Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS
2 de julho de 2009
Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.
Neste protocolo de vídeo, você verá como dissociar o tecido pulmonar de camundongos adultos usando o máximo suave após a dissociação do tecido pulmonar. Na presença de colagenase d e DNAS, as suspensões de células uma são filtradas usando uma centrífuga de filtro de células de 70 mícrons e suspensas para aplicações posteriores. Olá, sou Melanie Mlu da Mil Biotech na Alemanha.
Hoje vou mostrar um procedimento reprodutível e automatizado para a preparação de uma única suspensão celular do tecido pulmonar de camundongo usando a dissociação GenX. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para preparar suspensões de células únicas para a preparação de leucócitos ou células endoteliais. Ok, vamos começar.
Antes de iniciarmos o protocolo, algumas soluções padrão devem ser preparadas e prontas. Primeiro, precisaremos do buffer Hebes. Em segundo lugar, uma solução de colagenase D contendo 100 miligramas por mililitro de enzima e tampão hebes.
Terceiro, uma solução dase one contendo 20.000 unidades por mililitro dase one. Por fim, duas soluções comuns de buffer. Um tampão PBS típico em pH 7,2 e um tampão PEB derivado da solução de enxágue AutoMax e da solução estoque BSA.
Começamos nosso protocolo com um pulmão dissecado derivado de um camundongo com biópsia de seis a sete semanas. Certifique-se de que o pulmão esteja livre de órgãos adjacentes, como coração e timo, vasos sanguíneos eferentes e aferentes, traqueia e tecidos conjuntivos. Enxágue o tecido em uma placa de Petri contendo PBS para remover eritrócitos.
Normalmente, um pulmão de camundongo nessa idade pesa entre 110 e 150 miligramas. Se você planeja associar pulmões de animais mais velhos ou outras linhagens de camundongos, pese o tecido e o tampão. Um máximo de 450 miligramas de tecido pode ser dissociado por um tubo.
Transfira o tecido pulmonar para um tubo C máximo suave carregado com 4,9 mililitros de tampão heis. Adicione 100 microlitros de solução de colagenase D a uma concentração final de dois miligramas por mililitro no tecido pulmonar e tampão. Agora 10 microlitros dase.
Uma solução para mais de 150 miligramas de tecido. Adicione 20 microlitros de uma solução. Certifique-se de que o tubo C esteja bem fechado e coloque-o de cabeça para baixo no dis máximo suave.
Certifique-se de que o tecido esteja localizado entre o rotor e o estator. Selecione o programa de pulmão e execute-o pressionando o botão Iniciar quando o programa terminar. Remova o tubo C do instrumento e incube a amostra por 30 minutos.
Em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a incubação, o tubo deve ser girado usando o rotador de tubo de mistura máxima ou girado manualmente a cada cinco minutos. Após a incubação, retorne o tubo C ao Associador máximo suave e execute o segundo programa pulmonar Enquanto o programa estiver em execução, prepare um tubo de 50 mililitros para coletar células filtradas substituindo a tampa por um filtro de célula de malha de 70 micrômetros. Uma vez que o programa dissociado termina, dependendo da distribuição do material da amostra no tubo, você pode querer centrifugar o tubo brevemente para concentrar o material da amostra.
As células dissociadas podem ser removidas do tubo pipetando através da tampa selada do septo do tubo C. Usando uma ponta de pipeta de 1000 microlitros adequada, a suspensão celular é aplicada ao filtro de células para remover partículas ou agregados maiores. Assim que a solução for drenada, lave o filtro de células adicionando mais cinco mililitros de temperatura ambiente e tampão para peletar as células filtradas.
Centrifugar o tubo de 50 mililitros a 300 GS durante 10 minutos. Agora aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no volume desejado de temperatura ambiente. Tampão PEB.
Não decantar o sobrenadante. Agora você pode prosseguir para seu aplicativo downstream. A dissociação do tecido pulmonar do camundongo usando este procedimento produzirá uma alta porcentagem de leucócitos viáveis e células endoteliais.
As suspensões unicelulares derivadas foram coradas com CD 45 PE como CD 1 46 FITC ou CD 31 FITC e analisadas por citometria de fluxo. Este gráfico mostra o enriquecimento de células dendríticas usando microesferas CD 11 C, um separador minimax e duas colunas MS. Okey. Acabei de mostrar como preparar suspensões de células únicas a partir de tecido pulmonar de camundongo de maneira padronizada usando a dissociação de mistura suave e os tubos C.
Este método permite a dissociação eficiente e genérica do tecido. Ao fazer este procedimento, é importante dissecar adequadamente o pulmão e processar o tecido imediatamente após a dissecção. As suspensões unicelulares preparadas podem então ser usadas para outros experimentos.
Por exemplo, a marcação magnética das células e, em seguida, a separação de leucócitos ou células endoteliais. Ok, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo em vídeo demonstra a dissociação de tecido pulmonar de camundongo adulto utilizando o dissociador gentleMACS. O procedimento foi projetado para produzir um grande volume de células viáveis e cultiváveis para aplicações posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Técnicas de dissociação celular
- Preparação de suspensão de células isoladas
- Análise de tecido pulmonar de camundongo
Contexto
- A dissociação de células a partir de tecidos requer parâmetros específicos.
