Um sistema simples de pontuação Composite Fenótipo para avaliar modelos de ratos de ataxia cerebelar

Desenvolvemos um sistema de pontuação de fenótipo composto para a avaliação da gravidade e progressão da doença. Em modelos de ataxia cerebelar em camundongos, realizamos quatro testes diferentes, teste de borda, membro posterior, aperto, marcha e cifose, usando uma escala de zero a três para cada teste para uma pontuação combinada de zero a 12. Para todas as quatro medidas, o teste de borda foi realizado para medir diretamente a coordenação.

O aperto dos membros posteriores é um marcador de progressão da doença em vários modelos de neurodegeneração em camundongos. A marcha é uma medida de coordenação e função muscular. A cifose é a curvatura da coluna vertebral na região torácica cervical, comum em modelos de camundongos do sistema motor e neurodegeneração cerebelar espinhal que realizam cada teste e registram a pontuação.

A soma média das quatro pontuações ou a pontuação média do fenótipo composto é calculada para cada grupo de camundongos e plotada. Ao aplicar este protocolo a diferentes modelos de camundongos, é importante primeiro analisar as pontuações dos testes individuais para determinar a combinação ideal das quatro medidas descritas. Este protocolo específico foi projetado para discriminar entre indivíduos afetados e não afetados, ao mesmo tempo em que quantifica a progressão do fenótipo da doença em modelos de camundongos de ataxia cerebelar espinhal.

Digite sete. Olá, sou Stephanie Fur, do laboratório da Dra. Gwen Garden no Departamento de Neurologia da Universidade de Washington. Hoje mostraremos um método simples e sensível para avaliar a gravidade da doença em modelos de camundongos com ataxia cerebelar.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para quantificar as diferenças fenotípicas em modelos de camundongos de ataxia cerebelar espinhal tipo sete ou SCA sete e para acompanhar a progressão do fenótipo SCA sete ao longo do tempo. Então vamos começar. O teste de borda é uma medida direta da coordenação, que é prejudicada em cerebelares, ataxias e muitos outros distúrbios neurodegenerativos.

Isso mede os sinais mais diretamente comparáveis aos humanos de ataxia cerebelar para evitar viés. O experimentador que realiza as avaliações não deve ter conhecimento do genótipo do animal. Durante as avaliações, as medidas individuais são pontuadas em uma escala de zero a três, onde zero representa a ausência do fenótipo e três representa sua manifestação mais grave.

Comece levantando o mouse da gaiola e colocando-o na borda da gaiola. Observe o rato enquanto ele caminha ao longo da borda da gaiola e se abaixa em sua gaiola. Um rato do tipo selvagem caminhará ao longo da borda sem perder o equilíbrio e se abaixará de volta para a gaiola graciosamente usando as patas.

Esse comportamento recebe uma pontuação zero. Se o rato perder o equilíbrio enquanto caminha ao longo da borda, mas parecer coordenado, ele receberá uma pontuação de um. Se não usar efetivamente as patas traseiras ou não puder se abaixar graciosamente na gaiola.

Ele recebe uma pontuação de dois se cair da borda ou quase enquanto caminha ou tenta se abaixar ou treme e se recusa a se mover. Apesar do incentivo, recebe uma pontuação de três. Realize o teste de borda três vezes para garantir uma medição precisa e registre a pontuação do teste de borda.

Agora vamos ver como marcar o aperto dos membros posteriores. O aperto dos membros posteriores é um marcador de progressão da doença em vários modelos de neurodegeneração em camundongos, incluindo certas ataxias cerebelares. Para iniciar a avaliação, segure a cauda perto de sua base e levante o mais claro de todos os objetos ao redor.

Observe a posição dos membros posteriores por aproximadamente 10 segundos. Se os membros posteriores forem consistentemente abertos para fora, longe do abdômen, é atribuída uma pontuação de zero. Se um membro posterior for retraído em direção ao abdômen por mais de 50% do tempo suspenso, ele recebe uma pontuação de um.

Se ambos os membros posteriores estiverem parcialmente retraídos em direção ao abdômen por mais de 50% do tempo suspenso, ele recebe uma pontuação de dois. Se os membros posteriores estiverem totalmente retraídos e tocando o abdômen por mais de 50% do tempo suspenso, ele recebe uma pontuação de três. Realize o teste três vezes e registre a pontuação de aperto do membro posterior.

Agora vamos ver como avaliar a marcha. O teste de marcha é uma medida de coordenação e função muscular. Para iniciar o teste, remova o mouse de sua gaiola e coloque-o em uma superfície plana com a cabeça, a cabeça voltada para longe do investigador.

Observe o mouse por trás enquanto ele anda. Se o camundongo se mover normalmente com o peso corporal apoiado em todos os membros com o abdômen sem tocar o solo e com os dois membros posteriores participando uniformemente, ele recebe uma pontuação de zero. Se ele mostrar um tremor ou parecer mancar enquanto caminha, ou seus pés estiverem ligeiramente apontados para longe do corpo, ele recebe uma pontuação de um.

Se mostrar um tremor severo, claudicação severa, pelve abaixada ou os pés apontarem para longe mais severamente do corpo durante a locomoção, ele é atribuído. Dois. Se o rato tiver dificuldade em avançar e arrastar o abdômen pelo chão, ele recebe um três. Observe o GA dos ratos três vezes e registre a pontuação do skate.

Agora vamos ver. O teste de cifose A cifose é uma curvatura dorsal característica da coluna vertebral. Essa é uma manifestação comum de doença neurodegenerativa envolvendo sistemas motores, incluindo ataxias cerebelares espinhais em modelos de camundongos.

É causada por uma perda de tônus muscular nos músculos da coluna vertebral secundária à neurodegeneração. Para começar, remova o mouse de sua gaiola e coloque-o em uma superfície plana. Observe-o enquanto ele caminha.

Se o mouse for capaz de endireitar facilmente a coluna enquanto caminha e não tiver cifose persistente, ele receberá uma pontuação de zero. Se o camundongo apresentar cifose leve, mas for capaz de endireitar a coluna, ele receberá uma pontuação de um. Se não conseguir endireitar, é completamente e mantém a cifose persistente, mas leve, recebe uma pontuação de dois.

Se o rato mantiver cifose pronunciada enquanto caminha ou enquanto está sentado, ele recebe uma pontuação de três. Observe a pontuação de cifose do camundongo três vezes. Coloque o mouse de volta em sua gaiola e registre sua pontuação de cifose.

Aqui está um gráfico representativo de uma avaliação fenotípica composta de um modelo de espino, ataxia cerebelar tipo sete conhecido como Flocked SCA 7 92 Q. As pontuações das quatro medidas foram somadas para cada camundongo e a pontuação composta média foi calculada para ambos os genótipos de cada idade. Aqui f Fluxed, os camundongos SCA 7 92 Q exibem um fenótipo SCA sete progressivo que é significativamente diferente dos companheiros de ninhada não transgênicos. É importante ressaltar que esse aumento da pontuação do fenótipo ao longo do tempo é consistente com a natureza progressiva da doença humana.

Acabamos de mostrar como utilizar um sistema de pontuação de fenótipo composto para avaliar a gravidade e a progressão da doença em modelos de camundongos de ataxia cerebelar. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que a obesidade é um fator de confusão em todos os quatro testes descritos. Os resultados de testes individuais podem ser analisados separadamente para primeiro determinar sua combinação ideal em um sistema de pontuação de fenótipo composto, mais apropriado para o seu modelo de camundongo.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.