Name: Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a reiniciar diretamente um garfo de replicação travado por RNA polimerase em colisão head-on. Este método demonstra como o replissomo retoma a elongação após o deslocamento da RNAP, com auxílio da proteína Mfd.

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Estamos especialmente gratos a Seth Darst para fornecer proteínas RNAP e MFD e vetores de expressão. Estamos também agradecer Sergei Borukhov para fornecer Greb e Zhang Dan para suporte técnico. Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Institutes of Health (MOD) e por uma Marie-Josee e Henry Kravis Fellowship da Universidade Rockefeller (RTP).

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz e O'Donnell, Ciência 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Montagem de um complexo parou RNAP alongamento foi realizado da seguinte forma: 500 nM concentração final de E. RNAP coli σ 70 HE foi misturado com 5 nM concentração final de um modelo de DNA biotinilado 3,6 kb contendo o promotor T7A1 em 100 l de tampão A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, glicerol 10%) por 10 min a 37 ° C. 100 mM de Apu e 40 mM cada um GTP, ATP e CTP foram adicionados para um adicional de 10 min a 37 ° C. 2. Imobilização do complexo parou RNAP alongamento em gotas de estreptavidina foi realizada da seguinte forma: 200 mL de estreptavidina magnético revestido contas (Invitrogen) foram adicionados à reação acima de 10 min em temperatura ambiente. 3. Purificação do complexo alongamento imobilizado parado RNAP foi realizada da seguinte forma: As contas (de cima) foram lavadas 5 vezes com 0,9 ml de tampão contendo 0,75 M A NaCl, 200 mcg / ml de heparina e 20 mg / ml ssDNA (O sobrenadante foi removido após cada etapa de lavagem por separação magnética.) Em seguida, o pérolas foram lavadas duas vezes com 0,9 ml de tampão A. 4. Formação de um garfo de replicação a jusante em relação à cabeça-on RNAP foi realizada da seguinte forma: As contas (de cima) foram ressuspensos em 100 ml de New England Biolabs buffer de 4 e 10 unidades de Sap I (New England Biolabs) foi adicionado por 10 min a 37 ° C. As pérolas foram lavadas três vezes com 0,9 ml de tampão A e, em seguida, ressuspendido em 50 ul de tampão de reação T4 Ligadura rápida (New England Biolabs). 2 l da ligase T4 rápida (New England Biolabs) foi adicionado, juntamente com 6 nM concentração final de pré-recozido DNA bifurcada (RP10, RP22, Rp25) por 10 min em temperatura ambiente. As pérolas foram lavadas três vezes com 0,9 ml de tampão A. 5. Assembleia da replissoma e iniciação da síntese vertente líder na bifurcação de replicação foi realizada da seguinte forma: 448 pmol de DnaB (como hexâmero) foi incubada com as 150 contas mL de tampão A (20 mM Tris glicerol-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) durante 30 s em 23 ° C. 4,9 pmol de Pol III * (Pol III HE menos β), 15 pmol de β, 2 mM ATP, e 60 mM de cada dATP dGTP e foram adicionados a um volume de 200 mL e incubadas mais 5 minutos a 37 ° C. Replicação foi iniciada após a adição de 10 mg e 24 mM SSB cada um dATP e dTTP, juntamente com [α-32 P] dTTP e [α-32 P] dCTP (atividade específica, 3.000-5.000 cpm / pmol) para um volume final de 250 mL. Reações foram encerradas depois de 10 min após a adição de 12 mL de 500 mM EDTA. 6. Purificação e concentração do rádio produtos com etiqueta de DNA foi realizada da seguinte forma: As contas (de cima) foram cozidos após a reação foi encerrado, a fim de remover o DNA dos grânulos. Qualquer DNA residual continuem ligadas às esferas foi removido por tratar as contas com proteinase K em um volume de 10 ul por 30 min a 50 ° C. As contas eram então cozidos eo sobrenadante foi removido por separação magnética. O sobrenadante combinada contendo o DNA foi purificado usando o kit Qiagen Limpeza de PCR. Purificada rádio produtos com etiqueta de DNA foram então analisados ​​em gel de agarose alcalina. * Replicação na ausência de uma cabeça-on RNAP parou complexo de alongamento foi realizada como acima, no entanto, σ 70 foi omitido. Resultados representativos: Colisão do replissoma com uma cabeça-on RNAP geralmente resulta em dois produtos de 2,5 kb e 3,6 kb de comprimento. De 2,5 kb produto representa o comprimento do DNA do garfo à RNAP interrompido e os resultados de replissoma parando em cima de colisão com a RNAP. O produto 3,6 kb representam full-length do DNA e os resultados a partir de qualquer ocupação incompleta do promotor pela RNAP ou parcial replissoma leitura através da RNAP de frente. Um resultado bom ou precisa demonstra que aproximadamente 50% do DNA de longa-metragem é produzido. No entanto, em alguns casos, menos de ocupação do promotor por RNAP e ocorre uma maior porcentagem de full-length do DNA é observado desde uma maior população de replisomes não encontrar um RNAP de frente. Replicação, na ausência de um resultado RNAP interrompido em DNA de corpo inteiro apenas (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura. 1 O replissoma é impedido por uma RNAP de frente. (A) de instalação Experimental. A E. coli RNAP complexo alongamento parado foi montado em um DNA biotinilado contendo o promotor T7A1 como descrito anteriormente (9). Resumidamente, um complexo de alongamento parado foi formado 20 bps a jusante do promotor, incubando holoenzima RNAP com DNA biotinilado por 10 min seguido pela adição de Apu, GTP, ATP, CTP e de um mais 10 min. Contas estreptavidina foram adicionados para um adicional de 10 min, em seguida, as contas foram lavadas cinco vezes cada um com 0,9 ml de solução tampão com 0,75 m de NaCl, 200 heparina mg / ml, e 100 nM vertente único DNA para remover instável RNAP DNA complexos e excesso de PNT . O DNA foi então digerido com SAPI, lavado, e ligados a um DNA pré-recozido bifurcada. As pérolas foram lavadas novamente antes da montagem do replissoma. O promotor está localizado 2,5 kb do garfo e é orientado para a transcrição direta para o garfo. (B) DnaB foi adicionado então a replissoma foi montado e replicação foi iniciada tanto na presença (pista 2) ou ausência (pista 1) de um cabeça-on RNAP.

