Name: Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a visualizar a replicação de DNA em células DT40 usando a técnica de fibra de DNA. Este método permite analisar dinâmicas de garfos de replicação em nível de molécula única.

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Agradecemos ao Dr. T. Helleday e Dr. E. Petermann para ajudar com a técnica de fibras, bem como os membros do laboratório para discussão útil. WN é apoiado por uma Bolsa de Investigação Sênior Internacional da Associação Internacional para Pesquisa do Câncer e pelo Comitê de Estado polaco de Investigação Científica de subvenção (N301 165935).

O método descrito aqui foi usado na seguinte publicação: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 cultura de células Materiais: soro fetal bovino (FBS), frango soro, penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI <ol><li> Prepare meio de cultura celular: FBS adicionar 7%, 3% de soro de frango, 1x penicilina / estreptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanol para meio RPMI. </li><li> DT40 células são cultivadas em frascos de cultura de células estéreis, a 38 ° C e 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada. Dividir células todos os dias para uma densidade de 5 x 10 5 células / ml 6. </li></ol> 2. Na rotulagem vivo Materiais: UDI, CldU <ol><li> Preparar soluções estoque de nucleótidos: dissolver UDI a 5 mM e 2,5 mM para CldU no meio. Calor ambas as soluções rapidamente para 60 ° C e vortex até que o análogo dos nucleótidosues são dissolvidos completamente. </li><li> Adicionar UDI a uma concentração final de 25 mM para crescimento exponencial DT40 células e mistura da suspensão de células também. Incubar as células durante 20 minutos a 38 ° C e 5% CO 2. </li><li> Após a incubação com a primeira etiqueta, adicione CldU para uma concentração final de 250 mM e tratar células, como descrito no passo anterior. </li><li> Lavar as células com PBS gelado e ressuspenda-los em uma concentração de 7,5 x 10 5 células / ml em PBS frio. Manter as células rotuladas no gelo. </li></ol> O procedimento de classificação e rotulagem é apenas uma sugestão e pode ser modificado para tratar de questões específicas. Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre design experimental. 3. Lise celular e DNA se espalhando Materiais: lâminas de vidro, fibra de solução de lise <ol><li> Prepare a solução de lise de fibras: 50 mM EDTA e SDS 0,5% em 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li spot l da suspens de c para uma extremidade vidro. secar por minutos ou at que o volume gota muito reduzida mas n seca.><li> Pipeta 7 mL de solução de lise no topo da suspensão de células e agitar suavemente com a ponta da pipeta para misturar as soluções. Incubar por 2 minutos para lise celular para prosseguir. </li><li> Tilt slides de 15 ° para permitir que as fibras se espalhar ao longo do slide. </li><li> Uma vez que a solução de fibra atingiu o fundo do slide, colocá-lo horizontalmente para secar ao ar. Após a secagem, uma linha fina, opaca deve ser visível ao longo do slide. Neste ponto, o início das fibras esticadas devem ser marcadas com um lápis como depois da coloração da linha não será visível por mais tempo. Esta marca irá mais tarde ajudar a localizar as fibras sob o microscópio. </li></ol> 4. Imunofluorescência Materiais: metanol, ácido acético, HCl, BSA 5% em PBS, tina de coloração, anti-BrdU anticorpos (mouse),anticorpo anti-BrdU (rato), ovinos anti-rato Cy3 de anticorpos, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpos, Vectashield meio de montagem, lamínulas, unha polonês <ol><li> Imergir as lâminas em metanol / ácido acético (3:1) em uma tina de coloração e incubar por 10 minutos. </li><li> Lavagem das lâminas em água destilada H 2 O, em seguida, mergulhar em 2,5 M HCl por 80 minutos. </li><li> Lavagem das lâminas três vezes em PBS por 5 minutos. </li><li> Retirar as lâminas da tina de coloração e recolher PBS excesso com uma toalha de papel. Colocar as lâminas na horizontal e BSA pipeta de 5% em cima de cada slide. Cobrir os slides suavemente com uma lamela para espalhar a BSA uniformemente sobre a lâmina e incubar por 20 minutos. </li><li> Diluir os anticorpos primários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:25 anti-BrdU (mouse) e 1:400 anti-BrdU (rato). </li><li> Mover a lamela suavemente a lâmina de vidro para removê-lo. Não force se a lamínula adere ao slide. O slide pode ser reidratados em PBS até a lamela fica solto umd pode ser removido com facilidade. Coletar BSA excesso com uma toalha de