Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

Neste procedimento, RNA marcado com fluorescência. Os transcritos são injetados em XUS Cytes e sua localização é monitorada. Primeiro, o RNA é marcado com nucleotídeos fluorescentes.

Em uma reação de transcrição in vitro, o RNA é então carregado em um aparelho de microinjeção. Os ovócitos são colocados em uma placa de injeção e cuidadosamente microinjetados. Finalmente, os oócitos são cultivados para permitir que a localização do RNA ocorra antes da imagem no microscópio confocal.

Olá, sou James Gagnan do laboratório da Dra. Kimberly Mallory no Departamento de Biologia Molecular, biologia celular e bioquímica da Brown University. Hoje vamos mostrar um procedimento para visualizar a localização do RNA subcelular em oócitos Xap. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a arquitetura do RNA e os fatores proteicos necessários para a localização do RNA durante o desenvolvimento inicial dos vertebrados.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, transcreva o mRNA, que é marcado radioativamente e fluorescentemente, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha. Adicione DS para degradar o DNA molde e, em seguida, pare a reação adicionando EDTA.

Remova nucleotídeos não incorporados e outras moléculas pequenas girando através de uma coluna G 50. O RNA é então concentrado por precipitação de etanol, lavado e ressuspenso. Depois de determinar a concentração por contagem de cintilação, diluir o RNA a 50 nano molar e armazenar em alíquotas de cinco microlitros a 80 graus Celsius negativos.

Quando estiver pronto para realizar a microinjeção, descongele um Eloqua do RNA marcado a 70 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, gire por 10 minutos na velocidade máxima em uma microcentrífuga em temperatura ambiente para remover partículas e manter no gelo. Em seguida, isole os pedaços de corte de citos do ovário xap post lavu em um cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de três miligramas por mililitro.

Colagenase em tampão fosfato de potássio 0,1 molar em pH 7,4. Agite suavemente a 18 graus Celsius devido à variação de lote para lote. O tempo de tratamento com colagenase pode variar e deve ser monitorado cuidadosamente por meio de inspeção visual.

Para garantir a desfolha, continue agitando por 15 minutos ou até que os oócitos estejam visivelmente separados do ovário, permita que os oócitos se depositem no fundo do tubo cônico. Remova a solução e substitua por tampão MBSH. Repita isso, lave mais duas vezes para um total de três lavagens.

Em seguida, classifique manualmente o estágio três a quatro CYTES e o buffer MBSH em um microscópio óptico padrão. Os citos do estágio três são completamente opacos, mas brancos. Enquanto os citos do estágio quatro são ligeiramente maiores e salpicados de pigmento.

Os citos ligeiramente transparentes são muito jovens e os citos totalmente pigmentados ou com distribuição de pigmento polarizada são muito velhos. Finalmente, prepare as agulhas para microinjeção usando capilares de três polegadas e meia puxando e chanfrando para fazer agulhas com um diâmetro externo de aproximadamente 0,05 milímetros. Agora que os oócitos e agulhas de mRNA estão prontos, prossiga para a microinjeção.

Comece calibrando a agulha com água desy para fornecer dois nanômetros por injeção de injeção. Frente. Carregue a agulha usando um microinjetor controlado por gás e calibre o tamanho da gota usando um micrômetro após a calibração, carregue o RNA a ser injetado na agulha. Em seguida, coloque os oócitos classificados em um prato de injeção No tampão MBSH, o prato contém uma camada de espuma de borracha preta.

A cita branca se destaca bem contra um fundo preto. Em seguida, injete cuidadosamente em cada oócito dois litros de RNA a 50 nanomolares. Certifique-se de injetar cada oócito apenas uma vez e verifique regularmente se a agulha está entupida quando a injeção estiver concluída.

Expulse o RNA restante, lave a agulha com água e carregue o próximo RNA para injeção. Após a injeção, transfira os citos injetados para um poço de uma placa estéril de 24 poços até mil. Os CYTES podem ser cultivados por poço.

Remova o tampão e substitua-o por 400 microlitros de meio de cultura de citos por poço. Em seguida, coloque a placa de cultura dentro de um recipiente de plástico com uma toalha de papel úmida para manter um ambiente úmido durante a cultura, incube os oócitos a 18 graus Celsius para pontos de tempo que variam entre oito e 48 horas após o período de incubação desejado. Os oócitos podem ser preparados para microscopia após a incubação dos oócitos injetados.

Separe todos os oócitos mortos e coloque os oócitos sobreviventes em frascos de vidro. A sobrevivência de mais de 90% dos oócitos é observada rotineiramente. Substitua o tampão pelo fixador M-E-M-F-A e balance os citos por 20 minutos.

Proteja os oócitos da luz solar durante a fixação após o término do período de fixação. Lave os oócitos removendo o fixador e substituindo-os por um volume igual de tampão MBSH. Repita esta lavagem mais uma vez para um total de duas lavagens.

Em seguida, lave os oócitos em metanol anidro. Primeiro, remova metade do volume e substitua por metanol. Repita isso mais duas vezes.

Após essas lavagens, remova toda a solução e substitua por metanol. Repita esta lavagem com metanol mais uma vez. Os oócitos fixos e desidratados podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para a imagem.

Antes de fazer a imagem, adicione o meio de limpeza de Marie a um prato de flúor WPI com fundo de vidro para cobrir a superfície de imagem. Transfira cuidadosamente os oócitos do metanol para a placa de flúor, minimizando o volume de metanol transferido para os oócitos em um microscópio confocal invertido, tanto um Zeiss LSM cinco 10 quanto um aica TCSs P dão bons resultados. Agora mostraremos algumas imagens representativas da localização do RNA subcelular imediatamente após a microinjeção O RNA fluorescente pode ser visto no núcleo após oito horas de cultivo do controle marcado com fluorescência.

O RNA pode ser visto uniformemente distribuído no citoplasma do oócito. No entanto, um RNA marcado com fluorescência contendo sequências que recrutam a maquinaria de transporte pode ser visto no processo de localização subcelular para o pólo vegetal do oócito. Acabamos de mostrar como microinjetar RNAs marcados com fluorescência em zap cytes e observar a localização do RNA por microscopia confocal.

Ao fazer este procedimento, é importante usar soluções tratadas deci para evitar a contaminação de RNAs para cultura, seus citos em OCM contendo antibióticos e para proteger seus citos da luz solar sempre que possível para evitar o fotobranqueamento. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.