Name: Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprenda a medir o metabolismo em subpopulações ordenadas de comunidades celulares complexas usando traçadores de isótopos estáveis e citometria de fluxo. Este método combina espectrometria de massas para análise metabólica precisa.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Anas Kamleh pela ajuda valiosa na otimização dos métodos de espectrometria de massa e a Annika von Vollenhoven pela assistência na classificação de células. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Sueca para Pesquisa Estratégica (grant no. FFL12-0220) e o Programa Estratégico de Pesquisa sobre o Câncer (IR, RN); a Fundação Sueca Coração-Pulmão (CEW, HG); e Fundação Mary Kay (JW, MJ).

1. metabolito Extração <ol><li> Extração de prato <ol><li> células de cultura em uma placa de 6 poços em triplicado em isótopos marcados meios de cultura estáveis ​​+ suplementos dialisados ​​(soro ou outros suplementos de crescimento) até que as células se tornam 75% confluentes. NOTA: Aqui cultura de células HeLa, durante 48 h em RPMI contendo 40% U- 13 C-glicose e 70% U- 13 C, 15 N2-glutamina e 5% de FBS dialisado (Soro Bovino Fetal). FBS dialisado é usado para se livrar dos pequenos metabólitos peso molecular que possam contaminar os meios de comunicação rotulados. células em suplemento dialisada antes da experiência real, a cultura é recomendada para garantir as células estão a crescer normalmente no meio. Suplementos são dialisados ​​em solução 0,15 M NaCl durante a noite usando tubo de diálise pele de cobra. </li><li> No dia de meios de cultura de extração de descarte, lavar os poços duas vezes com HBSS 500 mL fria e depois descartá-lo. NOTA: Aqui utilizar HBSS contendo 40% de U-13 C-glucose uma vez que também é no meio de cultura. </li><li> Adicionar 600 uL de metanol a 100% pré-arrefecido em gelo seco. </li><li> Colocar a cápsula para secar gelo e remover o material celular com um raspador de células. </li><li> Cuidadosamente pipetar os extractos de células para um tubo de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até a análise por espectrometria de massa. </li></ol></li><li> Extracção de células classificadas simulados <ol><li> células de cultura em um prato de 100 mm de triplicado em isótopos marcados meios de cultura + suplementos dialisados ​​estáveis. NOTA: Aqui cultura de células HeLa, durante 48 horas em placa de 100 mm, porque um grande número de células (~ 4 x 10 6) são necessários para obter 500.000 células separadas. Este número de células HeLa extracto foi necessária para obter uma boa medição de metabolitos. O meio de cultura utilizado foi o meio RPMI contendo 40% U- 13 C-glucose e 70% U- 13 C, 15 N2-glutamina e 5% de FBS dialisada. </li><li> No dia de extracção, meios de cultura de descarte, lavar os poços wom 1,5 mL quente HBSS e depois descartá-lo. </li><li> Separe as células por adição de 1,5 ml de tripsina / EDTA durante 4 min a 37 ° C. Execute as seguintes etapas em 4 ° C ou em gelo. </li><li> Desactivar tripsina, adicionando 3 mL de gelo HBSS frio (Solução Salina Equilibrada de Hank) + suplemento de diálise. </li><li> Recolher as células num tubo de 15 ml e centrifugar a 750 xg durante 3 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em