papel e coloque os slides na horizontal. Pipete 50 da solução de anticorpo primário em cada slide. Cubra novamente com uma lamela para espalhar a solução de anticorpos uniformemente sobre a lâmina e incubar em câmara úmida por 2 horas. </li><li> Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos </li><li> Diluir os anticorpos secundários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:500 ovelhas anti-rato Cy3 e 1:400 de cabra anti-rato Alexa Fluor 488. </li><li> Aplicar 50 ul da solução de anticorpo secundário como descrito para os anticorpos primários. Proteger os slides da luz e incubar por 1 hora. </li><li> Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos. </li><li> Adicionar uma gota de Vectashield meio de montagem em cada slide e uma lamela. Pressione suavemente as lamelas e remover o excesso de fluido em torno dele com uma toalha de papel. Lamínulas selo com unhas transparente polish e deixe-os secar. Armazenar os slides a -20 ° C. </li></ol> 5. Aquisição de imagem Materiais: microscópio de fluorescência da câmera, Coloque uma gota de óleo de imersão em uma corrediça de perto da marca de lápis e começar a localizar as fibras. Normalmente, há um feixe de fibras principais, mas essas fibras são muito preso e não pode ser analisada mais tarde. Afastar-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras são claramente separados uns dos outros (Fig. 2). Gostaríamos de selecionar fotos usando apenas um canal de cor a fim de evitar viés. Então, levaria cerca de 10 fotos de cada linha de concentração ponto, ou de células da hora. No entanto, o número de imagens depende de quantas fibras podem ser contadas em cada imagem. Se movem ao longo do slide para tirar as fotos diferentes, como uma área de um slide pode não fornecer comprimentos de fibra representante ou estruturas de replicação. 6. A análise dos dados Materiais: programa de análise de imagem, por exemplo, ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importar imagens em um programa de análise de imagem. Medir o comprimento dos feixes de fibras e / ou contar as estruturas de replicação diferentes (Fig. 3). Só contam as fibras que são claramente visíveis e que não se estendem ao longo da borda da imagem. Normalmente, medir o comprimento de cerca de 100 fibras e contagem de 150-200 estruturas de replicação e gostaríamos de repetir experiências individuais, pelo menos, três vezes. 7. Resultados representativos: DNA recém-replicada pode ser visualizado como linhas de anticorpo marcado com nucleótidos. Em nossos experimentos um garfo em curso é representado como adjacentes sinais vermelho e verde (Fig. 3). O protocolo a dupla marcação também nos permite definir quatro classes principais de estruturas de replicação: 1) eventos de iniciação novo pode ser divid ed em origens que dispararam enquanto as células foram incubadas com o rótulo de primeiro e origens que dispararam durante a incubação com o rótulo de segundo. O primeiro consiste de vizinhos verde-vermelho-verde e os últimos sinais de uma linha verde só. 2) manifestar-se como eventos de rescisão adjacentes vermelho-verde-vermelho sinais. 3) intercaladas origens são os locais no genoma com origens espaçados. Esses sites consistem de origens consecutivos e sinais de terminação. 4) dependendo do projeto experimental, parado / garfos colapso pode ser definido como um sinal vermelho apenas 7 ou uma linha vermelha seguido de um intervalo curto verde 8,9. Usando as condições aqui descritas, as células do tipo selvagem DT40 têm uma velocidade de garfo média de 0,4 mM / min. Podemos detectar aproximadamente 63% garfos em curso, a origem de 10%, 16% garfos parado (vermelho folhetos apenas), terminações 8% e 3% de fibras intercaladas. ure 1 "/&gt; . Figura 1 (A) O lado esquerdo do desenho animado retrata o primeiro passo do processo de rotulagem DNA: a adição de UDI para crescimento exponencial DT40 células leva o análogo de nucleotídeo para ser facilmente incorporados ao líder recém-sintetizado e atraso fitas de DNA. Isto pode ser visualizado utilizando um anticorpo específico, e será exibido como uma linha vermelha quando visto sob o microscópio. Posteriormente, o mesmo procedimento é repetido com CldU como mostrado no lado direito da figura. Após a incubação com o análogo de nucleotídeo segundo, um garfo de ativos será visível como um trato vermelho-verde adjacente. O comprimento médio de fibra é proporcional ao tempo de incubação da nucleótidos. (B) o DNA de células lisadas DT40 é esticada por gravidade para uma lâmina de microscópio e os análogos de