Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos
14 de janeiro de 2010
Visualização de In vivo RNA de transporte é realizado por microinjeção de transcrições fluorescente etiquetado RNA em Xenopus Oócitos, seguido por microscopia confocal.
Neste procedimento, RNA marcado com fluorescência. Os transcritos são injetados em XUS Cytes e sua localização é monitorada. Primeiro, o RNA é marcado com nucleotídeos fluorescentes.
Em uma reação de transcrição in vitro, o RNA é então carregado em um aparelho de microinjeção. Os ovócitos são colocados em uma placa de injeção e cuidadosamente microinjetados. Finalmente, os oócitos são cultivados para permitir que a localização do RNA ocorra antes da imagem no microscópio confocal.
Olá, sou James Gagnan do laboratório da Dra. Kimberly Mallory no Departamento de Biologia Molecular, biologia celular e bioquímica da Brown University. Hoje vamos mostrar um procedimento para visualizar a localização do RNA subcelular em oócitos Xap. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a arquitetura do RNA e os fatores proteicos necessários para a localização do RNA durante o desenvolvimento inicial dos vertebrados.
Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, transcreva o mRNA, que é marcado radioativamente e fluorescentemente, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha. Adicione DS para degradar o DNA molde e, em seguida, pare a reação adicionando EDTA.
Remova nucleotídeos não incorporados e outras moléculas pequenas girando através de uma coluna G 50. O RNA é então concentrado por precipitação de etanol, lavado e ressuspenso. Depois de determinar a concentração por contagem de cintilação, diluir o RNA a 50 nano molar e armazenar em alíquotas de cinco microlitros a 80 graus Celsius negativos.
Quando estiver pronto para realizar a microinjeção, descongele um Eloqua do RNA marcado a 70 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, gire por 10 minutos na velocidade máxima em uma microcentrífuga em temperatura ambiente para remover partículas e manter no gelo. Em seguida, isole os pedaços de corte de citos do ovário xap post lavu em um cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de três miligramas por mililitro.
Colagenase em tampão fosfato de potássio 0,1 molar em pH 7,4. Agite suavemente a 18 graus Celsius devido à variação de lote para lote. O tempo de tratamento com colagenase pode variar e deve ser monitorado cuidadosamente por meio de inspeção visual.
Para garantir a desfolha, continue agitando por 15 minutos ou até que os oócitos estejam visivelmente separados do ovário, permita que os oócitos se depositem no fundo do tubo cônico. Remova a solução e substitua por tampão MBSH. Repita isso, lave mais duas vezes para um total de três lavagens.
Em seguida, classifique manualmente o estágio três a quatro CYTES e o buffer MBSH em um microscópio óptico padrão. Os citos do estágio três são completamente opacos, mas brancos. Enquanto os citos do estágio quatro são ligeiramente maiores e salpicados de pigmento.
Os citos ligeiramente transparentes são muito jovens e os citos totalmente pigmentados ou com distribuição de pigmento polarizada são muito velhos. Finalmente, prepare as agulhas para microinjeção usando capilares de três polegadas e meia puxando e chanfrando para fazer agulhas com um diâmetro externo de aproximadamente 0,05 milímetros. Agora que os oócitos e agulhas de mRNA estão prontos, prossiga para a microinjeção.
Comece calibrando a agulha com água desy para fornecer dois nanômetros por injeção de injeção. Frente. Carregue a agulha usando um microinjetor controlado por gás e calibre o tamanho da gota usando um micrômetro após a calibração, carregue o RNA a ser injetado na agulha. Em seguida, coloque os oócitos classificados em um prato de injeção No tampão MBSH, o prato contém uma camada de espuma de borracha preta.
A cita branca se destaca bem contra um fundo preto. Em seguida, injete cuidadosamente em cada oócito dois litros de RNA a 50 nanomolares. Certifique-se de injetar cada oócito apenas uma vez e verifique regularmente se a agulha está entupida quando a injeção estiver concluída.
Expulse o RNA restante, lave a agulha com água e carregue o próximo RNA para injeção. Após a injeção, transfira os citos injetados para um poço de uma placa estéril de 24 poços até mil. Os CYTES podem ser cultivados por poço.
Remova o tampão e substitua-o por 400 microlitros de meio de cultura de citos por poço. Em seguida, coloque a placa de cultura dentro de um recipiente de plástico com uma toalha de papel úmida para manter um ambiente úmido durante a cultura, incube os oócitos a 18 graus Celsius para pontos de tempo que variam entre oito e 48 horas após o período de incubação desejado. Os oócitos podem ser preparados para microscopia após a incubação dos oócitos injetados.
Separe todos os oócitos mortos e coloque os oócitos sobreviventes em frascos de vidro. A sobrevivência de mais de 90% dos oócitos é observada rotineiramente. Substitua o tampão pelo fixador M-E-M-F-A e balance os citos por 20 minutos.
Proteja os oócitos da luz solar durante a fixação após o término do período de fixação. Lave os oócitos removendo o fixador e substituindo-os por um volume igual de tampão MBSH. Repita esta lavagem mais uma vez para um total de duas lavagens.
Em seguida, lave os oócitos em metanol anidro. Primeiro, remova metade do volume e substitua por metanol. Repita isso mais duas vezes.
Após essas lavagens, remova toda a solução e substitua por metanol. Repita esta lavagem com metanol mais uma vez. Os oócitos fixos e desidratados podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para a imagem.