suplemento + EDTA 1 mM + HBSS dialisado a uma concentração de 1-2 x 10 6 células / ml, passar através de 40 uM coadores de células para a obtenção de células individuais, e transferir para um tubo de 5 ml. </li><li> Ordenação de células através de separação de células de propagação única para singletos, e células de centrífuga classificados a 750 xg durante 3 min a 4 ° C. NOTA: Aqui classificar células HeLa a uma taxa de 1.000 eventos / s, com pressão instrumento de 27 psi, e usando um bico de 100 mm. As células HeLa são grandes para que eles devem ser classificadas em uma taxa de eventos lento e grande bico para obter pellet tão intacto quanto possível. Manter as células em blocos frios throughout triagem para diminuir o metabolismo. Uma descrição completa do processo de classificação é descrito anteriormente 12. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL de gelo frio de dH 2 O para se obter um pelete homogénea antes da adição de metanol. A adição de metanol frio directamente para sedimentar forma um sedimento sólido que é difícil para ressuspender. </li><li> Extrair metabolitos por adição de 540 uL de metanol mantido em gelo seco e manter extractos a -80 ° C até a cromatograf ia líquida - espectroscopia de massa de alta resolução (LC-HRMS) análise. </li></ol></li><li> Extracção do ciclo celular de células classificadas <ol><li> células de cultura em um prato de 100 mm de triplicado em meio de cultura + suplementos dialisados. NOTA: Aqui cultura células HeLa contendo geminin Fucci verde (-MAG1 hGem) da sonda 13, que permite a triagem de G1 (negativo) e células SG2M (positivas). As células podem ser cultivadas em meios rastreio de isótopos estáveis ​​para umaé tempo considerado necessário. Aqui temos cultivados-los por 46 h em meio não marcado, então nós mudaram para RPMI contendo 40% de U- 13 C-glicose e 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamina 2 h antes de iniciar a triagem. Isto foi feito a fim de ser capaz de estudar as fases do ciclo celular que requer um pulso curto rotulagem. </li><li> No dia da extracção, meios de cultura de descarte, lavar os poços com 1,5 mL HBSS quente e, em seguida, descartá-lo. </li><li> Separe as células por adição de 1,5 ml de tripsina / EDTA durante 4 min a 37 ° C. Execute as seguintes etapas em 4 ° C ou em gelo. </li><li> Desactivar tripsina, adicionando 3 mL gelada HBSS + suplemento de dialisado. </li><li> Recolher as células num tubo de 15 ml e centrifugar a 750 xg durante 3 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em suplemento + EDTA 1 mM + HBSS dialisado a uma concentração de 1-2 x 10 6 células / ml, passar através de 40 uM coadores de células para a obtenção de células individuais, e transferir para um tubo de 5 ml. </li><li> Classificar células através do classificador de células gAting a entrada de detritos e dupletos, em seguida, gating para o marcador de células de interesse, e células de centrífuga classificados em 750 xg durante 3 min a 4 ° C. NOTA: Aqui classificar células HeLa a uma taxa de 1.000 eventos / s, com pressão instrumento de 27 psi, e usando um bico de 100 mm. Manter as células em blocos de frio ao longo de triagem para diminuir a taxa de metabolismo. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL de gelo frio de dH 2 O para se obter um pelete homogénea antes da adição de metanol. A adição de metanol frio directamente para sedimentar forma um sedimento sólido que é difícil para ressuspender. </li><li> Extrair os metabolitos por adição de 540 uL de metanol mantido em gelo seco e manter extractos a -80 ° C até a análise por LC-HRMS. </li></ol></li></ol> 2. Análise de Espectrometria de Massa Nota: Aqui nós descrevemos o protocolo para a análise de extratos de células em um sistema LC-HRMS. Quaisquer métodos metabolômicos para análise de extractos celulares pode ser usado. verificação completaA análise pode ser útil na detecção de uma ampla variedade de metabolitos. <ol><li> Calibrar o instrumento utilizando uma mistura de calibração de referência espectrometria de massa. </li><li> extractos celulares descongelamento em gelo durante 30 min e agitar com vortex durante 15 s. </li><li> Transferir 100 uL de extracto celular para um filtro de centrifugação e centrifugar durante 10 min a 13000 xg, a 4 ° C. </li><li> Injectar 12,5 uL do filtrado para o sistema de LC-HRMS. </li><li> metabolitos separados utilizando cromatografia líquida zwitteriónico Interacção Hidrofílico (ZIC-HILIC) coluna (150 mm x 4,6 mm, 5 um de tamanho de partícula) equipado com uma coluna de guarda ZIC-HILIC (20 mm x 2,1 milímetros) usando um gradiente de eluição de 0,1% fórmico ácido em água (solvente a) e acetonitrilo (solvente B). Iniciar a eluição em gradiente a 20% de solvente A e aumentar até 80% em 17 min. Manter esta percentagem durante 4 min, com um fluxo de 400 mL min -1 e a temperatura da coluna e da bandeja da amostra a 23 ° C e 4 ° C, respectivamente. </li><li> Use um iINSTRUMENTO acoplado à separação cromatográfica para a detecção de metabolitos, um electropulverização aquecida (H-ESI II) em ambos os modos positivos e negativos como fonte de ionização, e um modo de aquisição de varrimento total em um poder de resolução de massa de 70000 completa largura meia altura (FWHM) ( m / z 200). </li><li> Use azoto (pureza&gt; 99,995%) para o gás de revestimento e gás auxiliar a um caudal de 45 e 10 AU (unidades arbitrárias) e ajustar a temperatura do vaporizador a 350 ° C e a tensão de electrospray a 4 kV no modo positivo e -3,5 kV no modo negativo. </li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> Selecione um número de metabolitos para os quais existam normas e que mostram picos de boa qualidade nas amostras. picos de boa qualidade tem alta relação sinal-ruído. É importante verificar a qualidade do pico e certifique-se de não incluir falsos isótopos. picos isotópicos, que diferem entre si em forma e / ou tempo de retenção são susceptíveis falsa. </li><li> Para amostras marcados com isótopos calcular isotopomer de massa (MI) fracções, dividindo a área do pico de cada MI com áreas totais dos picos de todas as IMs. </li><li> Calcular as fracções de carbono / azoto marcados, enriquecimento de 13 C e 15 N, respectivamente, conforme <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> onde n é o número total de átomos de carbono (ou azotos, respectivamente) no metabolito, e misturar a fracção é MI de x. NOTA: Todos os cálculos podem ser realizados utilizando linguagens de programação. </li></ol>

