Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On

O objetivo geral deste procedimento é observar o destino da zona Repli e da RNA polimerase ou RNAP após uma colisão frontal. Isso é feito primeiro montando o complexo de transcrição no DNA biotinilado e imobilizando-o no comprimido e nas esferas de Stripp, o que resultará no complexo de alongamento RNAP interrompido. A segunda etapa do procedimento é ligar o DNA bifurcado pré-necessidade ao complexo de alongamento RNAP para formar uma bifurcação de replicação a jusante do RNAP frontal.

A terceira etapa do procedimento é montar a zona repli e iniciar a síntese da fita principal no garfo de replicação. A etapa final do procedimento é isolar o DNA das esferas magnéticas e purificar o DNA em uma coluna de limpeza de PCR. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que o roso pára após a colisão com o complexo de transcrição frontal através de um agrogel alcalino dos produtos de DNA purificados marcados com rádio.

Olá, sou Richard Pomerance, do Laboratório de Mike O'Donnell na Universidade Rockefeller. Hoje vou mostrar seu procedimento de como realizar uma colisão do ribossomo com uma cabeça na RNA polimerase em fase sólida. Eu uso esse procedimento em nosso laboratório para estudar como o processo de replicação é afetado por complexos de transcrição ao longo do DNA.

Então vamos começar. Para iniciar esta mistura de protocolo, a enzima holo RNAP com um molde de DNA biotinilado de 3,6 KB contendo o promotor T seven A one em 100 microlitros de tampão a incuba a mistura por 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação de 10 minutos, adicione ribonucleotídeos adenosina, trifosfato, fosfato de citidina e alelo uridina de Aden, o que limitará a síntese de RNA a 20 nucleotídeos.

Incube a solução por mais 10 minutos a 37 graus Celsius para imobilizar o complexo de alongamento do macaco RN interrompido nas contas. Adicione a solução a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Deixe a mistura incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.

Purifique o complexo de alongamento RNAP interrompido imobilizado lavando os grânulos com 0,9 mililitros de tampão com alto teor de sal. Para remover complexos R-N-A-P-D-N-A não específicos após cada lavagem, remover o sobrenadante por separação magnética. Esta lavagem deve ser repetida cinco vezes.

Em seguida, os grânulos devem ser lavados mais duas vezes com 0,9 mililitros de tampão A. Após a lavagem final, o garfo de replicação a jusante pode ser montado para formar um garfo de replicação a jusante do RNAP Resus frontal, suspenda a tira magnética em grânulos evidentes presos ao complexo de alongamento RNAP interrompido em 100 microlitros de tampão quatro da New England Biolabs. Em seguida, adicione 10 unidades de fosfatase alcalina de camarão ou SAP uma e incube a amostra por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave os grânulos três vezes com 0,9 mililitros de tampão A.Em seguida, ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de tampão de reação de ligação rápida T quatro.

Adicione dois microlitros de T quatro ligase rápida e pré-precisa de DNA bifurcado, incube a solução por 10 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, lave os grânulos mais três vezes com 0,9 mililitros de hexâmero de mistura de tampão A, DNAB helicase com o estreptococo magnético A e grânulos que estão presos ao complexo de alongamento RNAP interrompido e ao garfo de replicação a jusante. Prepare a solução em 150 microlitros de tampão A e incube-a por 30 segundos a 23 graus Celsius.

Após a breve 32ª incubação a 23 graus Celsius. Na polimerase três clamp beta, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcou DGTP e alfa P 32 marcou DATP para um volume de 200 microlitros. Incubar a amostra durante cinco minutos a 37 graus Celsius.

Inicie a replicação adicionando proteína de ligação ao DNA de fita simples DCTP e DTTP. Adicione também alfa P 32, rotulado DTTP e DCTP a um volume final de 250 microlitros. Após 10 minutos, termine as reações adicionando 12 microlitros de EDTA 0,5 molar.

Em seguida, ferva as contas strp din para liberar o DNA das contas. Remova qualquer DNA residual tratando as esferas com proteinase K por 30 minutos a 50 graus Celsius. Ferva novamente as contas e remova o sobrenadante por separação magnética.

Purifique o sobrenadante combinado contendo o DNA usando o kit de limpeza de PCR da Kyogen. Finalmente, analise os produtos de DNA de marcador de rádio purificados em um gel aros alcalino A colisão da zona com uma cabeça no RNAP geralmente resulta em dois produtos de 2,5 KB e 3,6 KB de comprimento. O produto de 2,5 KB representa o comprimento do DNA do fork até o RNAP interrompido.

Isso resulta da parada de resposta após colisão com o RNAP. O produto de 3,6 KB representa o DNA de comprimento total e resulta da ocupação incompleta do promotor pelo RNAP ou da leitura parcial do RNAP frontal. Um bom resultado demonstra que aproximadamente 50% do DNA de comprimento total é produzido.

No entanto, em alguns casos, ocorre menor ocupação do promotor pelo RNAP e uma maior porcentagem de DNA de comprimento total é observada. Isso ocorre porque uma população maior de zonas repli não encontra uma cabeça na replicação de RNAP na ausência de um RNAP interrompido resulta apenas em DNA de comprimento total, acabamos de mostrar como realizar a replicação e a fase sólida na presença de um complexo de alongamento de RNA polimerase interrompido ligado ao DNA. Ao fazer este procedimento, é importante lavar o complexo de transcrição interrompido com alto teor de sal para remover o excesso de RNA polimerase, que se liga de forma não específica ao DNA e inibe a replicação.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.