nucleotídeos incorporados são visualizados através da utilização de anticorpos específicos e de microscopia de fluorescência. IGURA 2 "/&gt; Figura 2. A imagem representativa mostra de fluorescência de fibras de tipo selvagem DT40 células posteriormente rotulados com UDI e CldU por 20 minutos cada. A maioria das fibras são bem separadas umas das outras e podem, portanto, ser facilmente analisado. A barra branca representa 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 A técnica de fibra rotulagem dupla permite distinguir entre as estruturas de replicação diferentes; 1 - garfos ativamente replicar, 2 - novos locais de replicação do DNA (disparo de novas origens), 3 - terminações fork (dois garfos convergentes), 4 - fibras intercaladas (sites de origens espaçados) e 5 - garfos parado (único sinal vermelho).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um método que permite a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em um nível única molécula. Nos últimos dez anos, diferentes versões da técnica de DNA fluorography fibra foram desenvolvidos para visualizar o movimento de garfos de replicação individuais dentro de células vivas. O parâmetro crítico em todas estas técnicas é o procedimento utilizado para alcançar o melhor possível alongamento de DNA em superfícies de vidro fornecendo fibras bem separados DNA. Um passo crucial para atingir este é o tempo de incubação da suspensão de células sobre a lâmina de microscópio, bem como tempo de lise. Estes parâmetros dependem da temperatura e fluxo de ar em um laboratório particular e deve ser determinada empiricamente. A parte prática de uma experiência de fibra DNA é tipicamente realizada em um dia. No entanto, a aquisição de imagem e posterior análise é mais demorado e requer prática. O protocolo de rotulagem podem ser adApted para responder a vários problemas científicos: usando um agente que interfere com a replicação durante a rotulagem segundo pulso monitores alongamento garfo / stalling em resposta ao estresse replicativo. Neste cenário, o primeiro rótulo não precisa ser lavada como o segundo nucleotídeo é adicionado em excesso. Alternativamente, as drogas que impedem a replicação pode ser usado em combinação ou apenas após a adição da primeira etiqueta. Isto requer a primeira etiqueta e que a droga a ser removido antes do segundo nucleotídeo análogo é aplicado. Este procedimento permite determinar a importância dos fatores de reparo de DNA em vários estabilidade replicativa garfo / recuperação sob condições de estresse replicativo (garfo ou seja, estagnação e / ou colapso). Notável, uma análise mais detalhada dos elementos do programa de replicação do DNA pode ser realizada com o uso de uma combinação de abordagens alternativas DNA pentear ea hibridização fluorescente in situ. Isso, entretanto, é tecnicamente mais desafiador e requer despesassive equipamentos. A capacidade de analisar qualitativa e quantitativamente elementos da replicação do DNA fornece uma ferramenta essencial para a investigação de defeitos na replicação do DNA em si, bem como os caminhos que suprimem instabilidade genômica associada com garfos de replicação. Sem dúvida, este ensaio continuará a ajudar a lançar luz sobre os mecanismos de replicação mediada reparo de DNA que permitem que as células normais para responder / se adaptar às mudanças ambientais, bem como a forma como células de câncer de utilizar estes mecanismos para resistir à toxicidade de drogas que alvejam garfos de replicação.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Ouro de soro fetal bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Chicken soro </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-iodo-2&#39;-deoxiuridina (UDI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-cloro-2&#39;-desoxi-uridina (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio slides SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Tampa desliza No1 </td><td> Suppplies laboratório científico </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield meio de montagem </td><td> H-1000 Vector laboratório </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-BrdU (mouse) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-BrdU (rato) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> ovelhas anti-mouse Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> cabra anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpos </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de replicação de dna no dt40 vertebrados modelo de sistema utilizando a técnica de dna fibra

