Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On

O objetivo geral deste procedimento é observar o destino da zona de Repli e da RNA polimerase ou RNAP após uma colisão frontal. Isso é realizado primeiramente montando o complexo de transcrição em DNA biotinilado e imobilizando-o em tabletes e microesferas de Stripp, o que resultará no complexo de alongamento da RNAP paralisado. O segundo passo do procedimento é ligar o DNA bifurcado pré-formado ao complexo de alongamento da RNAP para formar uma forquilha de replicação a jusante da RNAP em colisão frontal.

O terceiro passo do procedimento é montar a zona de replicação e iniciar a síntese da fita líder na bifurcação de replicação. O passo final do procedimento é isolar o DNA dos grânulos magnéticos e purificar o DNA em uma coluna de purificação para PCR. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que a réplica estaciona após colidir com o complexo transcricional em orientação oposta, por meio de um gel alcalino de agarose dos produtos de DNA marcados com radionuclídeos purificados.

Olá, sou Richard Pomerance do Laboratório de Mike O'Donnell na Universidade Rockefeller. Hoje vou mostrar o seu procedimento para realizar uma colisão do ribossomo com uma polimerase do RNA em fase sólida. Utilizo este procedimento em nosso laboratório para estudar como o processo de replicação é afetado por complexos de transcrição ao longo do DNA.

Então vamos começar. Para iniciar este protocolo, misture a enzima holo de RNAP com um molde de DNA de 3,6 KB biotinilado contendo o promotor T sete A um em 100 microlitros de tampão A e incube a mistura por 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação de 10 minutos, adicione ribonucleotídeos: adenosina trifosfato, citidina fosfato e uridina adenólica, o que limitará a síntese de RNA a 20 nucleotídeos.

Incube a solução por mais 10 minutos a 37 graus Celsius para imobilizar o complexo de alongamento de RN ape interrompido nas esferas. Adicione a solução a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Deixe a mistura incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.

Purifique o complexo de alongamento de RNAP imobilizado e interrompido lavando as microesferas com 0,9 mililitros de tampão de alto sal. Para remover complexos não específicos R-N-A-P-D-N-A após cada lavagem, remova o sobrenadante por separação magnética. Esta lavagem deve ser repetida cinco vezes.

Em seguida, as esferas devem ser lavadas mais duas vezes com 0,9 mililitros do tampão A. Após a lavagem final, a bifurcação de replicação a jusante pode ser montada para formar uma bifurcação de replicação a jusante do RNAP em confronto frontal; suspenda a fita magnética com as esferas evidentes ligadas ao complexo de alongamento do RNAP paralisado em 100 microlitros do tampão quatro da New England Biolabs. A seguir, adicione 10 unidades de fosfatase alcalina de camarão ou SAP um e incube a amostra por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as esferas três vezes com 0,9 mililitros do tampão A. Em seguida, re-suspenda as esferas em 50 microlitros do tampão de reação de ligação rápida T quatro.

Adicione dois microlitros de ligase T4 rápida e DNA bifurcado pré-formado, e incube a solução por 10 minutos à temperatura ambiente. Por fim, lave as microesferas mais três vezes com 0,9 mililitros do tampão A, misturando o hexâmero, a helicase DNAB com as microesferas de estreptavidina magnética ligadas ao complexo de alongamento da RNAP paralisado e à forquilha de replicação a jusante. Prepare a solução em 150 microlitros de tampão A e incube por 30 segundos a 23 graus Celsius.

Após a breve incubação de 32º a 23 graus Celsius. Na polimerase três beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcado com DGTP e alfa P 32 marcado com DATP até um volume de 200 microlitros. Incube a amostra por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Inicie a replicação adicionando a proteína de ligação ao DNA de fita simples, DCTP e DTTP. Adicione também DTTP e DCTP marcados com alfa P 32 a um volume final de 250 microlitros. Após 10 minutos, encerre as reações adicionando 12 microlitros de EDTA 0,5 molar.

Em seguida, ferva as microesferas com strp din para liberar o DNA das microesferas. Remova qualquer DNA residual tratando as microesferas com proteinase K por 30 minutos a 50 graus Celsius. Ferva as microesferas novamente e remova o sobrenadante por separação magnética.

Purifique o sobrenatante combinado contendo o DNA utilizando o kit de purificação Kyogen PCR. Por fim, analise os produtos de DNA marcados com radionuclídeo purificados em um gel alcalino aros. A colisão da zona com uma RNAP frontal geralmente resulta em dois produtos com comprimentos de 2,5 KB e 3,6 KB. O produto de 2,5 KB representa o comprimento do DNA da bifurcação até a RNAP paralisada.

Isso resulta da estagnação da réplica ao colidir com a RNAP. O produto de 3,6 kb representa o DNA de comprimento completo e resulta da ocupação incompleta do promotor pela RNAP ou da leitura parcial da réplica através da RNAP em sentido oposto. Um bom resultado demonstra que aproximadamente 50% do DNA de comprimento completo é produzido.

No entanto, em alguns casos, ocorre uma menor ocupação do promotor pela RNAP e observa-se uma porcentagem maior de DNA de comprimento completo. Isso acontece porque uma população maior de zonas de replicação não encontra uma RNAP em sentido contrário; na ausência de uma RNAP paralisada, resulta apenas em DNA de comprimento completo. Acabamos de mostrar como realizar a replicação e a fase sólida na presença de um complexo de alongamento da RNA polimerase paralisado, ligado ao DNA. Ao realizar este procedimento, é importante lavar o complexo de transcrição paralisado com sal em alta concentração para remover a RNA polimerase em excesso, que se liga não especificamente ao DNA e inibe a replicação.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.