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</ol>

Lavar o complexo alongamento parou vinculados às esferas com sal elevada é crítica, a fim de remover qualquer instável ou não-especificamente moléculas RNAP vinculado. RNAP tem uma afinidade extremamente alta para a modelo primário-estruturas de DNA tipo. Assim, é necessário remover tais não-específica RNAP DNA complexos, a fim de efectuar a replicação do modelo primário. Concentrando-se o rádio produtos com etiqueta DNA usando o kit Qiagen PCR de purificação também é fundamental para se obter um sinal suficientemente alta radioativo que pode ser observado no gel.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase T4 Rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma rna polimerase head-on

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

Estudos in vivo sugerem que os garfos de replicação são presos devido aos encontros com a cabeça-de complexos de transcrição. No entanto, o destino do replissoma e RNA polimerase (RNAP) após uma colisão de frente é desconhecido. Aqui, vemos que o E. coli barracas replissoma sobre colisão com um head-on complexos de transcrição, mas em vez de desmoronar, a forquilha de replicação continua a ser muito estável e, eventualmente, recomeça alongamento após deslocar a RNAP de DNA. Nós também achamos que o fator de acoplamento transcrição-reparo, MFD, promove a reiniciar direto do garfo após o acidente, facilitando o deslocamento da RNAP. Estes resultados demonstram a estabilidade intrínseca do aparato de replicação e um novo papel para a via de reparo de transcrição acoplado na promoção de replicação passado um bloco RNAP.

O destino do replissoma depois de uma colisão com uma cabeça-de RNA polimerase (RNAP) é desconhecida. Nós achamos que as barracas replissoma sobre colisão com um RNAP de frente, mas recomeça alongamento após deslocar o RNAP de DNA. MFD promove reiniciar a replicação, facilitando o deslocamento da RNAP após a colisão.

Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On

Estudos in vivo sugerem que as forquilhas de replicação são interrompidas devido a encontros com complexos de transcrição frontais. No entanto, o destino do replissomo e do RNA ...

