Modelagem Colite murino utilizando Dextran Sulfato de Sódio (DSS)

Os camundongos recebem 3% de DSS no lugar da água potável durante quatro dias. Enquanto o peso e a presença de diarreia e sangue nas fezes são registrados diariamente, o DSS é substituído por água autoclavada após o quarto dia. Após três dias com água, os camundongos são eutanasiados e seus cólons são removidos.

Os cólons são medidos e pesados. Em seguida, os cólons são moldados em rolinhos suíços ou salsichas e examinados ao microscópio. Este artigo em vídeo demonstrará a coleta e o processamento de cólons em um modelo murino de colite.

Este procedimento é utilizado para estudar colite no laboratório do Dr. Christopher Williams do Departamento de Biologia do Câncer da Universidade Vanderbilt, antes do início do tratamento com sulfato de dextrana sódica. Os pesos basais são obtidos ao longo do experimento. Pesos diários são registrados após os camundongos serem pesados, preparando-se uma solução de sulfato de dextrana sódica, ou DSS, em água a 3% peso por volume.

O DSS deve ter um baixo peso molecular para que este modelo seja eficaz; prepare quantidade suficiente de solução de DSS para encher uma garrafa de água para cada gaiola de camundongos e filtre a solução com um filtro de acetato de celulose de 0,45 micrômetro. Substitua a garrafa de água potável na gaiola dos camundongos por uma garrafa contendo solução de DSS a 3%. Se a sua instituição utilizar um sistema automatizado de fornecimento de água, coloque ponteiras de exclusão nas bicas de água para garantir que os camundongos não tenham acesso a qualquer outra fonte de água.

Após quatro dias, os camundongos são pesados novamente para quantificar as consequências sistêmicas da colite. A perda de peso é comum em lesões graves, porém pode não ser aparente por mais alguns dias no mesmo dia. No dia quatro, substitua a solução de DSS por água por mais três dias para permitir alguma recuperação do epitélio colônico.

Três dias depois, no sétimo dia, os camundongos são pesados novamente. O cólon pode então ser coletado dos camundongos eutanasiados conforme mostrado na próxima seção. Para coletar o cólon, exponha o lado ventral do camundongo eutanasiado para garantir acesso desobstruído ao abdômen.

Umedeça completamente o abdômen com etanol 70%. Segure a linha média do abdômen com pinça de tecido e eleve. Assim, levante a pele usando tesoura de ponta fina.

Incise o abdômen para expor o conteúdo abdominal. Estenda o corte até a ponta do processo xifoide na linha média e, em seguida, prolongue-o ao longo da borda inferior das margens costais bilateralmente. Identifique o intestino delgado, ceco e cólon.

Disseque cuidadosamente o cólon do mesentério circundante, fazendo uma dissecção delicada. Em seguida, seccione o cólon em direção à pelve para liberar o cólon distal do reto.

Deve-se ter cuidado para que nenhuma artéria ou veia seja cortada. Além disso, esteja atento ao fato de que o cólon pode se romper facilmente. Portanto, remova o cólon do mesentério com delicadeza.

Seccione o cólon na margem do sequelo colônico para soltar a porção proximal do cólon. Remova o cólon inteiro e, utilizando uma cânula alimentadora de 20 gauge e uma seringa de 10 mililitros, entube e lave o cólon com PBS gelado até que o efluente esteja completamente livre de fezes. É importante manter a orientação correta do cólon mantendo a extremidade distal do cólon mais próxima de você.

Inicie medindo o comprimento do cólon usando um paquímetro digital. O comprimento do cólon é outro indicador da gravidade da lesão. A colite aumenta o edema e encurta o comprimento total do cólon.

Neste momento, os cólons colhidos podem ser processados como salsichas para análise macroscópica ou transformados em rocambole suíço para análise histológica da colite aguda. Demonstraremos essas técnicas nas seções seguintes para processar o cólon como uma salsicha. Para análise macroscópica de todo o cólon, é importante manter a orientação correta do cólon. Portanto, mantenha a extremidade distal do cólon mais próxima de você.