<ol><li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li>
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<li>Moussaieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metabolic+mapping+of+cell+types+in+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).</li>
<li>Johnson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+of+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature of colon cancer initiating cells.</a> Cancer Metab. 2, 32(2014).</li>
<li>Roci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+Profiling+and+Stable+Isotope+Tracing+in+Sorted+Subpopulations+of+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).</li>
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<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O nosso método é baseado no princípio de que em MIDs metabolitos celulares reflectir a &quot;história&quot; de actividades metabólicas de uma célula. Isto faz com que seja possível investigar actividades metabólicas na subpopulação de células, uma vez que ocorreram na comunidade complexo de células, antes do processo de separação de células. Em contraste, as áreas dos picos de metabólitos diferem acentuadamente entre os extratos de células classificadas e extração direta da placa de cultura 11. E...

organismos superiores contêm comunidades complexas de tipos de células distintas que colaboram para funções mais complexas. Por exemplo, tumores contêm não só as células cancerosas, mas também fibroblastos, células que constituem os vasos sanguíneos, e muitas vezes de células imunes infiltrados 1; sangue contém uma mistura complexa de dezenas de subtipos de células imunológicas 2; e ainda linhas de células cultivadas pode ser constituída por várias subpopulações, tal como o lúmen e subtipos de células basais do cancro da mama 3. Além disso, os tipos de células distintas que coexistem podem exibir &quot;colaboração&quot; metabólica. Por exemplo, no cérebro, astrócitos são pensados para converter a glicose em lactato, o qual é, em seguida, &quot;alimentado&quot; para os neurónios que oxidam este substrato 4; Os linfócitos T são, em alguns contextos dependentes de células dendríticas adjacentes como uma fonte de cisteína 5; e as células cancerosas podem colaborar com assofibroblastos ciados em tumores 6. Para compreender o comportamento metabólico de tais sistemas, é essencial para separar e medir as actividades metabólicas dos vários tipos de células presentes. De longe, o método mais amplamente utilizado para a separação de tipos de células é a classificação de células activadas por fluorescência. Este método é amplamente aplicável, desde que o tipo de célula ou do estado de interesse podem ser &quot;etiquetados&quot; utilizando anticorpos fluorescentes, a expressão de proteínas fluorescentes modificadas, ou outros corantes. Uma opção é tipos de células inicialmente separadas por meio de um classificador de células, re-cultura os tipos de células individuais obtidos, e em seguida, realizar estudos sobre o metabolismo destas culturas 7. No entanto, isto só é possível se o tipo de célula ou fenótipo é estável nas condições de cultura, e não pode captar o comportamento transiente tais como estados do ciclo celular, nem a cooperação metabólica em co-culturas. Para tais casos, o metabolismo deve ser medida directamente no assimcélulas rted. Este é um desafio desde a célula procedimento de triagem submete células a tensões que possam falsear o seu metabolismo 8, e estamos cientes de apenas alguns estudos que tomam esta abordagem 9, 10. Em particular, verificou-se que os principais metabolitos, tais como aminoácidos pode vazar a partir de células mantidas em tampão de separação de células, de modo que as medições de abundância metabolito absoluta não são fiáveis 11 (embora comparação relativa entre as fracções ordenadas podem ainda ser valiosos). Para contornar esses problemas, nós rotulamos células com isótopos estáveis ​​antes de triagem, e focar os MIDs em metabólitos celulares, em vez de abundâncias de metabólitos. Desde MIDs são formados em escalas de tempo mais longos, devem ser menos afetados pela exposição a curto prazo às condições de classificação. Nós quantificar MIDs usando espectrometria de massa de alta resolução-scan completo, que é sensível o suficiente para fornecer data em centenas de metabólitos a partir de cerca de 500.000 células classificadas, necessitando de cerca de 30-60 minutos de tempo de separação de células. Uma comparação entre um &quot;simulada&quot; classificados de controlo (células passados ​​através do instrumento de separação de células, sem qualquer gating população específica) e extracção metabolito directamente a partir da placa de cultura é feita para garantir que os médios observados são representativos daqueles na cultura original. Dependendo da escolha dos marcadores de isótopos estáveis, várias vias metabólicas podem ser estudada com este método.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isótopos de Cambridge</td> U<td>-13C-Glucose</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-Glutamina</td><td>isótopos Cambridge</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (JT Baker), grau HPLC</td><td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - Filtros centrífugos VV. Durapore PVDF 0.1 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3,000 UHPLC</td><td>Thermo Espectrômetro de</td> massa Q-Exactive Orbitrap da Fisher scientific <td></td><td></td></tr> Coluna ZIC HILIC <tr><td></td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant (150 mm x 4.6&nbsp; mm, 5 &micro; m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC Coluna de proteção HILIC (20 mm x 2,1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila Optima LC-MS, vidro âmbar</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q água</td><td>Millipore</td><td></td><td>Produzido com um sistema de gradiente Milli-Q</td></tr><tr><td>Myrsyra 99,5% Optima (ácido fórmico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Parafuso X100 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, âmbar, 100 unidades</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Tampas de rosca)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>Kit de calibração</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td><td>Wolfram Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método para medir o metabolismo em ordenado subpopulações de comunidades celulares complexas usando stable isotope tracing

