etanol a 70% por mais 24 horas.

Os cólons podem ser armazenados em etanol a 70% indefinidamente à temperatura ambiente. Quando estiver pronto para analisar o cólon, remova-o do tubo cônico. Corte os fios em cada extremidade com um bisturi, tomando cuidado para não danificar o cólon.

Lembre-se de que a extremidade distal tem o pedaço de barbante mais longo. Corte o cólon longitudinalmente da extremidade distal para a proximal para formar uma folha longa. O cólon agora pode ser visto sob um microscópio de dissecação.

Corte os dois pontos longitudinalmente e coloque-os como uma folha plana. Rolar o cólon requer dois pares de fórceps e uma técnica de duas mãos. Segure ambas as bordas laterais da margem distal do cólon com uma pinça e role sequencialmente o cólon, girando e soltando a pinça seguindo para a margem proximal, gerando assim uma espiral com uma terceira dimensão ou rolo suíço.

Se os dois pontos aderirem ao papel watman, molhe o papel e os dois pontos com uma pequena quantidade de PBS para manter a forma. Segure o rolo firmemente com uma pinça e faça o transecto com uma agulha de calibre 27 e meio. Prenda o rolo dobrando a agulha ao sair do rolo.

Agora, coloque o rolo em um de tecido rotulado e coloque o em um frasco de fosfato de formalina tamponado a 10%. Deixe em temperatura ambiente por 24 horas para fixar o tecido. Após 24 horas, retire a formalina e substitua por etanol a 70% por mais quatro horas.

Os cólons podem ser armazenados em etanol a 70% indefinidamente à temperatura ambiente. Este modelo permite ao pesquisador obter, fixar e analisar cólons, permitindo assim a análise da gravidade da colite. Para análise macroscópica de todo o cólon, o cólon pode ser processado como uma salsicha infundida com formalina e completamente expandida.

A salsicha aberta deve ficar plana. Se o método da salsicha tiver sido realizado corretamente, o cólon fixo será dilatado e toda a superfície mucosa poderá ser facilmente manipulada e visualizada ao microscópio de dissecação. Para análise histológica, o cólon pode ser processado como um rolo suíço.

O rolo é preso com uma agulha e colocado em um de tecido para fixação. Quando o rolo é cortado e montado, ele deve formar uma fatia representativa de todo o cólon, se enrolado corretamente, seções do rolo suíço podem ser coradas com hematina e ASIN para determinar a extensão da lesão colônica. Lembrando que a extremidade distal do cólon está no centro do rolo no slide.

Neste exemplo, a inflamação e os danos à cripta são aparentes no cólon tratado com DSS em comparação com um controle tratado com água. Acabamos de mostrar como colher e processar cólon a partir de um modelo murino de colite aguda. Ao realizar este procedimento, é importante que você esteja bem organizado antes de sacrificar.

Os ratos, por exemplo, têm todos os tubos e rotulados para cada rato e todas as ferramentas e reagentes prontamente disponíveis. Além disso, mantenha registros detalhados do peso do mouse e do comprimento do cólon. Por fim, certifique-se de ter alocado tempo suficiente para o processamento.

Geralmente, leva 15 minutos por mouse para um novato e seis a oito minutos para alguém mais experiente nessa técnica.