Corte dois pedaços de fio cirúrgico não absorvível, um com aproximadamente uma polegada de comprimento e o outro com duas polegadas de comprimento. Use o pedaço de duas polegadas de fio para ligar a extremidade distal do cólon o mais próximo possível da margem, mantendo ainda um bom selamento. Em seguida, insira uma agulha de alimentação de calibre 20 contendo cinco mililitros de formalina tamponada a 10% na extremidade proximal do cólon.

Amarrar frouxamente o pedaço restante da sutura imediatamente proximal à ampola da agulha de alimentação. Agora, segure firmemente o cólon na região da ampola da agulha de alimentação e infunda uma quantidade suficiente de formalina, garantindo que o cólon se expanda. Aperte o nó da sutura ao retirar a agulha de alimentação, deixando assim o cólon expandido e infundido.

Como um salsichão, encha um tubo cônico de 15 mililitros com formalina tamponada a 10%, fosfato, e rotule o tubo. Coloque o cólon no tubo e fixe por 24 horas. Após 24 horas, despeje a formalina em um recipiente apropriado para resíduos e substitua por etanol a 70% por mais 24 horas.

O cólon pode ser armazenado em etanol 70% indefinidamente à temperatura ambiente. Quando estiver pronto para analisar o cólon, remova-o do tubo cônico. Corte os fios em cada extremidade com um bisturi, tomando cuidado para não danificar o cólon.

Lembre-se de que a extremidade distal possui o pedaço mais longo de barbante. Corte o cólon longitudinalmente da extremidade distal para a proximal, de modo que forme uma tira longa. O cólon pode agora ser visualizado ao microscópio estereoscópico.

Corte o cólon longitudinalmente e disponha-o como uma folha plana. Enrolar o cólon requer dois pares de pinças e uma técnica com ambas as mãos. Segure ambas as bordas laterais da margem distal do cólon com as pinças e prossiga para enrolar sequencialmente o cólon girando e soltando as pinças em direção à margem proximal, gerando assim uma espiral com uma terceira dimensão ou formato de rolo suíço.

Se o cólon aderir ao papel Watman, umedeça o papel e o cólon com uma pequena quantidade de PBS para manter a forma. Segure o rolo firmemente com pinça e seccione com uma agulha de calibre 27 e meio. Fixe o rolo dobrando a agulha ao sair do rolo.

Agora, coloque o rolo em uma cassete de tecido identificada e coloque a cassete em um frasco contendo formalina tamponada a 10%. Deixe em temperatura ambiente por 24 horas para fixar o tecido. Após 24 horas, descarte a formalina e substitua por etanol a 70% por um período adicional de quatro horas.

Os cólons podem ser armazenados em etanol 70% indefinidamente à temperatura ambiente. Este modelo permite ao pesquisador obter, fixar e analisar cólons, possibilitando assim a análise da gravidade da colite. Para análise macroscópica de todo o cólon, o cólon pode ser processado como uma salsicha que é infundida com formalina e completamente expandida.

A sonda aberta deve ficar plana. Se o método da sonda tiver sido realizado corretamente, o cólon fixado estará dilatado e toda a superfície mucosa poderá ser facilmente manipulada e visualizada ao microscópio estereoscópico. Para análise histológica, o cólon pode ser processado na forma de rolo suíço.

O rolo é fixado com uma agulha e colocado em uma cassete para tecido, destinada à fixação. Quando o rolo é cortado e montado, deve formar uma fatia representativa de todo o cólon, se enrolado corretamente; seções do rolo suíço podem ser coradas com hematina e ASIN para determinar a extensão da lesão colônica. Lembre-se de que a extremidade distal do cólon está no centro do rolo sobre a lâmina.

Neste exemplo, a inflamação e o dano criptal são evidentes no cólon tratado com DSS em comparação com o controle tratado com água. Acabamos de mostrar como colher e processar cólons a partir de um modelo murino de colite aguda. Ao realizar este procedimento, é importante que você esteja bem organizado antes da eutanásia.

Os camundongos, por exemplo, têm todos os tubos e cassete etiquetados para cada animal, além de todas as ferramentas e reagentes prontamente disponíveis. Além disso, mantenha registros detalhados do peso dos camundongos e do comprimento do cólon. Por fim, certifique-se de que você tenha reservado tempo suficiente para o processamento.

Normalmente, leva 15 minutos por camundongo para um novato e de seis a oito minutos para alguém mais experiente nesta técnica.