- Nas larvas de peixe-zebra, um estímulo visual pode ativar neurônios somatossensoriais e desencadear uma resposta de fuga. Existem dois tipos de neurônios encontrados na larva, neurônios trigêmeos e Rohon-Beard. Podemos manipular a atividade desses neurônios modificando-os para expressar canais iônicos transgênicos sensíveis à luz. Essa abordagem é chamada de optogenética.
Para realizar esta técnica, monte uma larva transgênica com o lado dorsal voltado para cima em gel de agarose e coloque-a sob um microscópio de dissecação. Use uma lâmina de barbear para destacar uma porção em forma de cunha de agarose ao redor da gema e da cauda. Encha esta área com água de ovo. Afaste a agarose do tronco e da cauda da larva.
Posicione a ponta de um cabo óptico perto do tronco onde o corpo celular do neurônio Rohon-Beard está localizado. Forneça um pulso de luz laser azul. Após a exposição à luz azul, os canais iônicos transgênicos sensíveis à luz na membrana do neurônio se abrem, permitindo a entrada de íons, desencadeando um potencial de ação que provoca a resposta de escape. Registre o comportamento da larva usando uma câmera de alta velocidade.
No protocolo de exemplo, montaremos as larvas para ativar o neurônio Rohon-Beard, expressando uma variante de channelrodopsina e observaremos a resposta comportamental.
- Faça 1,5% de agarose de baixo ponto de fusão em água bidestilada e armazene em um bloco de calor de 42 graus Celsius para evitar que solidifique. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, transfira uma das larvas pré-peneiradas para um tubo de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% com o mínimo possível de água de embrião azul. Em seguida, transfira a larva em uma gota de agarose para uma pequena placa de Petri.
Sob um microscópio de dissecação, posicione o lado dorsal da larva para cima. Quando a agarose estiver solidificada, use uma lâmina de barbear fina para cortar a agarose de ambos os lados da larva. Encha a área ao redor da agarose com água azul embrionária.
Em seguida, faça dois cortes diagonais de ambos os lados da gema, tomando cuidado para não cortar a larva. Depois, afaste o agarose do tronco e da cauda da larva.
Agora monte a câmera de alta velocidade no escopo de dissecação e conecte a câmera ao computador. Em seguida, ligue o computador e a câmera de alta velocidade. Abra o software de imagem de vídeo e ajuste as configurações da câmera. Em seguida, conecte o cabo óptico, o laser e o estimulador. Em seguida, ligue o estimulador e ajuste-o para um máximo de 5 volts e uma duração de pulso de 5 milissegundos. Em seguida, ligue o laser.
Em seguida, use o microscópio de dissecação fluorescente para posicionar a ponta do cabo óptico perto de um corpo celular de neurônio com expressão ChEF-tdTomato. Forneça um pulso de luz azul para ativar o neurônio sensorial. Em seguida, grave as respostas usando uma câmera de alta velocidade ajustada para 500 ou 1.000 quadros por segundo e repita os experimentos com pelo menos 1 minuto entre as ativações para evitar a habituação.
Para liberar a larva, separe a agarose com uma pinça e tome cuidado para não ferir o animal. Em seguida, transfira-o para água fresca de embrião azul. Os animais podem se desenvolver ainda mais e o procedimento pode ser repetido em estágios mais antigos. O embrião também pode ser remontado para imagens confocais de alta resolução da célula ativada, a fim de correlacionar o comportamento com a estrutura celular.