Antes de fazer a imagem, adicione o meio de limpeza de Marie a um prato de flúor WPI com fundo de vidro para cobrir a superfície de imagem. Transfira cuidadosamente os oócitos do metanol para a placa de flúor, minimizando o volume de metanol transferido para os oócitos em um microscópio confocal invertido, tanto um Zeiss LSM cinco 10 quanto um aica TCSs P dão bons resultados. Agora mostraremos algumas imagens representativas da localização do RNA subcelular imediatamente após a microinjeção O RNA fluorescente pode ser visto no núcleo após oito horas de cultivo do controle marcado com fluorescência.
O RNA pode ser visto uniformemente distribuído no citoplasma do oócito. No entanto, um RNA marcado com fluorescência contendo sequências que recrutam a maquinaria de transporte pode ser visto no processo de localização subcelular para o pólo vegetal do oócito. Acabamos de mostrar como microinjetar RNAs marcados com fluorescência em zap cytes e observar a localização do RNA por microscopia confocal.
Ao fazer este procedimento, é importante usar soluções tratadas deci para evitar a contaminação de RNAs para cultura, seus citos em OCM contendo antibióticos e para proteger seus citos da luz solar sempre que possível para evitar o fotobranqueamento. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo descreve a visualização do transporte de RNA in vivo utilizando transcritos de RNA marcados com fluorescência injetados em oócitos de Xenopus. A localização do RNA é monitorada por meio de microscopia confocal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia de RNA
Antecedentes
- O transporte de RNA é essencial para diversos processos celulares.
- Os ovócitos de Xenopus servem como um sistema modelo para o estudo da dinâmica do RNA.
- A marcação fluorescente permite a visualização em tempo real do RNA.
- A microscopia confocal oferece capacidades de imagem de alta resolução.
Objetivo do Estudo
- Visualizar o transporte de RNA dentro de células vivas.
- Compreender os mecanismos de localização de RNA.
- Utilizar um método confiável para estudar a dinâmica de RNA em ovócitos.
Métodos Utilizados
- Marcação fluorescente de transcritos de RNA utilizando nucleotídeos.
- Microinjeção de RNA em oócitos de Xenopus.
- Cultivo de oócitos para permitir a localização do RNA.
- Obtenção de imagens por microscopia confocal para monitorar o transporte de RNA.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida do transporte de RNA em ovócitos.
- Demonstração da eficácia da marcação fluorescente.
- Informações sobre os padrões de localização do RNA.
- Validação da microscopia confocal como ferramenta para estudos de RNA.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem poderosa para estudar a dinâmica do RNA.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos de transporte de RNA.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia para obter novas descobertas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização da localização de RNA em ovócitos de Xenopus permite a investigação direta dos mecanismos de transporte de RNA, apoiando a descoberta inicial e a validação de alvos em biologia do desenvolvimento e polaridade celular. Essa abordagem baseada em imagem fornece confiança preditiva para estudos funcionais de elementos cis e trans-reguladores, orientando decisões ajustadas ao risco no desenvolvimento de modelos pré-clínicos. Os resultados quantitativos e reprodutíveis do método facilitam a triagem de portfólios e a redução de riscos mecanicistas em estratégias terapêuticas direcionadas ao RNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a visualização direta da localização de RNA para esclarecer as vias de transporte e os determinantes moleculares.
- Apóia a validação funcional de elementos de sequência e fatores proteicos envolvidos no tráfego de RNA.
- Oferece desvio mecanicista de riscos ao distinguir eventos de localização específicos de não específicos.
- Facilita a investigação orientada por hipóteses sobre interações RNA-proteína relevantes para a polaridade celular.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um ensaio de imagem validado para quantificar padrões de localização de RNA em células vivas.
- Apoia a padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos controlados de microinjeção e aquisição de imagens.
- Permite escalonamento para triagem dos efeitos de moléculas candidatas ou perturbações genéticas no transporte de RNA.
- Fornece leituras quantitativas adequadas para análise comparativa entre condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar defeitos na localização de RNA implicados em distúrbios do desenvolvimento.
- Proporciona continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, permitindo estudos mecanicistas em um modelo vertebrado.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao vincular mecanismos moleculares a resultados fenotípicos em ovócitos.
- Oferece valor preditivo para a identificação de biomarcadores translacionais com base na dinâmica da localização de RNA.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa técnica de imagem integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, validação mecanicista e análise quantitativa da localização de RNA em um sistema modelo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da visualização direta do transporte de RNA.
- Triagem: Garante prontidão e reprodutibilidade de ensaios para avaliar o impacto de intervenções moleculares na localização de RNA.
- Análises: Fornece saídas de imagem quantitativas para comparação estatística robusta entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas a fenótipos relevantes para doenças no desenvolvimento vertebrado inicial.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para estudar diversos eventos de localização de RNA e fatores regulatórios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de localização de RNA.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios baseados em imagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao fornecer leituras funcionais robustas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas direcionados ao RNA com base em dados mecanicistas validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microinjeção, imagem confocal e manipulação de RNA.
- Requer acesso a reagentes de marcação fluorescente e infraestrutura de microscopia de alta resolução.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de injeção e de imagem para garantir reprodutibilidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes espécies de RNA ou sistemas modelo, com base na sequência e na maquinaria de transporte.
- Limitações práticas incluem estabilidade do RNA, fotodesvanecimento e limitações de produtividade inerentes à microinjeção manual.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
