Name: Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a dissociar tecido pulmonar de camundongo usando o dissociador gentleMACS para obter suspensões de células únicas viáveis. Este método padronizado permite estudar leucócitos e células endoteliais com alta reprodutibilidade.

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Os autores são funcionários da Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha.

Para trabalhar em condições estéreis, é recomendada a realização de todas as etapas em uma capela de fluxo laminar. 1. Materiais <ol><li> HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2) </li><li> Colagenase solução D: D colagenase: 100 mg / mL (colagenase D&gt; 0,15 U / mg) buffer, na HEPES </li><li> DNase solução I: 20.000 U / mL DNase I </li><li> Tampão PBS a pH 7,2 </li><li> PEB buffer: 1 parte da solução stock BSA em 20 partes autoMACS Solução lavagem </li><li> Tecidos: pulmão derivado de 6 / 7 semanas de idade adulta feminina BALB / C mouse, livre de órgãos adjacentes. </li><li> Opcional: microesferas CD11c, Colunas MACS MS, MACS Separador para o isolamento de células dendríticas a partir de suspensão de rato de pulmão de uma única célula </li></ol> 2. Dissociar o tecido pulmonar <ol><li> Enxaguar tecido em uma placa de Petri contendo PBS para remover eritrócitos. </li><li> Transferir um máximo de 450 mg tecido pulmonar para um tubo contendo 4,9 C gentleMACS mL tampão HEPES. </li><li> Adicionar 100 mL de solução de colagenase D para uma concentração final de 2 mg / ml de colagenase D. </li><li> Adicionar 10 mL de solução DNase I para até 150 mg de tecido (concentração final de 40 U / ml DNase I) ou 20 mL DNase I para 150-450 mg tecido pulmonar (concentração final de 80 U / mL DNase I). </li><li> Fechar o tubo firmemente C e anexá-lo para o Dissociator gentleMACS. Em seguida, executar o programa "m_lung_01". </li><li> Incubar por 30 min a 37 ° C com rotação automática ou manualmente girando a cada 5 minutos. </li><li> De recolha de amostras para o Dissociator gentleMACS e execute o programa "m_lung_02". </li></ol> 3. Filtração <ol><li> Prepare um tubo de 50 mL para a recolha de células filtradas, substituindo a tampa com uma peneira 70 mesh célula mM. </li><li> Uma vez que o Programa gentleMACS segunda extremidades, dependendo da distribuição de material da amostra no tubo, você pode centrifugar o tubo rapidamente para recolher o material da amostra na parte inferior do tubo. </li><li> Remover as células através da tampa do septo selada do tubo C usando um adequado mil ponteira mL e aplicá-las ao crivo da célula. </li><li> Lavar o filtro de células com 5 ml tampão HEPES à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar as células a uma bola em um tubo de 50 mL em 300xg por 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em seu volume desejado de tampão PEB. </li></ol> Parte 4: Resultados Representante: <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Lung dissociação com o ™ gentleMACS Dissociator resultou em 92% de células viáveis. Células mortas foram fluorescente corados com iodeto de propídio (PI) (gráfico de pontos direita; gráfico de pontos à esquerda: nenhuma coloração PI). <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Dissociação do mouse tecido pulmonar, utilizando os resultados Dissociator gentleMACS em uma alta porcentagem de leucócitos viáveis ​​e células endoteliais. A derivada de uma única célula suspensões foram coradas com CD45-PE e CD146-FITC ou CD31-FITC e analisadas por citometria de fluxo. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266figure2c.png" alt="Figura 2C"> Figura 3. Único de células derivadas de suspensão tecido pulmonar do rato estava manchada de CD11c-FITC e Anti-mPDCA-1-APC para detectar rato CD11c baixa m-PDCA-1 + plasmocitóide DCs, bem como células CD11c alta. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. Enriquecimento de células dendríticas usando microesferas CD11c, um separador MiniMACS e duas colunas MS.

<ol><li>Swanson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3-Ligand%2C+IL-4%2C+GM-CSF%2C+and+Adherence-Mediated+Isolation+of+Murine+Lung+Dendritic+Cells%3A+Assessment+of+Isolation+Technique+on+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function.</a> J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).</li>
<li>Vermaelen, K., Pauwels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+simple+discrimination+of+mouse+pulmonary+dendritic+cell+and+macrophage+populations+by+flow+cytometry%3A+Methodology+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights.</a> Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).</li>
</ol>

Os autores são funcionários da Miltenyi Biotec GmbH, empresa que fabrica o instrumento utilizado neste artigo.

