Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

O objetivo geral deste procedimento é obter registros in vivo da atividade neural no cérebro de peixes-zebra adultos intactos. Isso é feito primeiro obtendo um imobilizador, um peixe-zebra adulto através da aplicação de banho de sulfonato de Trica Methyls. O segundo passo é intubar o peixe-zebra imobilizado.

Em seguida, uma craniotomia é realizada sob anestesia trica para fornecer acesso ao cérebro. A etapa final é posicionar um eletrodo primário dentro da janela de craniotomia, o que permite que a atividade cerebral extracelular seja registrada. Em última análise, in vivo.

A eletrofisiologia no peixe-zebra adulto pode ser usada para mostrar como diferentes compostos farmacológicos ou mutações genéticas podem levar a alterações na atividade neurológica nativa do peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave tanto na biologia do desenvolvimento quanto na neurobiologia sobre como as mudanças na estrutura cerebral podem afetar as mudanças na atividade neural, tanto no desenvolvimento normal quanto no caso de mutação genética. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque é preciso tomar cuidado extra para remover apenas uma pequena parte da placa óssea que cobre a cabeça sem danificar o tecido cerebral.

A cânula de intubação facilita a introdução de fluido nos peixes. Essa configuração fornece flexibilidade e firmeza para melhor posicionar a cânula dentro da boca do animal. Para esta configuração, remova uma seção de 1,5 centímetro da extremidade larga de uma ponta de pipeta P 200 com uma tesoura ou uma lâmina de barbear.

Em seguida, insira um pedaço de tubo de seis centímetros por um milímetro em uma válvula redutora. Em seguida, insira a ponta da pipeta modificada em uma pequena porção de um tubo de um oitavo de polegada de diâmetro. A cânula pode então ser inserida na ponta da pipeta usando o tubo para manter a ponta da pipeta na posição com a trava da isca.

Antes do experimento, lavou uma configuração de profusão com água do habitat, garantindo que todas as bolhas de ar fossem removidas. Em seguida, adicione 30 mililitros de solução de trica micromolar 630 à configuração de perfusão da craniotomia e permita que dois mililitros dela passem pelo tubo para garantir a entrega de trica ao animal no início da profusão. Para a configuração de profusão principal, adicione 50 mililitros de água do habitat ao primeiro tubo.

Em seguida, adicione quaisquer compostos experimentais desejados a cada um dos tubos restantes. Depois disso, coloque uma configuração de cânula no pequeno orifício da base de intubação, torça uma tira de uma polegada de largura de lenço Kim em uma espiral apertada e insira-a no tubo de drenagem de modo que o lenço Kim se estenda em ambas as extremidades. Este tecido servirá como um pavio para remover o líquido perfundido e evitar o acúmulo de líquido dentro da base de intubação que possa interferir no registro eletrofisiológico.

Em seguida, insira uma extremidade do tubo no orifício grande da placa de Petri, permitindo que a extremidade inferior se estenda em uma placa inerte grande o suficiente para coletar todos os resíduos de profusão. Este prato servirá como reservatório de saída para a configuração. Em seguida, posicione o tecido de forma que uma extremidade fique perto da região abdominal do animal e a extensão inferior possa pingar no prato.

Coloque esta base de intubação completa perto do microscópio de dissecação. Em seguida, conecte a trava lu da cânula ao tubo de profusão trican. Neste procedimento, adicione solução trica 630 micromolar a uma placa de Petri de 15 por 60 milímetros até três quartos.

Em seguida, pesar o prato campos. Isso será usado para imobilizar o animal para que mais anestesia possa ser injetada no peritoneal. Agora mergulhe o animal no prato contendo trica e pese o prato novamente.

Em seguida, calcule o peso do peixe subtraindo o peso do prato cheio do peso total. Deixe o animal permanecer na solução trica até que esteja calmo e a maior parte do movimento tenha cessado. Enquanto o peixe estiver imerso na solução trica, use uma seringa NFI contendo uma agulha de calibre 34 para retirar brometo de pantônio suficiente, de modo que haja um micrograma por grama de peso do peixe.

Assim que o peixe estiver acalmado, use uma pinça larga para transferir o peixe pela cauda para uma esponja pré-umedecida e posicione-a lateralmente. Em seguida, coloque uma esponja e o peixe sob o microscópio de dissecação. Segure o lado dorsal do peixe com um palito de picolé.

Em seguida, administre o brometo de pan-keon interperitoneal. Agora use uma pinça fina. Pegue o peixe pela mandíbula inferior e transfira rapidamente o animal para a base de intubação.

Posicione o lado dorsal do animal para cima na forma de cera de forma que a cânula de um milímetro possa ser inserida na boca. Em seguida, use a pinça fina para manobrar o peixe e abra a boca ao redor da cânula. Em nossa configuração.

Uma parada foi projetada na base, permitindo que a cânula fosse inserida três milímetros na boca do peixe. Quando estiver em posição, ligue o tubo de perfusão alimentado por gravidade contendo o trica. Em seguida, corte uma seção de três centímetros quadrados de lenço de papel Kim e case-o com água do habitat.

Coloque o tecido sobre o animal para evitar a dessecação. Sob o microscópio de dissecação, o peixe é preparado e aguarda a realização da craniotomia. Esta área parece uma placa óssea escura que fica atrás do olho.

Em seguida, insira uma lâmina da tesoura na borda da placa e empurre-a com força suficiente para penetrar no osso sem perfurar o cérebro. Em seguida, feche a tesoura para cortar o osso. Depois disso, remova o pedaço de osso para registro de eletrofisiologia.

Desligue a intubação. Pare a torneira e desconecte rapidamente a trava da isca que conecta a base de intubação ao gotejamento trica. Mova a configuração de intubação intacta para o microscópio de eletrofisiologia e conecte-a ao sistema de perfusão.

Ligue o habitat, regue e perfunda a uma taxa de um mililitro por minuto por cerca de uma hora. Para lavar o trica usando um micromanipulador, posicione o eletrodo secundário de forma que a ponta do eletrodo possa ser inserida na narina do animal ou no mergulho sob a mandíbula superior. Em seguida, insira a agulha do eletrodo primário na abertura da craniotomia.

Em seguida, insira a agulha no tecido de forma que a ponta fique posicionada de forma bastante superficial dentro do tum óptico. Posições mais profundas do eletrodo podem resultar em um pequeno sinal elétrico para o modo livre de lacunas de coleta de dados a uma taxa de amostragem de 5.000 hertz, juntamente com um filtro passa-baixa de 0,1 kilohertz e um filtro passa-alta de um hertz. Iniciar o registo da actividade electrofisiológica quando a água do habitat tiver perfundido durante um mínimo de 45 minutos.

Registre uma linha de base da atividade nativa por pelo menos 15 minutos antes da adição de drogas experimentais. A atividade neurológica nativa do peixe-zebra adulto foi monitorada neste experimento, esta figura mostra a atividade basal espontânea do tum óptico com uma pequena amplitude em torno de dois a 10 milivolts durante toda a duração da gravação. Após a introdução do PTZ de 15 milimolares no sistema, a forma epiléptica espontânea como descargas começou a se desenvolver em cinco minutos.

A exposição contínua ao PTZ levou a um padrão consistente de até 15 milivolts, descargas de grande amplitude, seguidas por rajadas de atividade menores e mais frequentes. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente e não se apressar ao manusear o animal e realizar a craniotomia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como obter gravações in vivo da atividade neural no cérebro de um peixe-zebra adulto intacto.

Isso é feito usando um sistema de profusão e realizando uma craniotomia no animal imobilizado.