Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

O objetivo geral deste método é usar o rastreamento de isótopos para medir o metabolismo de populações classificadas de comunidades celulares complexas. Assim, com este método, podemos estudar as diferenças metabólicas entre subpopulações de comunidades celulares complexas e também a colaboração metabólica entre essas subpopulações. A principal vantagem dessa técnica é que, combinando o rastreamento de isótopos com a classificação de células, podemos obter uma medida mais confiável do metabolismo e também podemos validar a confiabilidade do método.

A demonstração visual desse método é fundamental, pois combina diferentes técnicas, e a forma como as células são manuseadas e a duração do procedimento podem afetar o metabolismo celular. Para extração de metabólitos de uma placa, primeiro cultive as células em uma placa de seis poços em meio de cultura marcado com isótopos estáveis contendo suplementos dialisados. Quando as células atingirem 75% de confluência, enxágue os poços duas vezes com 500 microlitros de HBSS frio contendo glicose uniformemente marcada.

Em seguida, adicione 600 microlitros de metanol pré-resfriado com gelo seco a 100% em cada poço e transfira a placa para o gelo seco. Use um raspador de células para separar as células e, em seguida, transfira cuidadosamente os extratos de cada poço para tubos de microcentrífuga individuais. Armazene as células a menos 80 graus Celsius até a análise por espectrometria de massa.

Para extração de metabólitos de células classificadas, cultivar células em uma placa de 100 milímetros em meio de cultura marcado com suplementos dialisados, para que atinjam 75% de confluência no dia da classificação. Para marcação de pulso de células classificadas pelo ciclo celular, cultive as células em meio não marcado contendo suplementos dialisados até atingirem 75% de confluência. Em seguida, rotule as células por pulso por duas horas, substituindo o meio por meio de cultura fresco marcado.

Lave o prato com HBSS quente contendo glicose uniformemente marcada e retire as células com 1,5 mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius. Após quatro minutos, desative a tripsina com três mililitros de HBSS gelado contendo glicose marcada e suplementos dialisados e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspenda o pellet em HBSS contendo glicose marcada, suplementos dialisados e EDTA em uma concentração de uma a duas vezes 10 a seis células por mililitro e filtre as células através de um filtro de 40 mícrons para obter uma suspensão de célula única.

Transfira as células para um tubo de cinco mililitros e classifique-as em um citômetro de fluxo. Para extração de metabólitos de células classificadas simuladas, marchar os detritos e classificar apenas os singletos. Para extração de metabólitos de células classificadas pelo ciclo celular, remova os detritos e dupletos e classifique as células em G1 e SG2M, com base na fluorescência da sonda de geminina.

No final da classificação, coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em 50 microlitros de água destilada gelada para obter um pellet homogêneo. Em seguida, extraia rapidamente os metabólitos adicionando 540 microlitros de metanol resfriado com gelo seco. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius até a análise LCMS.

A extração de metabólitos de células selecionadas deve ser bem planejada com antecedência, com o trabalho experimental sendo concluído o mais rápido possível para minimizar as alterações metabólicas. Para análise dos metabólitos extraídos, primeiro selecione vários metabólitos com os padrões disponíveis correspondentes que exibam picos de amostra de boa qualidade. Em seguida, verifique a qualidade dos picos, tomando cuidado para não incluir isótopos falsos.

Calcule o isótopo de massa de nossas frações para as amostras marcadas com isótopos dividindo a área de pico de cada isótopo de massa de nossa fração pelas áreas de pico totais de todos os isótopos de massa de nossas frações. Em seguida, calcule as frações de carbono marcadas para o enriquecimento de carbono-13 usando a fórmula para enriquecimento de carbono. Finalmente, calcule as frações de nitrogênio marcadas para o enriquecimento de nitrogênio-15 usando a fórmula para enriquecimento de nitrogênio.

Neste experimento representativo, 66 metabólitos selecionados a partir da análise de dados estavam presentes nas células classificadas simuladas, 60 dos quais pareciam estar marcados com isótopos de massa semelhantes de nossas distribuições entre os extratos de placas e as células classificadas simuladas. Por exemplo, o isótopo de massa de nossa distribuição de glutamato é semelhante entre o prato e os extratos classificados simulados, indicando que o isótopo de massa de glutamato de nossa distribuição também é confiável em populações de células classificadas. A análise de células HELA classificadas em estágios do ciclo celular G0, G1 ou SG2M usando a sonda de geminina FUCCI revela marcação de citidina em ambas as populações com maior enriquecimento no estágio SG2M, consistente com um aumento da síntese de novo de nucleotídeos durante a fase S.

Neste experimento, o isótopo de massa de nossa distribuição exibiu o mesmo padrão em ambas as frações classificadas pelo ciclo celular, sugerindo que a mesma via de síntese é usada, mas é mais ativa no estágio SG2M, demonstrando que as diferenças metabólicas são prontamente detectáveis por este método, mesmo entre subpopulações intimamente relacionadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair metabólitos de frações classificadas e entender as ressalvas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as células rapidamente durante a classificação e extração de metabólitos, pois a maneira e o período de tempo em que as células são manuseadas podem afetar seu metabolismo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco horas. Este procedimento pode ser aplicado a outros tipos de células. Por exemplo, subconjuntos de células imunes no sangue ou diferentes tipos de células dentro de um tumor, usando uma variedade de sondas, anticorpos ou métodos de coloração para classificação.