Neste vídeo, apresentamos um novo método para a dissociação do tecido pulmonar do rato. Nós mostramos que a combinação de tratamento mecânico e enzimático do tecido pulmonar resultou em uma alta porcentagem de leucócitos viáveis ​​e células endoteliais. Especificamente, a desintegração mecânica do tecido foi obtido pela Dissociator gentleMACS. The Tubes gentleMACS C incluem um rotor - estator sistema, que dissocia o tecido de uma maneira suave. O procedimento é controlado por as configurações do programa do instrumento....

<table><tbody><tr><td>Tubos C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Kit de Início</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Rotador de tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; Solução de Lavagem</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; Solução estoque de BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do Pedido 130-052-001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c-FITC, CD11c-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-092-026130-091-830</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-mPDCA-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-091-963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD146-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-092-026</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-091-610</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nº do pedido 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 Reach Pipet Tips</td><td>Molecular BioProducts</td><td>Nº do pedido 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

preparação padronizado de uma única célula suspensões do tecido pulmonar do rato usando o dissociator gentlemacs

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

A preparação de suspensões de uma única célula de tecidos é um requisito importante para muitas experiências em pesquisa celular. O processo de dissociação órgãos inteiros requer parâmetros específicos a fim de obter um elevado número de células viáveis ​​de forma reproduzível. O Dissociator gentleMACS otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. O instrumento contém ajustes pré-programados que são otimizados para a dissociação eficiente, mas suave de uma variedade de tipos de tecidos, incluindo pulmões mouse. Nesta publicação o uso do Dissociator gentleMACS no tecido pulmonar derivada de ratos é demonstrada.

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

A preparação de suspensões de células únicas a partir de tecidos é um pré-requisito importante para muitos experimentos em pesquisa celular. O processo de ...

Neste protocolo em vídeo, você verá como dissociar tecido pulmonar de camundongo adulto usando o gentle max após a dissociação do tecido pulmonar. Na presença de colagenase D e DNAse, suspensões celulares são filtradas utilizando uma peneira celular de 70 mícrons, centrifugadas e suspensas para aplicações posteriores. Olá, sou Melanie Mlu da Mil Biotech na Alemanha.Hoje vou mostrar a vocês um procedimento reprodutível e automatizado para a preparação de uma suspensão de células únicas a partir de tecido pulmonar de camundongo utilizando a dissociação GenX. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para preparar suspensões de células únicas com o objetivo de obter leucócitos ou células endoteliais. Ok, vamos começar.Antes de iniciarmos o protocolo, algumas soluções padrão devem ser preparadas e mantidas prontas. Primeiro, precisaremos do tampão Hebes. Segundo, uma solução de colagenase D contendo 100 miligramas por mililitro de enzima e tampão Hebes.Terceiro, uma solução de dase um contendo 20.000 unidades por mililitro de dase um. Por fim, duas soluções tampão comuns. Um tampão PBS típico em pH 7,2 e um tampão PEB derivado da solução de lavagem AutoMax e da solução estoque

standardized-preparation-single-cell-suspensions-from-mouse-lung

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Biologia

Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para aggitation tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS Dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido nerual é explicado.

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Este vídeo descreve a preparação da suspensão de células pulmonares de camundongo para análise de citometria de fluxo para estudar a expressão de PD-L1 de células de adenocarcinoma de pulmão.

Preparação de Pulmão de Camundongo para Citometria de Fluxo: Gerando Suspensão Celular do Tecido Pulmonar para Análise de Citometria de Fluxo

Este trabalho descreve a padronização de um método para obter populações de células germinativas purificadas a partir de tecido testicular de diferentes espécies de mamíferos. É um protocolo direto que combina dissociação mecânica com testículos, manchas com Hoechst-33342 e iodeto de propídio, e classificação FACS, com amplas aplicações em estudos comparativos de biologia reprodutiva masculina.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Este estudo apresenta duas técnicas experimentais cruciais: a construção de um modelo de ferida murina para avaliar o fechamento da ferida e a preparação de suspensões unicelulares de pele murina para preservar a viabilidade celular.

Modelos de Ferida em Camundongos e Preparação de Suspensões de Células Únicas

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

O protocolo descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar células contendo retinóides de populações de células pulmonares altamente heterogêneas, fazendo uso de autofluorescência retinóide específica e empregando classificação de células ativadas por fluorescência.

Isolamento de células contendo retinóides pulmonares por classificação de células

Esse protocolo apresenta um método detalhado para isolar suspensões unicelulares de alta qualidade tanto de tecido pulmonar murino saudável quanto de tumores. Esse protocolo pode ser aplicado ao scRNA-seq, análise de citometria de fluxo e isolamento de células primárias.

Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular

Aprenda a dissociar tecido pulmonar de camundongo usando o dissociador gentleMACS para obter suspensões de células únicas viáveis. Este método padronizado permite estudar leucócitos e células endoteliais com alta reprodutibilidade.

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

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