Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a replicação do DNA no nível da única molécula. Comece incorporando análogos de nucleotídeos halogenados ao DNA recém-sintetizado. Em células vivas, localize as células com DNA marcado em um microscópio.

Deslize então as células e estique o DNA sobre a lâmina de microscopia. A posterior coloração imunológica de fibras de DNA e a análise de imagens de microscopia fluorescente podem elucidar a dinâmica global das forquilhas de replicação, permitindo a análise quantitativa de parâmetros que influenciam o programa geral de replicação. Ao longo dos últimos anos, diferentes versões da técnica de fibra de DNA Fluor foram desenvolvidas para visualizar o movimento de forquilhas de replicação individuais em células vivas.

Este experimento in vivo em células DT 40 que você está prestes a observar pode ser realizado em um dia e requer apenas equipamentos laboratoriais gerais e um microscópio fluorescente. O procedimento será demonstrado pela Dra. Rebecca Schwab, pós-doutoranda do meu laboratório. Para marcar as células DT 40 in vivo, comece com um cultivo em crescimento exponencial. Adicione o marcador IDU a uma concentração final de 25 micromolar e misture a suspensão celular.

Incube bem as células por 20 minutos a 38 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, adicione o marcador CLDU a uma concentração final de 250 micromolar. Misture e incube a suspensão celular.

Agora lave as células DT 40 com PBS gelado reutilizável. Suspenda os pellets celulares em PBS frio e mantenha as células marcadas em gelo. Coloque dois microlitros da suspensão celular em uma extremidade da lâmina de vidro e deixe secar ao ar até que o volume da gota seja grandemente reduzido, mas sem secar completamente.

Agora, adicione sete microlitros de solução de lise de fibras sobre a suspensão celular e misture suavemente as soluções agitando com a ponteira de uma pipeta; incube por dois minutos. Em seguida, incline as lâminas em 15 graus para permitir que as fibras se espalhem ao longo da lâmina. Assim que a solução de fibras atingir a parte inferior da lâmina, coloque-a na posição horizontal para secar ao ar.

Neste momento, uma linha fina opaca deve ser visível ao longo da lâmina. Marque o início das fibras esticadas com um lápis. Primeiro, mergulhe as lâminas em uma solução de metanol e ácido acético na proporção de três para um durante 10 minutos.

Lave as lâminas em água destilada, depois imerja em ácido clorídrico 2,5 molar por 80 minutos. Lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos cada. Remova o excesso de PBS com um papel toalha.

Em seguida, posicione as lâminas horizontalmente. Agora, pipete 5% de BSA em PBS sobre cada lâmina e coloque uma lamínula, incubando por 20 minutos. Deslize suavemente a lamínula ao longo da lâmina de vidro.

Remova o excesso de BSA com uma toalha de papel. Em seguida, pipete 50 microlitros da solução de anticorpo primário anti-BRDU em cada lâmina.

Cubra um lâmina com uma lamínula e incube em câmara umidificada por duas horas. Após a remoção das lamínulas, lave as lâminas três vezes em PBS durante cinco minutos. Aplique 50 microlitros da solução de anticorpo secundário, coloque as lamínulas e proteja também as lâminas da luz.

Em seguida, incubar por uma hora. Remova as lamínulas e lave as lâminas três vezes em PBS durante cinco minutos. Por fim, adicione uma gota de meio de montagem vector shield sobre cada lâmina.

Pressione suavemente uma lamínula e remova o excesso de fluido ao redor dela. Com um papel toalha, vedar as lamínulas com esmalte transparente e deixe secar ao ar. Armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius.

Coloque uma gota de óleo de imersão sobre uma lâmina próxima à marca de lápis e comece a localizar as fibras. Afaste-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras estejam claramente separadas umas das outras. Em um experimento típico, selecione imagens utilizando apenas um canal de cor para evitar viés.

Em seguida, tire aproximadamente 10 fotos de cada amostra. Desloque-se ao longo da lâmina para capturar as diferentes imagens, pois uma única área da lâmina pode não fornecer comprimentos representativos das fibras ou estruturas de replicação. Importe as imagens para um programa de análise de imagem.

Meça os comprimentos de 100 tratos de fibras e/ou conte 150 a 200 estruturas de replicação diferentes. A técnica de marcação dupla de fibras permite distinguir entre diferentes estruturas de replicação. O DNA recém-replicado pode ser visualizado como linhas de análogos de nucleotídeos marcados com anticorpos.

Aqui, uma forquilha de replicação em alongamento é representada por sinais vermelho e verde adjacentes. Novos eventos de iniciação podem ser divididos em origens que foram ativadas enquanto as células foram incubadas com o primeiro marcador e origens que foram ativadas durante a incubação com o segundo marcador. O primeiro caso consiste em sinais verdes, vermelho e verde vizinhos, e o último em uma linha verde exclusivamente.

Eventos de terminação manifestam-se como vermelho adjacente ao verde. Sinais vermelhos dispersos. As origens consistem em sinais consecutivos de origem e de terminação.

Dependendo do desenho experimental, forquilhas estacionadas ou colapsadas podem ser definidas como um sinal somente vermelho ou como uma linha vermelha seguida por um curto trecho verde. Neste experimento, as células selvagens DT 40 apresentam uma velocidade média de forquilha de 0,4 mícrons por minuto. Com 63% de forquilhas em andamento, 10% de origens, 16% de forquilhas estacionadas, 8% de terminações e 3% de fibras intercaladas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar e analisar a dinâmica da forquilha de replicação em células DT 40. Isso lhe fornecerá uma ferramenta essencial para investigar defeitos na replicação do DNA.