O objetivo geral deste procedimento é observar o destino da zona de Repli e da RNA polimerase ou RNAP após uma colisão frontal. Isso é realizado primeiramente montando o complexo de transcrição em DNA biotinilado e imobilizando-o em pastilhas e microesferas de estreptavidina, o que resultará no complexo de alongamento da RNAP paralisado. O segundo passo do procedimento é ligar o DNA bifurcado pré-formado ao complexo de alongamento da RNAP para formar uma forquilha de replicação a jusante da RNAP em colisão frontal.O terceiro passo do procedimento é montar a zona de réplica e iniciar a síntese da fita líder na bifurcação de replicação. O passo final do procedimento é isolar o DNA dos grânulos magnéticos e purificar o DNA em uma coluna de limpeza de PCR. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que a réplica estaciona após colidir com o complexo de transcrição em orientação oposta, por meio de um gel de agarose alcalino dos produtos de DNA marcados com radionuclídeos purificados.Olá, sou Richard Pomerance do Laboratório de Mike O'Donnell na Universidade Rockefeller. Hoje vou mostrar o seu procedimento para realizar uma colisão do ribossomo com uma polimerase do RNA em fase sólida. Utilizo este procedimento em nosso laboratório para estudar como o processo de replicação é afetado por complexos de transcrição ao longo do DNA.Então vamos começar. Para iniciar este protocolo, misture a enzima RNAP holo com um molde de DNA de 3,6 KB biotinilado contendo o promotor T sete A um em 100 microlitros do tampão A e incube a mistura por 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação de 10 minutos, adicione ribonucleotídeos: adenosina trifosfato, citidina fosfato e uridina adenólica, o que limitará a síntese de RNA a 20 nucleotídeos.Incube a solução por mais 10 minutos a 37 graus Celsius para imobilizar o complexo de alongamento de RN ape interrompido nas esferas. Adicione a solução a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Deixe a mistura incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.Purifique o complexo de alongamento de RNAP imobilizado e interrompido lavando as microesferas com 0,9 mililitros de tampão de alta salinidade. Para remover complexos não específicos R-N-A-P-D-N-A após cada lavagem, remova o sobrenadante por separação magnética. Esta lavagem deve ser repetida cinco vezes.Em seguida, as esferas devem ser lavadas mais duas vezes com 0,9 mililitros do tampão A. Após a lavagem final, a bifurcação de replicação a jusante pode ser montada para formar uma bifurcação de replicação a jusante do RNAP em confronto; suspenda a fita magnética com as esferas evidentes ligadas ao complexo de alongamento do RNAP paralisado em 100 microlitros do tampão quatro da New England Biolabs. A seguir, adicione 10 unidades de fosfatase alcalina de camarão ou SAP um e incube a amostra por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as esferas três vezes com 0,9 mililitros do tampão A. Em seguida, re-suspenda as esferas em 50 microlitros do tampão de reação de ligação rápida T quatro.Adicione dois microlitros de ligase rápida T4 e DNA bifurcado pré-formado, e incube a solução por 10 minutos à temperatura ambiente. Por fim, lave as microesferas mais três vezes com 0,9 mililitros do tampão A, misturando o hexâmero, a helicase DNAB com as microesferas magnéticas de estreptavidina ligadas ao complexo de alongamento da RNAP paralisado e à bifurcação da replicação a jusante. Prepare a solução em 150 microlitros de tampão A e incube por 30 segundos a 23 graus Celsius.Após a breve incubação de 32º a 23 graus Celsius. Na polimerase três beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcado com DGTP e alfa P 32 marcado com DATP até um volume de 200 microlitros. Incube a amostra por cinco minutos a 37 graus Celsius.Inicie a replicação adicionando a proteína de ligação ao DNA de fita simples, DCTP e DTTP. Adicione também DTTP e DCTP marcados com alfa P 32 até um volume final de 250 microlitros. Após 10 minutos, encerre as reações adicionando 12 microlitros de EDTA 0,5 molar.Em seguida, aqueça em banho-maria as microesferas com strp din para liberar o DNA das microesferas. Remova qualquer DNA residual tratando as microesferas com proteinase K por 30 minutos a 50 graus Celsius. Ferva as microesferas novamente e remova o sobrenadante por separação magnética.Purifique o sobrenatante combinado contendo o DNA utilizando o kit de purificação Kyogen PCR. Por fim, analise os produtos de DNA marcados com radionuclídeo purificados em um gel alcalino aros. A colisão da zona com uma RNAP de frente geralmente resulta em dois produtos com comprimentos de 2,5 KB e 3,6 KB. O produto de 2,5 KB representa o comprimento do DNA da bifurcação até a RNAP paralisada.Isso resulta da estagnação da réplica ao colidir com a RNAP. O produto de 3,6 kb representa o DNA de comprimento completo e resulta da ocupação incompleta do promotor pela RNAP ou da leitura parcial da réplica através da RNAP em sentido oposto. Um bom resultado demonstra que aproximadamente 50% do DNA de comprimento completo é produzido.No entanto, em alguns casos, ocorre uma menor ocupação do promotor pela RNAP e observa-se uma porcentagem maior de DNA de comprimento completo. Isso acontece porque uma população maior de zonas de replicação não encontra uma RNAP em sentido contrário; na ausência de uma RNAP paralisada, resulta apenas em DNA de comprimento completo. Acabamos de mostrar como realizar a replicação e a fase sólida na presença de um complexo de alongamento da RNA polimerase paralisado ligado ao DNA. Ao realizar este procedimento, é importante lavar o complexo de transcrição paralisado com sal em alta concentração para remover a RNA polimerase em excesso, que se liga não especificamente ao DNA e inibe a replicação.Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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