Induzir um bloqueio de replicação de site específico no

O objetivo geral deste experimento é interromper uma forquilha de replicação em um bloqueio nucleoproteico e observar as estruturas de DNA no local do bloqueio, com o propósito de estudar as vias de reparo do DNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a replicação e o reparo do DNA, como, por exemplo, como o DNA é processado quando o aparato de replicação da célula encontra um obstáculo proteico. A principal vantagem desta técnica é que podemos interromper reversivelmente uma forquilha de replicação em uma localização específica no cromossomo ao longo de uma população inteira de células vivas.

Os seguintes membros do meu laboratório demonstrarão este procedimento: Dra. Karla Mettrick, a aluna de pós-graduação Georgia Weaver e Tayla-Ann Corocher. Uma linhagem de E.coli que carrega um arranjo de operador de tetraciclina no plasmídeo pKM1 é utilizada para este procedimento. O pKM1 codifica para TetR-YFP, uma proteína repressora de tetraciclina marcada com proteína fluorescente amarela induzível.

Dilua uma cultura fresca de crescimento prolongado dessa linhagem de E.coli até uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,01 em um meio complexo diluído com antibióticos conforme necessário para seleção. Incube a cultura a 30 graus Celsius com agitação até atingir uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,05 a 0,1. Retire uma amostra de 10 mililitros para servir como controle não induzido.

Adicione 0,01% de arabinose ao cultivo restante para induzir a produção de TetR-YFP a partir do pKM1. Continue a cultivar ambos os cultivos, não induzido e induzido, a 30 graus Celsius com agitação. Após uma hora, verifique a presença de um único ponto focal dentro de cada célula do cultivo induzido utilizando microscopia de fluorescência.

Se as células induzidas forem confirmadas como bloqueadas, indicado por mais de 70% das células apresentando um único foco, registre a densidade óptica e remova 7,5 mililitros da amostra para análise por eletroforese em gel bidimensional. Remova uma amostra equivalente da cultura controle não induzida. Antes da microscopia de fluorescência, prepare os suportes de agarose para evitar o movimento das células durante a visualização.

Para cada lâmina de agarose, pipete 500 microlitros de agarose fundida sobre uma lâmina de microscópio e cubra imediatamente com uma lamínula antes que a agarose solidifique. Armazene as lâminas entre tecidos úmidos a quatro graus Celsius até o momento do uso. Quando for verificar as células, remova a lamínula da lâmina de agarose e pipete 10 microlitros de cultura bacteriana no centro da lâmina.

Após aproximadamente cinco minutos, quando a lâmina de agarose tiver secado, recoloque a lamínula. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula e posicione a lâmina sob a óptica. Visualize as células utilizando microscopia de contraste de fase com aumento de 100x.

Na caixa de diálogo Adquirir do software de imagem, defina o Tempo de Exposição para 100 milissegundos. Selecione Adquirir para capturar a imagem. Não mova a platina.

Na caixa de diálogo Adquirido, selecione YFP como a iluminação para o obturador externo vinculado à câmera. Defina o Tempo de Exposição para 1.000 milissegundos. Desligue a luz da platina e selecione Adquirir para capturar a imagem de fluorescência.

Para iniciar este procedimento, adicione azida de sódio às amostras de cultura previamente coletadas até uma concentração final de 0,1% e incube em gelo por pelo menos cinco minutos. Centrifugue as células a 5.000 vezes g durante dez minutos. Descarte o sobrenadante.

Resuspenda cada pellet celular em 200 microlitros de tampão PIV e transfira as células para um tubo microcentrífuga. Microcentrifugue para obter o pellet celular e descarte o sobrenadante. Trate uma lâmina de microscópio com 40 microlitros de uma solução apropriada repelente à água ou de silicone.

Esfregue a lâmina com um lenço até que esteja seca. Re-suspenda as células com a menor densidade celular em 50 microlitros de PIV e coloque a 50 graus Celsius em um bloco térmico. Para todas as outras amostras, ajuste os volumes de PIV de modo que a densidade celular final seja a mesma em cada tubo.

Adicione um volume igual de solução de Agarose 0,8% recém-preparada em PIV às amostras. Mantenha as amostras no bloco de aquecimento para garantir que permaneçam acima de 50 graus Celsius e evitar a solidificação. Coloque gotas de 20 microlitros da suspensão de células em agarose sobre a lâmina tratada para produzir tampões com formato hemisférico.

Quando as tampas tiverem solidificado, deslize cuidadosamente todas as tampas de uma mesma amostra para um único tubo de microcentrífuga e adicione um mililitro de tampão de lise celular. Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, remova o tampão de lise celular e adicione 1 mililitro de solução de EDTA-Sarkosyl-Proteinase K ou solução ESP.

