Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

Neste protocolo de vídeo, você verá como dissociar o tecido pulmonar de camundongos adultos usando o máximo suave após a dissociação do tecido pulmonar. Na presença de colagenase d e DNAS, as suspensões de células uma são filtradas usando uma centrífuga de filtro de células de 70 mícrons e suspensas para aplicações posteriores. Olá, sou Melanie Mlu da Mil Biotech na Alemanha.

Hoje vou mostrar um procedimento reprodutível e automatizado para a preparação de uma única suspensão celular do tecido pulmonar de camundongo usando a dissociação GenX. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para preparar suspensões de células únicas para a preparação de leucócitos ou células endoteliais. Ok, vamos começar.

Antes de iniciarmos o protocolo, algumas soluções padrão devem ser preparadas e prontas. Primeiro, precisaremos do buffer Hebes. Em segundo lugar, uma solução de colagenase D contendo 100 miligramas por mililitro de enzima e tampão hebes.

Terceiro, uma solução dase one contendo 20.000 unidades por mililitro dase one. Por fim, duas soluções comuns de buffer. Um tampão PBS típico em pH 7,2 e um tampão PEB derivado da solução de enxágue AutoMax e da solução estoque BSA.

Começamos nosso protocolo com um pulmão dissecado derivado de um camundongo com biópsia de seis a sete semanas. Certifique-se de que o pulmão esteja livre de órgãos adjacentes, como coração e timo, vasos sanguíneos eferentes e aferentes, traqueia e tecidos conjuntivos. Enxágue o tecido em uma placa de Petri contendo PBS para remover eritrócitos.

Normalmente, um pulmão de camundongo nessa idade pesa entre 110 e 150 miligramas. Se você planeja associar pulmões de animais mais velhos ou outras linhagens de camundongos, pese o tecido e o tampão. Um máximo de 450 miligramas de tecido pode ser dissociado por um tubo.

Transfira o tecido pulmonar para um tubo C máximo suave carregado com 4,9 mililitros de tampão heis. Adicione 100 microlitros de solução de colagenase D a uma concentração final de dois miligramas por mililitro no tecido pulmonar e tampão. Agora 10 microlitros dase.

Uma solução para mais de 150 miligramas de tecido. Adicione 20 microlitros de uma solução. Certifique-se de que o tubo C esteja bem fechado e coloque-o de cabeça para baixo no dis máximo suave.

Certifique-se de que o tecido esteja localizado entre o rotor e o estator. Selecione o programa de pulmão e execute-o pressionando o botão Iniciar quando o programa terminar. Remova o tubo C do instrumento e incube a amostra por 30 minutos.

Em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a incubação, o tubo deve ser girado usando o rotador de tubo de mistura máxima ou girado manualmente a cada cinco minutos. Após a incubação, retorne o tubo C ao Associador máximo suave e execute o segundo programa pulmonar Enquanto o programa estiver em execução, prepare um tubo de 50 mililitros para coletar células filtradas substituindo a tampa por um filtro de célula de malha de 70 micrômetros. Uma vez que o programa dissociado termina, dependendo da distribuição do material da amostra no tubo, você pode querer centrifugar o tubo brevemente para concentrar o material da amostra.

As células dissociadas podem ser removidas do tubo pipetando através da tampa selada do septo do tubo C. Usando uma ponta de pipeta de 1000 microlitros adequada, a suspensão celular é aplicada ao filtro de células para remover partículas ou agregados maiores. Assim que a solução for drenada, lave o filtro de células adicionando mais cinco mililitros de temperatura ambiente e tampão para peletar as células filtradas.

Centrifugar o tubo de 50 mililitros a 300 GS durante 10 minutos. Agora aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no volume desejado de temperatura ambiente. Tampão PEB.

Não decantar o sobrenadante. Agora você pode prosseguir para seu aplicativo downstream. A dissociação do tecido pulmonar do camundongo usando este procedimento produzirá uma alta porcentagem de leucócitos viáveis e células endoteliais.

As suspensões unicelulares derivadas foram coradas com CD 45 PE como CD 1 46 FITC ou CD 31 FITC e analisadas por citometria de fluxo. Este gráfico mostra o enriquecimento de células dendríticas usando microesferas CD 11 C, um separador minimax e duas colunas MS. Okey. Acabei de mostrar como preparar suspensões de células únicas a partir de tecido pulmonar de camundongo de maneira padronizada usando a dissociação de mistura suave e os tubos C.

Este método permite a dissociação eficiente e genérica do tecido. Ao fazer este procedimento, é importante dissecar adequadamente o pulmão e processar o tecido imediatamente após a dissecção. As suspensões unicelulares preparadas podem então ser usadas para outros experimentos.

Por exemplo, a marcação magnética das células e, em seguida, a separação de leucócitos ou células endoteliais. Ok, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.