Preparação de Pulmão de Camundongo para Citometria de Fluxo: Gerando Suspensão Celular do Tecido Pulmonar para Análise de Citometria de Fluxo

- Comece pegando um camundongo sacrificado e prenda-o em uma placa de dissecação com fita adesiva. Use uma tesoura para cortar a pele. Faça uma incisão vertical através do diafragma e corte as costelas para alcançar a cavidade torácica, expondo o coração e os pulmões. Em seguida, faça uma pequena incisão no ventrículo esquerdo do coração. Em seguida, localize o ventrículo direito e insira uma seringa contendo PBS no lúmen do ventrículo. Perfunda PBS através do ventrículo direito, deixando o sangue fluir para fora da incisão pré-fabricada no ventrículo esquerdo até que os pulmões fiquem brancos. Retire o tecido pulmonar contendo nódulos tumorais e pique em pequenos pedaços.

Incube os pedaços no tampão de digestão pulmonar. A colagenase no tampão de digestão pulmonar ajuda a isolar as células e a DNAse ajuda a eliminar o DNA das células mortas. Coe a suspensão resultante através de um filtro de célula para remover aglomerados e uniformizar a suspensão celular. Centrifugue e ressuspenda o pellet no tampão de potássio de cloreto de amônio para lisar os eritrócitos residuais. Centrifugue para coletar os leucócitos e células tumorais no pellet. Ressuspenda o pellet em PBS suplementado com FCS, para manter a estabilidade celular. No protocolo a seguir, demonstraremos a preparação da suspensão de células pulmonares para análise por citometria de fluxo.

Após o desfecho experimental apropriado, embeber a carcaça em etanol a 70% e prender o animal a uma placa de dissecação. Faça uma incisão na linha média ventral e inverta suavemente a pele para expor os músculos da parede torácica e os órgãos abdominais. Use uma tesoura para perfurar o diafragma e cortar as costelas expondo a cavidade torácica. Corte uma pequena abertura no ventrículo esquerdo e use uma agulha de calibre 27 para perfundir o pulmão três vezes através do ventrículo direito com 6 a 8 mililitros de PBS gelado por infusão. Após a última perfusão, os pulmões devem estar completamente livres de sangue e parecer brancos. Após a colheita, use uma tesoura para picar o tecido pulmonar em pedaços pequenos.

Transfira os fragmentos pulmonares para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo 1,5 mililitros de tampão de digestão pulmonar para uma incubação de 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius com agitação. No final da digestão, transfira a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons para um tubo de 50 mililitros e use a extremidade de um êmbolo de seringa estéril de 10 mililitros para pressionar quaisquer fragmentos de tecido restantes através do filtro. Enxágue o filtro com 15 mililitros de PBS suplementado com 2% de FCS e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de lise de potássio de cloreto de amônio por uma incubação de 5 minutos à temperatura ambiente e centrifugue as células novamente. Em seguida, ressuspenda o grânulo branco em 1 mililitro de PBS suplementado com 2% de FCS e cove as células para análise por citometria de fluxo de acordo com o protocolo experimental.