Induzir um bloqueio de replicação de site específico no E. coli Usando um sistema fluorescente repressor de operador

O objetivo geral deste experimento é parar um garfo de replicação em um bloco de nucleoproteína e observar as estruturas de DNA no local do bloco com o objetivo de estudar as vias de reparo do DNA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre replicação e reparo do DNA, como a forma como o DNA é processado quando o aparato de replicação da célula encontra um bloqueio de proteína. A principal vantagem dessa técnica é que podemos reverter uma bifurcação de replicação em um local específico do cromossomo em toda uma população de células vivas.

Demonstrando este procedimento estarão os seguintes membros do meu laboratório, Dra. Karla Mettrick, e a estudante de pós-graduação, Georgia Weaver e Tayla-Ann Corocher. Uma cepa de E.coli carregando uma matriz de operadores de tetraciclina no plasmídeo pKM1 é usada para este procedimento. pKM1 codifica para TetR-YFP, uma proteína repressora de tetraciclina marcada com proteína fluorescente amarela induzível.

Diluir uma cultura fresca durante a noite desta estirpe de E.coli até uma densidade óptica de 600 nanómetros de 0,01 num meio complexo diluído com antibióticos conforme necessário para a selecção. Cultive a cultura a 30 graus Celsius com agitação até uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,05 a 0,1. Remover uma amostra de 10 mililitros para servir de controlo não induzido.

Adicione 0,01% de arabinose à cultura restante para induzir a produção de TetR-YFP a partir de pKM1. Continue a cultivar as culturas não induzidas e induzidas a 30 graus Celsius com agitação. Após uma hora, verifique a presença de um único ponto focal dentro de cada célula da cultura induzida usando microscopia de fluorescência.

Se as células induzidas forem confirmadas bloqueadas, indicadas por mais de 70% das células com um único foco, registre a densidade óptica e remova 7,5 mililitros da amostra para análise por eletroforese em gel bidimensional. Remover uma amostra equivalente da cultura de controlo não induzida. Antes da microscopia de fluorescência, prepare as almofadas de agarose para evitar o movimento das células durante a visualização.

Para cada almofada de agarose, pipete 500 microlitros de agarose derretida em uma lâmina de microscópio e sobreponha a lamínula imediatamente antes que a agarose se solidifique. Armazene as lâminas entre lenços úmidos a quatro graus Celsius até que sejam necessárias. Quando chegar a hora de verificar as células, remova a lamínula da almofada de agarose e pipete 10 microlitros de cultura bacteriana no centro da almofada.

Após aproximadamente cinco minutos, quando a almofada de agarose estiver seca, recoloque a lamínula. Coloque uma gota de óleo de imersão na lamínula e coloque a lâmina sob a ótica. Visualize as células usando microscopia de fase com ampliação de 100x.

Na caixa de diálogo Adquirir no software de imagem, defina Tempo de exposição como 100 milissegundos. Selecione Adquirir para capturar a imagem. Não mova o palco.

Na caixa de diálogo Adquirido, selecione YFP como a iluminação para o obturador externo ligado à câmara. Defina o Tempo de exposição para 1.000 milissegundos. Desligue a luz do palco e selecione Adquirir para capturar a imagem de fluorescência.

Para iniciar este procedimento, adicione azida de sódio a amostras de cultura previamente coletadas até uma concentração final de 0,1% e incube no gelo por pelo menos cinco minutos. Centrifugar as células a 5 000 vezes g durante dez minutos. Descarte o sobrenadante.

Ressuspenda cada pellet celular em 200 microlitros de tampão PIV e transfira as células para um tubo de microcentrífuga. Microcentrífuga para pellet as células e descartar o sobrenadante. Trate uma lâmina de microscópio com 40 microlitros de um repelente de água de vidro apropriado ou solução de silicone.

Esfregue a lâmina com um lenço de papel até que esteja seca. Ressuspenda as células com a menor densidade celular em 50 microlitros de PIV e coloque a 50 graus Celsius em um bloco de calor. Para todas as outras amostras, ajuste os volumes de PIV para que a densidade celular final seja a mesma em cada tubo.

Adicione um volume igual de solução de agarose a 0,8% recém-preparada em PIV às amostras. Mantenha as amostras no bloco de calor para garantir que estejam acima de 50 graus Celsius para evitar a solidificação. Coloque gotas de 20 microlitros da suspensão de agarose celular na lâmina tratada para produzir plugues hemisféricos.