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Os tipos de células de mamíferos exibem metabolismo especializado, e há ampla evidência de que vários tipos de células coexistentes se envolvem em cooperação metabólica. Além disso, mesmo culturas de um único tipo de célula podem conter células em estados metabólicos distintos, como células em repouso ou em ciclo. Métodos para medir as atividades metabólicas de tais subpopulações são ferramentas valiosas para entender o metabolismo celular. Populações de células complexas são mais comumente separadas usando um classificador de células, e subpopulações isoladas por este método podem ser analisadas por métodos metabolômicos. No entanto, um problema com essa abordagem é que o procedimento de classificação de células sujeita as células a estresses que podem distorcer seu metabolismo.
Para superar esses problemas, raciocinamos que as distribuições de massa de isotômeros (MIDs) de metabólitos de células cultivadas com nutrientes marcados com isótopos estáveis provavelmente são mais estáveis do que as concentrações absolutas de metabólitos, porque os MIDs são formados em escalas de tempo mais longas e devem ser menos afetados pela exposição de curto prazo a condições de classificação celular. Aqui, descrevemos um método baseado nesse princípio, combinando classificação de células com cromatografia líquida - espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). O procedimento envolve a análise de três tipos de amostras: (1) extratos de metabólitos obtidos diretamente da população complexa; (2) extratos de células "simuladas" passaram pelo instrumento classificador de células sem bloquear nenhuma população específica; e (3) extratos das populações classificadas reais. As células classificadas simuladas são comparadas com a extração direta para verificar se os MIDs não são de fato alterados pelo próprio procedimento de classificação de células, antes de analisar as populações classificadas reais. Mostramos exemplos de resultados de células HeLa classificadas de acordo com a fase do ciclo celular, revelando mudanças no metabolismo de nucleotídeos.

Como um exemplo, aqui descrevemos uma experiência investigar o metabolismo das células HeLa classificados de acordo com a fase do ciclo celular. Para identificar uma grande variedade de metabolitos centrais em ambos os átomos de carbono e átomos de azoto, que as células cultivadas durante 48 h, usando U- 13 C-glicose e U- 13 C, 15 N-glutamina como marcadores. Para obter MIDs ricos para a experiência de validação, que escolheu uma mistura de 40% U- 13...

Este artigo descreve um método para estudar o metabolismo celular em comunidades complexas de vários tipos de células, usando uma combinação de rastreamento de isótopos estáveis, classificação de células para isolar tipos específicos de células e espectrometria de massa.