Incubar a 50 graus Celsius durante a noite ou até que os plugs fiquem transparentes. Quando os plugs estiverem transparentes, remover o tampão ESP e transferir os plugs para um tubo de 15 mililitros. Adicionar 12 mililitros de tampão TE e deixar em repouso por 30 minutos.

Lave as géis um total de cinco vezes com tampão TE. Armazene as géis a quatro graus Celsius em um mililitro de tampão TE. Para analisar os intermediários de replicação, o DNA nas géis de agarose é digerido com uma enzima de restrição apropriada para a região de interesse.

Neste exemplo, a EcoRV corta o DNA imediatamente antes do arranjo, dentro do arranjo e após o arranjo, gerando fragmentos de 5,5 kb e 6,7 kb na região de interesse. Para iniciar este procedimento, transfira uma fatia de agarose para um tubo de microcentrífuga novo e adicione 150 microlitros de tampão para enzima de restrição. Adicione 25 a 100 unidades de enzima de restrição e realize a digestão a 37 graus celsius por seis a oito horas.

Prepare um gel de agarose a 0,4% a quatro graus Celsius. Despeje 300 mililitros de agarose fundida em uma bandeja de gel de aproximadamente 25 por 25 centímetros. Insira um pente para fazer os poços com largura aproximadamente igual ao diâmetro da rolha.

Quando o gelado estiver solidificado, remova o pente e transfira o gel para a temperatura ambiente. Usando um alça de inoculação, deslize uma das tampas de agarose digerida para dentro de um poço, posicionando o lado plano da tampa contra a lateral do poço por onde o DNA entrará no gel. Insira uma única tampa da mesma maneira em cada segundo poço.

Pipete o agarose fundido a 0,4% nos poços para selar os plugs em posição. Carregue uma escada de DNA de um kb em um poço vazio, deixando um espaço entre a escada e as amostras. Execute o gel durante a noite em TBE 1x à temperatura ambiente.

No dia seguinte, corar o gel em banho de água contendo 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio durante 20 minutos. Visualizar o DNA com um transiluminador de UV de onda longa e recortar cada fragmento de faixa com um corte reto e uniforme, minimizando a inclusão de excesso de agarose em ambos os lados da faixa. Colocar a faixa de gel recortada em uma bandeja de gel a 90 graus em relação à direção da migração do DNA.

O próximo passo é preparar 300 mililitros de agarose para o gel da segunda dimensão. Quando a agarose atingir 50 graus Celsius, pipete a agarose fundida ao redor dos fragmentos do gel para solidificar sua posição. Despeje a agarose restante na bandeja até uma profundidade que esteja pelo menos no mesmo nível dos fragmentos do gel.

Uma vez que o gel tenha solidificado, realize a eletroforese em TBE 1x contendo 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio a quatro graus Celsius até que o DNA tenha migrado aproximadamente 10 centímetros. Recorte os blocos onde está presente o DNA genômico, incluindo o gel acima dele, para abranger o DNA que não é visível. O DNA dentro do gel é posteriormente visualizado por hibridização Southern conforme descrito no protocolo textual.

Neste sistema, um bloqueio de replicação foi confirmado pela maioria das células contendo um foco correspondente a uma cópia do arranjo dentro da célula. A adição de anidrotetraciclina reverteu o bloqueio e a subsequente duplicação do arranjo foi visualizada como o acúmulo de células com múltiplos focos. Células com replicação bloqueada também apresentaram inibição do crescimento, que foi revertida por crescimento subsequente na presença de anidrotetraciclina.

Para analisar os intermediários de replicação, o DNA foi eletroforado na primeira dimensão. O DNA de interesse foi então recortado e uma eletroforese em segunda dimensão resultou em uma diagonal de DNA linear. A hibridização Southern do DNA do arranjo revelou duas manchas na amostra não bloqueada, correspondentes aos fragmentos esperados de 5,5 kb e 6,7 kb do arranjo.

A amostra bloqueada mostrou uma diminuição na mancha de 5,5 kb e o aparecimento de um sinal elíptico, indicando uma acumulação de DNA em formato Y. A adição de anidrotetraciclina eliminou o sinal de DNA em formato Y. Outro intermediário comum é a junção de Holliday, visualizada como um sinal cônico no topo do arco-Y e um pico proveniente do DNA linear na extremidade do arco-Y.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito dias se for executada corretamente. Embora seja um procedimento bidimensional, é importante lembrar que a qualidade dos plugs de DNA é fundamental para a visualização ideal das estruturas de DNA.