Quando os plugues estiverem solidificados, deslize suavemente todos os plugues de uma amostra em um único tubo de microcentrífuga e adicione um mililitro de tampão de lise celular. Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, remova o tampão de lise celular e adicione 1 mililitro de solução de EDTA-Sarkosil-Proteinase K ou ESP.

Incube a 50 graus Celsius durante a noite ou até que os plugues estejam transparentes. Quando os plugues estiverem transparentes, remova o buffer ESP e transfira os plugues para um tubo de 15 mililitros. Adicione 12 mililitros de tampão TE e deixe descansar por 30 minutos.

Lave os plugues um total de cinco vezes com tampão TE. Armazene os plugues a quatro graus Celsius em um mililitro de tampão TE. Para analisar os intermediários de replicação, o DNA nos tampões de agarose é digerido com uma enzima de restrição apropriada para a região de interesse.

Neste exemplo, o EcoRV corta o DNA imediatamente antes da matriz, dentro da matriz e após a matriz, para fornecer fragmentos de 5,5 kb e 6,7 kb na região de interesse. Para iniciar este procedimento, transfira um tampão de agarose para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 150 microlitros de tampão de enzima de restrição. Adicione 25 a 100 unidades de enzima de restrição e digere a 37 graus Celsius por seis a oito horas.

Prepare um gel de agarose 0,4% a quatro graus Celsius. Despeje 300 mililitros de agarose derretida em uma bandeja de gel de aproximadamente 25 por 25 centímetros. Insira um pente para fazer os poços aproximadamente com a mesma largura que o diâmetro do plugue.

Quando o gel estiver firme, remova o pente e mova o gel para a temperatura ambiente. Usando um loop de inoculação, deslize um dos plugues de agarose digeridos em um poço, posicionando o lado plano do plugue contra o lado do poço onde o DNA entrará no gel. Insira um único plugue da mesma maneira em cada segundo poço.

Pipeta 0,4% de agarose derretida nos poços para selar os plugues na posição. Carregue uma escada de DNA de um kb em um poço vazio, deixando um espaço entre a escada e as amostras. Execute o gel durante a noite em 1xTBE em temperatura ambiente.

No dia seguinte, corar o gel em banho-maria contendo 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio por 20 minutos. Visualize o DNA com um transiluminador UV de onda longa e corte cada fragmento de pista com um corte reto e uniforme, minimizando a inclusão de excesso de agarose em ambos os lados da pista. Coloque a pista de gel excisada em uma bandeja de gel a 90 graus na direção da migração do DNA.

O próximo passo é preparar 300 mililitros de agarose para o gel de segunda dimensão. Quando a agarose for resfriada a 50 graus Celsius, pipete a agarose derretida ao redor das fatias de gel para solidificar sua posição. Despeje a agarose restante na bandeja até uma profundidade que esteja pelo menos nivelada com as fatias de gel.

Uma vez que o gel esteja solidificado, eletroforese-o em 1xTBE contendo 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio a quatro graus Celsius até que o DNA tenha migrado aproximadamente 10 centímetros. Extirpar os blocos onde o DNA genômico está presente, incluindo o gel acima dele, para incluir o DNA que não é visível. O DNA dentro do gel é posteriormente visualizado por hibridização do Sul, conforme descrito no protocolo de texto.

Neste sistema, um bloco de replicação foi confirmado pela maioria das células contendo um foco correspondente a uma cópia da matriz dentro da célula. A adição de anidrotetraciclina reverteu o bloqueio e a subsequente duplicação da matriz foi visualizada como o acúmulo de células com múltiplos focos. As células com replicação bloqueada também mostraram inibição do crescimento que foi revertida pelo crescimento subsequente na presença de anidrotetraciclina.

Para analisar os intermediários de replicação, o DNA foi eletroforesado na primeira dimensão. O DNA de interesse foi então excisado e uma eletroforese de segunda dimensão resultou em uma diagonal de DNA linear. A hibridização sul do DNA da matriz revelou dois pontos na amostra desbloqueada correspondentes aos fragmentos esperados de 5,5 kb e 6,7 kb da matriz.

A amostra bloqueada mostrou uma diminuição no ponto de 5,5 kb e a adição de um sinal elíptico indicando um acúmulo de DNA em forma de Y. A adição de anidrotetraciclina eliminou o sinal de DNA em forma de Y. Outro intermediário comum é a junção de Holliday visualizada como um sinal de cone no topo do arco Y e um pico do DNA linear no final do arco Y.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em oito dias se for executada corretamente. Embora seja um procedimento 2D, é importante lembrar que a qualidade dos plugues de DNA é crítica para a visualização ideal das estruturas do DNA.