Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

O objetivo geral deste método in vitro é gerar os esferoides de cultura de células tridimensionais que permitem o teste de regimes de terapia padrão ou experimental atuais para carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. Este método nos ajuda a entender o crescimento tumoral tridimensional de células cancerígenas de cabeça e pescoço quando expostas à radiação ou tratamento de quimioterapia. Resta dizer que o manuseio de células tumorais primárias é difícil e nem sempre leva à formação confiável de esferóides tridimensionais.

Demonstrando o procedimento estará Sabina Schwenk-Zieger, técnica do nosso laboratório. Ao usar células primárias de uma amostra de tumor, coloque a amostra em uma superfície adequada e estéril e corte-a completamente com um bisturi estéril de uso único em pedaços muito pequenos. Após separação mecânica suficiente do tecido primário, transfira-o para um frasco contendo colagenase 1 e 2 e incube-o por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, peneire a mistura através de um filtro de células Falcon de 70 micrômetros e lave a suspensão com HBSS. Após a separação bem-sucedida e a lavagem subsequente, transfira a suspensão contendo um a dois milhões de células para um frasco de cultura de células T75 para crescer até a subconfluência a 37 graus Celsius por até dez dias. Sob um microscópio, confirme o crescimento das células tumorais.

Conte as células em cultura. Usando uma placa de 96 poços de adesão ultrabaixa com fundos redondos côncavos, semeie 5.000 células tumorais primárias ou 1.000 a 2.000 células de linha celular intermediária, em 200 a 300 microlitros de meio nos poços. Em seguida, cultive as células a 37 graus Celsius.

Execute alterações de mídia a cada dois dias. Preste atenção para não aspirar o esferóide com a pipeta durante as mudanças de meio. Cultive os esferóides até que os conglomerados celulares tridimensionais em forma de esferóide sejam observados.

Lembre-se de excluir os poços com formação irregular ou múltipla de esferóides de uma investigação mais aprofundada. Posteriormente, mude o meio para meio com quimioterapia e / ou anticorpos monoclonais nas concentrações desejadas. Adicione cisplatina nas concentrações de 2,5, cinco ou 10 micromolares ou 5-fluorouracil a 30 micromolares.

Neste procedimento, meça o tamanho do esferóide após a documentação fotográfica digital no sexto, dia 10 e dia 16 com um software gráfico. Após centrifugação da placa a 520g durante 2,5 minutos, retirar o sobrenadante. Em seguida, lave as células com 1x PBS e centrifugue a placa novamente, seguida pela remoção do sobrenadante.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de descolamento de células enzimáticas a cada frasco para permitir que os esferóides se dissolvam. Em seguida, incube a placa por oito minutos a 37 graus Celsius. Verifique se a dissolução bem-sucedida dos esferóides sob o microscópio.

Adicione 100 microlitros de DMEM. Em seguida, centrifugue a placa a 520g por 2,5 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e suspenda as células em 100 microlitros de DMEM.

Posteriormente, se necessário, realizar um ensaio de proliferação colorimétrica disponível comercialmente e ler o ensaio em um leitor ELISA. Todas as linhagens celulares podem gerar esferoides confiáveis com diferenças de tamanho e tempo de leitura. As células primárias formaram esferóides reprodutíveis em placas de fixação ultrabaixas.

A coloração Ki-67 revela que a periferia da cultura apresenta taxas de proliferação muito maiores do que as células centrais, mimetizando a distribuição de nutrientes em tumores sólidos da mucosa que frequentemente apresentam núcleos necróticos. Aqui, o efeito de várias quimioterapias e radiação no tamanho do esferóide. A radiação com dois cinzas antes do tratamento com cisplatina leva a uma diminuição significativa no tamanho do esferóide em comparação com a cisplatina sozinha.

Com o estabelecimento adicional da geração de esferóides a partir de células humanas primárias, é assim que o conceito de teste de terapia pode ser implementado. Os esferoides seriam gerados após a biópsia do tumor e, em seguida, testados quanto às características moleculares e suscetibilidade à terapia. Conseguimos estabelecer um protocolo para gerar esferoides reprodutíveis a partir de suspensões celulares para linhagens celulares e células tumorais humanas primárias.

Este ensaio multimodal é suficientemente sensível para identificar pequenas diferenças entre os grupos. No futuro, o ensaio pode ser usado para avaliar primeiro a resposta individual aos protocolos de terapia padrão e experimental. Em segundo lugar, caracterize ainda mais as células tumorais de espécimes frescos.

E terceiro, correlacionar a resposta da terapia aos padrões moleculares. O uso de células primárias e a geração de esferoides permitiriam a preservação do maior número possível de características do crescimento tumoral in vivo em combinação com um ensaio econômico para estudar a resposta individual à terapia.