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

O objetivo geral deste método é usar o rastreamento de isótopos para medir o metabolismo de populações classificadas de comunidades celulares complexas. Assim, com este método, podemos estudar as diferenças metabólicas entre subpopulações de comunidades celulares complexas e também a colaboração metabólica entre essas subpopulações. A principal vantagem dessa técnica é que, combinando o rastreamento de isótopos com a classificação de células, podemos obter uma medida mais confiável do metabolismo e também podemos validar a confiabilidade do método.A demonstração visual desse método é fundamental, pois combina diferentes técnicas, e a forma como as células são manuseadas e a duração do procedimento podem afetar o metabolismo celular. Para extração de metabólitos de uma placa, primeiro cultive as células em uma placa de seis poços em meio de cultura marcado com isótopos estáveis contendo suplementos dialisados. Quando as células atingirem 75% de confluência, enxágue os poços duas vezes com 500 microlitros de HBSS frio contendo glicose uniformemente marcada.Em seguida, adicione 600 microlitros de metanol pré-resfriado com gelo seco a 100% em cada poço e transfira a placa para o gelo seco. Use um raspador de células para separar as células e, em seguida, transfira cuidadosamente os extratos de cada poço para tubos de microcentrífuga individuais. Armazene as células a menos 80 graus Celsius até a análise por espectrometria de massa.Para extração de metabólitos de células classificadas, cultivar células em uma placa de 100 milímetros em meio de cultura marcado com suplementos dialisados, para que atinjam 75% de confluência no dia da classificação. Para marcação de pulso de células classificadas pelo ciclo celular, cultive as células em meio não marcado contendo suplementos dialisados até atingirem 75% de confluência. Em seguida, rotule as células por pulso por duas horas, substituindo o meio por meio de cultura fresco marcado.Lave o prato com HBSS quente contendo glicose uniformemente marcada e retire as células com 1,5 mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius. Após quatro minutos, desative a tripsina com três mililitros de HBSS gelado contendo glicose marcada e suplementos dialisados e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspenda o pellet em HBSS contendo glicose marcada, suplementos dialisados e EDTA em uma concentração de uma a duas vezes 10 a seis células por mililitro e filtre as células através de um filtro de 40 mícrons para obter uma suspensão de célula única.Transfira as células para um tubo de cinco mililitros e classifique-as em um citômetro de fluxo. Para extração de metabólitos de células classificadas simuladas, marchar os detritos e classificar apenas os singletos. Para extração de metabólitos de células classificadas pelo ciclo celular, remova os detritos e dupletos e classifique as células em G1 e SG2M, com base na fluorescência da sonda de geminina.No final da classificação, coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em 50 microlitros de água destilada gelada para obter um pellet homogêneo. Em seguida, extraia rapidamente os metabólitos adicionando 540 microlitros de metanol resfriado com gelo seco. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius até a análise LCMS.A extração de metabólitos de células selecionadas deve ser bem planejada com antecedência, com o trabalho experimental sendo concluído o mais rápido possível para minimizar as alterações metabólicas. Para análise dos metabólitos extraídos, primeiro selecione vários metabólitos com os padrões disponíveis correspondentes que exibam picos de amostra de boa qualidade. Em seguida, verifique a qualidade dos picos, tomando cuidado para não incluir isótopos falsos.Calcule o isótopo de massa de nossas frações para as amostras marcadas com isótopos dividindo a área de pico de cada isótopo de massa de nossa fração pelas áreas de pico totais de todos os isótopos de massa de nossas frações. Em seguida, calcule as frações de carbono marcadas para o enriquecimento de carbono-13 usando a fórmula para enriquecimento de carbono. Finalmente, calcule as frações de nitrogênio marcadas para o enriquecimento de nitrogênio-15 usando a fórmula para enriquecimento de nitrogênio.Neste experimento representativo, 66 metabólitos selecionados a partir da análise de dados estavam presentes nas células classificadas simuladas, 60 dos quais pareciam estar marcados com isótopos de massa semelhantes de nossas distribuições entre os extratos de placas e as células classificadas simuladas. Por exemplo, o isótopo de massa de nossa distribuição de glutamato é semelhante entre o prato e os extratos classificados simulados, indicando que o isótopo de massa de glutamato de nossa distribuição também é confiável em populações de células classificadas. A análise de células HELA classificadas em estágios do ciclo celular G0, G1 ou SG2M usando a sonda de geminina FUCCI revela marcação de citidina em ambas as populações com maior enriquecimento no estágio SG2M, consistente com um aumento da síntese de novo de nucleotídeos durante a fase S.Neste experimento, o isótopo de massa de nossa distribuição exibiu o mesmo padrão em ambas as frações classificadas pelo ciclo celular, sugerindo que a mesma via de síntese é usada, mas é mais ativa no estágio SG2M, demonstrando que as diferenças metabólicas são prontamente detectáveis por este método, mesmo entre subpopulações intimamente relacionadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair metabólitos de frações classificadas e entender as ressalvas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as células rapidamente durante a classificação e extração de metabólitos, pois a maneira e o período de tempo em que as células são manuseadas podem afetar seu metabolismo.Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco horas. Este procedimento pode ser aplicado a outros tipos de células. Por exemplo, subconjuntos de células imunes no sangue ou diferentes tipos de células dentro de um tumor, usando uma variedade de sondas, anticorpos ou métodos de coloração para classificação.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.

Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

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A abordagem de marcador trófica de ácido graxo, ou seja, a assimilação dos ácidos graxos como molécula inteira e transferência em tecido de consumidor com n ou menor modificação, é dificultado por lacunas de conhecimento no metabolismo de ácidos graxos de invertebrados de solo pequeno. Isotopólogo de criação de perfil é fornecida como uma valiosa ferramenta de desvencilhar interações tróficas.

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Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

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