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Manutenção da estabilidade de forquilha de replicação é de extrema importância para dividir células para preservar a viabilidade e prevenir a doença. Os processos envolvidos não só garantir a duplicação do genoma fiéis em face de danos no DNA endógenos e exógenos, mas também evitar a instabilidade genômica, um fator causador reconhecido no desenvolvimento do tumor. Aqui, nós descrevemos um microscópio baseada simples e cost-effective de fluorescência método para visualizar a replicação do DNA na linha de células B aviária DT40. Esta linhagem celular fornece uma poderosa ferramenta para investigar a função da proteína in vivo por genética reversa em células de vertebrados 1. DNA fluorography fibra em DT40 células falta um gene específico permite elucidar a função deste produto gene na replicação do DNA e estabilidade do genoma. Métodos tradicionais para analisar a dinâmica do garfo de replicação em células de vertebrados dependem de medir a taxa global de síntese de DNA em uma população de pulso marcado com células. Esta é uma abordagem quantitativa e não permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA. Em contraste, a taxa de movimento de garfos ativo pode ser seguido diretamente ao utilizar a técnica de fibra de DNA 2-4. Nesta abordagem, o DNA nascente é rotulado in vivo por incorporação de nucleotídeos halogenados (Fig 1A). Posteriormente, as fibras individuais são esticadas sobre uma lâmina de microscópio, e os tratos replicação rotulados de DNA são marcadas com anticorpos específicos e visualizados por microscopia de fluorescência (Figura 1B). Início da replicação, bem como direcionalidade garfo é determinada pelo uso consecutivo de dois análogos de forma diferente modificada. Além disso, a abordagem rotulagem dupla permite a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S, as estruturas de replicação ou seja, como garfos em andamento e paralisadas, a densidade de origem de replicação, bem como rescisões garfo. Finalmente, o procedimento experimental pode ser realizared em um dia, e requer apenas equipamentos de laboratório geral e um microscópio de fluorescência.

