Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a replicação do DNA no nível de uma única molécula. Comece incorporando análogos de nucleotídeos halogenados em DNA recém-sintetizado. Nas células vivas, localize as células com DNA marcado em um microscópio.

Deslize então as células e estique o DNA na lâmina do microscópio. A imunocoloração subsequente das fibras de DNA e a análise das imagens de microscopia fluorescente podem iluminar a dinâmica do garfo de replicação global para permitir a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam o programa geral de replicação. Nos últimos anos, diferentes versões das técnicas de flúor da fibra de DNA foram desenvolvidas para visualizar o movimento do garfo de replicação individual dentro das células vivas.

Este experimento in vivo em células DT 40 que você está prestes a testemunhar pode ser realizado em um dia e requer apenas equipamento geral de laboratório e um microscópio fluorescente demonstrando o procedimento será a Dra. Rebecca Schwab, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Para marcar células DT 40 in vivo, comece com uma cultura de crescimento exponencial. Adicionar o marcador IDU a uma concentração final de 25 micromolares e misturar a suspensão celular.

Bem, incube as células por 20 minutos a 38 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, adicione o rótulo CLDU a uma concentração final de 250 micromolar. Misture e incube a suspensão celular.

Agora lave as células DT 40 com PBS reus gelado. Suspenda os pellets celulares em PBS frio e mantenha as células marcadas no gelo. Coloque dois microlitros da suspensão da célula em uma extremidade da lâmina de vidro ao ar até que o volume da gota seja bastante reduzido, mas não completamente seco.

Agora, adicione sete microlitros de solução de lise de fibra em cima da suspensão celular e misture delicadamente as soluções mexendo com uma ponta de pipeta incube por dois minutos. Em seguida, incline os slides a 15 graus para permitir que as fibras se espalhem ao longo do slide. Assim que a solução de fibra atingir o fundo da lâmina, coloque-a horizontalmente para secar ao ar.

Neste ponto, uma linha fina e opaca deve ser visível ao longo do slide. Marque o início das fibras esticadas com um lápis. Primeiro, mergulhe as lâminas em três a um metanol em ácido acético por 10 minutos.

Lave as lâminas em água destilada e mergulhe em ácido clorídrico 2,5 molar por 80 minutos. Lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos. Colete o excesso de PBS em uma toalha de papel.

Em seguida, oriente os slides horizontalmente. Agora pipete 5% BSA em PBS em cima de cada lâmina e coloque uma lamínula para incubar por 20 minutos. Mova a lamínula suavemente pela lâmina de vidro.

Remova o excesso de BSA com uma toalha de papel. Em seguida, pipete 50 microlitros da solução de anticorpo primário anti-BRDU. Em cada slide.

Cubra um jogo com uma lamínula e incube em uma câmara umidificada por duas horas. Depois de remover as lamínulas, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos. Aplique 50 microlitros das lamínulas de posição da solução de anticorpos secundários e também proteja as lâminas da luz.

Em seguida, incube por uma hora. Remova as lamínulas e lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos. Por fim, adicione uma gota de meio de montagem de blindagem vetorial em cada slide.

Pressione suavemente uma lamínula e remova o excesso de líquido ao redor dela. Com uma toalha de papel, sele as lamínulas com esmalte transparente e seque ao ar. Armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius.

Coloque uma gota de óleo de imersão em uma lâmina perto da marca do lápis e comece a localizar as fibras. Afaste-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras estão claramente separadas umas das outras. Em um experimento típico, selecione imagens usando apenas um canal de cor para evitar viés.

Em seguida, tire aproximadamente 10 fotos de cada amostra. Mova-se ao longo do slide para tirar as diferentes fotos, pois uma área de um slide pode não fornecer comprimentos de fibra representativos ou estruturas de replicação. Importe imagens para um programa de análise de imagem.

Meça os comprimentos dos 100 tratos de fibra e/ou conte de 150 a 200 estruturas de replicação diferentes. A técnica de dupla marcação da fibra permite distinguir entre diferentes estruturas de replicação. O DNA recém-replicado pode ser visualizado como linhas de análogos de nucleotídeos marcados com anticorpos.

Aqui, uma bifurcação de alongamento contínua é representada como sinais vermelhos e verdes adjacentes. Novos eventos de iniciação podem ser divididos em origens que dispararam enquanto as células foram incubadas com o primeiro rótulo e origens que dispararam durante a incubação com o segundo rótulo. O primeiro consiste em sinais verdes vizinhos, vermelhos verdes e o último em uma linha verde. Somente.

Os eventos de encerramento se manifestam como vermelho verde adjacente. Sinais vermelhos intercalados. As origens consistem em origens consecutivas e sinais de terminação.

Dependendo do projeto experimental, bifurcações paradas ou colapsadas podem ser definidas como um sinal apenas vermelho ou uma linha vermelha, seguida por um curto trecho verde. Neste experimento, as células DT 40 do tipo selvagem têm uma velocidade média de garfo de 0,4 mícrons por minuto. Com 63% de garfos contínuos, 10% de origens, 16% de garfos estagnados, 8% de terminações e 3% de fibras intercaladas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar e analisar a dinâmica do garfo de replicação em células DT 40. Isso fornecerá uma ferramenta essencial para investigar defeitos na replicação do DNA.