Preparação de amostras para metabolômica: um método para preparar amostras de células para perfil de metabólitos

A metabolômica é o estudo para identificar e quantificar os metabólitos presentes nas células. Para preparar a amostra, comece semeando células de câncer de mama junto com o meio de crescimento em duas placas rotuladas como teste e controle. Incubar por três dias a 37 graus Celsius. Agora, remova o meio e adicione meio fresco com estradiol na placa de teste e meio simples na placa de controle.

O estradiol se liga ao receptor de estrogênio alfa nas células do câncer de mama para induzir certas expressões, causando uma mudança na composição do metabólito. Incube as placas pela duração desejada. Substitua o meio por solução salina tamponada com fosfato gelado ou PBS para lavar as células e, em seguida, adicione acetona gelada. Os reagentes gelados interrompem a ação das proteases e, assim, evitam a degradação das proteínas.

Agora use um raspador para separar as células das placas e transfira-as para tubos com a ajuda de uma pipeta. Leve 20 microlitros dessa suspensão celular para um hemocitômetro e conte o número de células. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até serem usadas para análise posterior. No protocolo a seguir, preparamos amostras de células MCF-7 para cromatografia gasosa e espectrometria de massa.

Usando células MCF-7 cultivadas de acordo com o protocolo de texto, adicione cinco mililitros de 1x PBS gelado à placa. Em seguida, incline a placa várias vezes antes de remover o PBS. Repita mais duas vezes removendo o máximo de PBS possível após a última lavagem. Adicione 750 microlitros de acetona pré-resfriada a cada placa e raspe as células, depois combine as células de duas placas em um tubo de dois mililitros no gelo.

Para contar as células para normalização, para cada tratamento, use duas placas extras para quantificação celular. Em seguida, para separar as células das placas, adicione 2 mililitros de tampão HE e incube por cinco minutos. Misture bem as células pipetando no tampão HE.

Em seguida, use 20 microlitros da solução celular em um hemocitômetro para contar o número de células ao microscópio. Armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos antes de usar a análise de espectrometria de massa por cromatografia gasosa para identificar e quantificar os metabólitos. Realizar análise integrativa de acordo com o protocolo de texto.