DT40, um sistema de vertebrados modelo genético, fornece uma ferramenta poderosa para analisar a função da proteína. Aqui nós descrevemos um método simples que permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em células DT40 no nível única molécula.

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

A manutenção da estabilidade da forquilha de replicação é de suma importância para que as células em divisão preservem a viabilidade e previnam doenças. Os processos envolvidos não...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a replicação do DNA no nível da única molécula. Comece incorporando análogos de nucleotídeos halogenados ao DNA recém-sintetizado. Em células vivas, localize as células com DNA marcado em um microscópio.Deslize então as células e estique o DNA sobre a lâmina de microscopia. A posterior coloração imunológica de fibras de DNA e a análise de imagens de microscopia fluorescente podem elucidar a dinâmica global das forquilhas de replicação, permitindo a análise quantitativa de parâmetros que influenciam o programa geral de replicação. Ao longo dos últimos anos, diferentes versões da técnica de fibra de DNA Fluor foram desenvolvidas para visualizar o movimento de forquilhas de replicação individuais em células vivas.Este experimento in vivo em células DT 40 que você está prestes a observar pode ser realizado em um dia e requer apenas equipamentos laboratoriais gerais e um microscópio fluorescente. O procedimento será demonstrado pela Dra. Rebecca Schwab, pós-doutoranda do meu laboratório. Para marcar as células DT 40 in vivo, comece com um cultivo em crescimento exponencial. Adicione o marcador IDU a uma concentração final de 25 micromolar e misture a suspensão celular.Incube bem as células por 20 minutos a 38 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, adicione o marcador CLDU a uma concentração final de 250 micromolar. Misture e incube a suspensão celular.Agora lave as células DT 40 com PBS gelado reutilizável. Suspenda os pellets celulares em PBS frio e mantenha as células marcadas em gelo. Coloque dois microlitros da suspensão celular em uma extremidade da lâmina de vidro e deixe secar ao ar até que o volume da gota seja grandemente reduzido, mas sem secar completamente.Agora, adicione sete microlitros de solução de lise de fibras sobre a suspensão celular e misture suavemente as soluções agitando com a ponteira de uma pipeta; incube por dois minutos. Em seguida, incline as lâminas em 15 graus para permitir que as fibras se espalhem ao longo da lâmina. Assim que a solução de fibras atingir a parte inferior da lâmina, coloque-a na posição horizontal para secar ao ar.Neste momento, uma linha fina opaca deve ser visível ao longo da lâmina. Marque o início das fibras esticadas com um lápis. Primeiro, mergulhe as lâminas em uma solução de metanol e ácido acético na proporção de três para um durante 10 minutos.Lave as lâminas em água destilada, depois imerja em ácido clorídrico 2,5 molar por 80 minutos. Lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos cada. Remova o excesso de PBS com um papel toalha.Em seguida, posicione as lâminas horizontalmente. Agora, pipete 5% de BSA em PBS sobre cada lâmina e coloque uma lamínula, incubando por 20 minutos. Deslize suavemente a lamínula ao longo da lâmina de vidro.Remova o excesso de BSA com uma toalha de papel. Em seguida, pipete 50 microlitros da solução de anticorpo primário anti-BRDU em cada lâmina.Cubra um lâmina com uma lamínula e incube em câmara umidificada por duas horas. Após a remoção das lamínulas, lave as lâminas três vezes em PBS durante cinco minutos. Aplique 50 microlitros da solução de anticorpo secundário, coloque as lamínulas e proteja também as lâminas da luz.Em seguida, incubar por uma hora. Remova as lamínulas e lave as lâminas três vezes em PBS durante cinco minutos. Por fim, adicione uma gota de meio de montagem vector shield sobre cada lâmina.Pressione suavemente uma lamínula e remova o excesso de fluido ao redor dela. Com um papel toalha, vedar as lamínulas com esmalte transparente e deixe secar ao ar. Armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius.Coloque uma gota de óleo de imersão sobre uma lâmina próxima à marca de lápis e comece a localizar as fibras. Afaste-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras estejam claramente separadas umas das outras. Em um experimento típico, selecione imagens utilizando apenas um canal de cor para evitar viés.Em seguida, tire aproximadamente 10 fotos de cada amostra. Desloque-se ao longo da lâmina para capturar as diferentes imagens, pois uma única área da lâmina pode não fornecer comprimentos representativos das fibras ou estruturas de replicação. Importe as imagens para um programa de análise de imagem.Meça os comprimentos de 100 tratos de fibras e/ou conte 150 a 200 estruturas de replicação diferentes. A técnica de marcação dupla de fibras permite distinguir entre diferentes estruturas de replicação. O DNA recém-replicado pode ser visualizado como linhas de análogos de nucleotídeos marcados com anticorpos.Aqui, uma forquilha de replicação em alongamento é representada por sinais vermelho e verde adjacentes. Novos eventos de iniciação podem ser divididos em origens que foram ativadas enquanto as células foram incubadas com o primeiro marcador e origens que foram ativadas durante a incubação com o segundo marcador. O primeiro caso consiste em sinais verdes, vermelho e verde vizinhos, e o último em uma linha verde exclusivamente.Eventos de terminação manifestam-se como vermelho adjacente ao verde. Sinais vermelhos dispersos. As origens consistem em sinais consecutivos de origem e de terminação.Dependendo do desenho experimental, forquilhas estacionadas ou colapsadas podem ser definidas como um sinal somente vermelho ou como uma linha vermelha seguida por um curto trecho verde. Neste experimento, as células selvagens DT 40 apresentam uma velocidade média de forquilha de 0,4 mícrons por minuto. Com 63% de forquilhas em andamento, 10% de origens, 16% de forquilhas estacionadas, 8% de terminações e 3% de fibras intercaladas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar e analisar a dinâmica da forquilha de replicação em células DT 40. Isso lhe fornecerá uma ferramenta essencial para investigar defeitos na replicação do DNA.

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Biologia

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Descrevemos aqui um sistema que utiliza um bloco de proteína in vivo reversível e específico do local para parar e colapsar garfos de replicação em Escherichia coli. O estabelecimento do bloco de replicação é avaliado por microscopia de fluorescência e eletroforese em gel de agarose bidimensional neutro-neutro é usada para visualizar intermediários de replicação.

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A metodologia auxilia na análise da variação na dinâmica de replicação do DNA na presença de nanopartículas. Diferentes metodologias podem ser adotadas com base no nível de citotoxicidade do material de interesse. Além disso, uma descrição da análise de imagem é fornecida para ajudar na análise de fibras de DNA.

Demonstração do Ensaio de Fibras de DNA para Investigação de Danos ao DNA e Dinâmica de Reparo Induzidos por Nanopartículas

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Aqui, descrevemos o procedimento para analisar a progressão da replicação por meio de repetições patogênicas e propensas à estrutura usando eletroforese em gel bidimensional.

Análise eletroforética da replicação por meio de repetições de DNA propensas à estrutura dentro do epissoma humano baseado em SV40

Este protocolo descreve um ensaio de replicação de DNA de molécula única baseado em microscopia de fluorescência, permitindo a visualização em tempo real das interações entre DNA polimerases e obstáculos como estruturas G-quadruplex.

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Aprenda a visualizar a replicação de DNA em células DT40 usando a técnica de fibra de DNA. Este método permite analisar dinâmicas de garfos de replicação em nível de molécula única.

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

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