- O dissociador gentleMACS fornece um protocolo otimizado.
- Colagenase D e DNase são utilizadas no processo de dissociação.
- Suspensões celulares filtradas são preparadas para aplicações posteriores.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método reprodutível para o preparo de suspensões de células isoladas.
- Facilitar o estudo de leucócitos e células endoteliais.
- Fornecer um protocolo prático para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Uso do dissociador gentleMACS para agitação do tecido.
- Aplicação de colagenase D e DNase durante a dissociação.
- Filtração das suspensões celulares por meio de um filtro celular de 70 mícrons.
- Centrifugação e suspensão das células para aplicações posteriores.
Resultados Principais
- Dissociação bem-sucedida de tecido pulmonar de camundongo em suspensões de células isoladas.
- Obtenção de alto volume de células viáveis e capazes de ser cultivadas.
- O protocolo demonstrou reprodutibilidade e eficiência.
- Preparação adequada para aplicações posteriores.
Conclusões
- O dissociador gentleMACS é eficaz para a dissociação de tecido pulmonar.
- Este método pode ser aplicado a diversos tipos de tecidos.
- Fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam tecido pulmonar.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissociação padronizada de tecidos é uma etapa crítica e inicial na pesquisa em imunologia e biologia vascular, permitindo a preparação reprodutível de suspensões primárias de células para análises posteriores. O Dissociador gentleMACS fornece um método automatizado, suave e escalonável para gerar suspensões de células únicas com alta viabilidade a partir de tecido pulmonar de camundongo, oferecendo uma entrada consistente para citometria de fluxo, separação celular e perfilagem molecular. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva em estudos de validação de alvos ao reduzir a variabilidade no rendimento celular e na viabilidade entre experimentos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a análise de populações de leucócitos e células endoteliais no tecido pulmonar para testes de hipóteses específicas.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade manual no processamento de tecidos, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios e pontos temporais.
- Valor Preditivo: Garante entrada celular consistente para citometria de fluxo e separação celular, aumentando a confiabilidade dos resultados de triagem fenotípica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz suspensões filtradas e livres de detritos, adequadas para marcação com anticorpos e ensaios baseados em fluxo.
- Valor Operacional: A digestão enzimática padronizada e a dissociação mecânica garantem consistência entre lotes em relação ao rendimento celular.
- Prontidão para Ensaios: Gera suspensões compatíveis com aplicações posteriores, como marcação magnética e separação de células.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Fornece um sistema relevante para a doença no estudo da dinâmica de células imunes e vasculares no tecido pulmonar.
- Suporte a Modelos Pré-clínicos: Permite o isolamento de células primárias de pulmões murinos para desvendar mecanisticamente alvos terapêuticos com menor risco.
- Avanço com Base no Risco: O preparo confiável de células sustenta análises consistentes de biomarcadores e validação funcional em fluxos de trabalho pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O Dissociador gentleMACS se insere no fluxo de trabalho de descoberta como uma etapa padronizada de preparação de amostras entre a coleta do tecido e a análise celular, permitindo uma transição confiável de tecido ex vivo para células únicas prontas para ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia o isolamento orientado por hipóteses de células imunes e estromais residentes no pulmão para análise de vias metabólicas.
- Triagem: Fornece suspensões celulares reprodutíveis para triagem fenotípica de alto conteúdo ou baseada em fluxo de moduladores imunológicos.
- Análises: Permite leituras quantitativas por citometria de fluxo (por exemplo, CD45+, CD31+) para comparação de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos murinos de pulmão a estudos de células imunes e endoteliais relevantes para humanos por meio de preparação padronizada.
- Reutilização Empresarial: O protocolo pulmonar pré-programado do instrumento permite reutilização em diversos projetos que estudam inflamação pulmonar, fibrose ou infecção.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Alta viabilidade e pureza de leucócitos e células endoteliais aumentam a qualidade dos dados em aplicações subsequentes.
- Valor Operacional: A automação reduz o tempo de manipulação manual e a variabilidade dependente do usuário na dissociação do tecido.
- Valor Estratégico: Permite decisões de prosseguimento ou interrupção com base em rendimentos celulares e métricas de viabilidade consistentes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos ao fornecer insumos confiáveis de células primárias para validação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige treinamento em dissecação asséptica de tecidos e manipulação enzimática.
- Depende do acesso ao Dissociador gentleMACS com programa específico para pulmão e tubos C.
- Necessita padronização das concentrações de enzimas (Colagenase D, DNase) e condições de tampão entre diferentes usuários.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de camundongos, idades ou modelos de doença que afetem a densidade do tecido.
- Limita-se a tecidos compatíveis com dissociação enzimática; podem ser necessárias alternativas mecânicas para amostras fibrosas ou calcificadas.
