Acasalamento e estadiamento de ovos: um método para gerar embriões e classificá-los por estágio de desenvolvimento

- Comece com um tanque de acasalamento, um tanque com uma inserção removível que permite que os ovos caiam. Adicione dois peixes adultos machos e três fêmeas a um tanque de acasalamento dividido à noite antes da coleta de embriões para se aclimatarem durante a noite.

Na manhã seguinte, transfira os peixes para um novo tanque de acasalamento contendo água do sistema e remova o divisor. Aguarde de 15 a 30 minutos para dar tempo ao peixe de acasalar e desovar.

Agora colete os embriões e armazene-os em uma placa de Petri contendo o meio embrionário de Hank. Cultive-os a 28,5 graus Celsius durante todo o protocolo. Examine a morfologia dos embriões sob um microscópio de dissecação.

Você observará várias características de desenvolvimento. A clivagem do blastodisco dá origem a várias células. O blastoderma assume a forma de um copo invertido acima da célula vitelina. Os segmentos do mesoderma paraxial se desenvolvem na parte dorsal do embrião e assim por diante.

Além de 24 horas após a fertilização, basta classificar os embriões pelo comprimento total do corpo. No protocolo de exemplo, configuraremos o acasalamento de peixes repórteres mCherry transgênicos e classificaremos os embriões resultantes.

- Para começar, cultive embriões até os três meses de idade, que é a maturidade reprodutiva. Separe dois machos adultos e três fêmeas da cepa desejada em tanques de acasalamento divididos de água doce do sistema na noite anterior à coleta de embriões. Na manhã seguinte, depois que as luzes se acenderem, remova a divisória e deixe os peixes acasalarem naturalmente até que os embriões sejam observados no fundo do tanque.

Colete embriões em intervalos de 30 minutos e separe as placas de Petri do meio embrionário até que o número desejado seja coletado. Para estadiar os embriões, cultive-os em grupos de 50 a 75 por placa de Petri de 10 centímetros para promover um tempo de desenvolvimento consistente de todos os embriões. Em seguida, mantenha as placas a 28,5 graus Celsius.

Meça a idade do embrião usando o número de somito após a segmentação até aproximadamente 24 horas após a fertilização, ou HPF, e separe os embriões com base na idade de desenvolvimento.