Name: Isolamento and Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais de pulmão CD45 negativas de camundongos usando citometria de fluxo. Este protocolo permite caracterizar propriedades imunomoduladoras e aplicar em pesquisas de doenças pulmonares.

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Este trabalho foi financiado por doações de SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Apoio adicional foi fornecida por: DW: NIH RO1DK075013, DDK e da Fundação Kleberg; o Core Citometria de Fluxo UCCC (NIH 5 P30 CA 46934-15), o UCCC Microarray núcleo (NCI P30 CA 46934-14).

1. Isolamento de pulmão <ol><li> Sacrifício ratos adultos (80-10 semanas de idade; 18-20 g; C57Bl6J) ratos com uma overdose de isoflurano seguido de sangria utilizando técnica estéril. Perfis variam ligeiramente entre cepas. </li><li> Remover cirurgicamente o diafragma, abrir a cavidade torácica, cortando as costelas lateralmente em cada lado do mouse. Lavar o sangue dos pulmões irrigando o ventrículo direito do coração delicadamente usando 3-5mls de tampão fosfato (PBS). </li><li> Dissecar os lobos pulmonares remoção traqueia e os brônquios grandes e coloque em um prato de petri preenchida com solução salina Hanks (HBSS). Após a coleta de todos os lobos pulmonares pinças são usadas para colocar o tecido sobre a tampa do prato. Tecido é então picada em pedaços pequenos utilizando bisturis descartáveis ​​com líquido suficiente para mantê-los úmidos, mas não tanto que eles flutuam e se mover. </li><li> Dissecar um membro posterior de um dos camundongos e isolar a medula óssea a ser usado como um controle de coloração para definir o flow citometria de portas. Mancha da medula óssea (BM) como descrito anteriormente 1. </li></ol> 2. Preparação de uma suspensão de células do tecido pulmonar Único <ol><li> Cada pulmão é digerido usando um tecido de peso otimizado para relação de volume de 0,2 g: 5mls da pré-aquecido 0,2% Worthington tipo 2 colagenase (Bioquímicos Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissolvida em HBSS estéril. A mistura é imersa em um banho de água 37 ° C por 30 min 2,3. </li><li> Triturar amostra bem até digerir tecido pulmonar flui facilmente através de uma pipeta de 10ml (aproximadamente 10 repetições). Incubar por 15 minutos adicionais a 37 ° C para completar o tecido digere e garante uma suspensão de células mais uniforme único. </li><li> Diluir a suspensão de células de pulmão com HBSS e triturar com uma pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos de tecido residual. </li><li> Filtrar a suspensão utilizando um coador de células 70μM para remover fragmentos de tecido sem serem digeridas. Amostra pode ser dividida em multipltubos cônicos e neste ponto para evitar a sobrecarga um coador de celular e diminuir o tempo. </li><li> Pellet da suspensão de células por 10 min a 1500 rpm e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender pellet celular usando delicadamente a temperatura ambiente RBC tampão de lise (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubar a RT por 5 min. Adicionar um volume igual de HBSS para inativar o tampão de lise e filtrar a suspensão de células usando um coador de células 40μM para remover detritos e agregados celulares. </li><li> Pipetar 10μl de cada amostra a ser manchada e contagem de números de celular tanto para o pulmão e as amostras usando um hemocitômetro BM. Nota: registrar o volume total das células. </li><li> Pellet a suspensão única célula de células do pulmão por centrifugação a 1500 rpm por 10 min. </li><li> Ressuspender tanto pulmão e células BM em 1x10 6 células / ml no pré-aquecida (37 ° C) DMEM + (meio modificado Dulbecco Águia, glicose elevada (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092), contendo 2% Bovi fetalne soro (FBS) e HEPES 10mM. </li><li> Prepare uma solução estoque 1mg/ml de Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) em água e filtro de esterilizar 1,4. O corante Hoechst pode ser armazenada como alíquotas a -80 ° C. </li><li> Adicionar corante Hoescht 33342 para uma concentração final de 5μg/ml (a diluição de 200x de um estoque 1mg/ml) para a suspensão única célula. </li><li> Misture delicadamente as células por inversão e incubar em banho-maria 37 ° C por exatamente 90 minutos. </li></ol> 3. Coloração e preparação da suspensão de células do pulmão para a Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Depois de 90 min todos os passos com as células do pulmão Hoechst manchado deve ser executado a 4 ° C ou em gelo para evitar efluxo corante. Agregar as células por centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 4 ° C e ressuspender as células em ice-cold coloração tampão (PBS 2% FBS). </li><li> Ressuspender as células em uma concentração não superior a 1x10 7 células / tubo com 300-600μl de PBS contendo 2%FBS e HEPES 10mM. </li><li> Adicionar tituladas de forma adequada de anticorpos CD45 (tipicamente 1:200 diluição de CD45-APC (BD PharMingen, San Diego, CA; cat # 559864) para o pulmão e as amostras BM Incubar no gelo por 10-15 min Incluindo um controle durante a imaculada.. procedimento experimental é útil para definir os portões análise. </li><li> Células pelota a 4 ° C por 5 min a 1500 rpm. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 mL de tampão coloração refrigerados (PBS 2% FBS). Transferência para prechilled pressão tubos de polipropileno cap (Fisherbrand, Schaumburg, IL; cat # 14-956-1D). </li><li> Adicionar iodeto de propídio (PI, 200μg/ml de ações em PBS) para as amostras para uma concentração final de 2μg/ml para excluir as células mortas. PI deve ser utilizado em combinação com o corante Hoechst 33342 para alcançar o perfil correto de fluorescência na análise por citometria de fluxo. </li><li> Tubos de armazenamento em gelo, protegido da luz até a análise de citometria de fluxo. </li></ol> 4. Citometria de fluxo para definir e isolarum Pulmão de Células-Tronco Mesenquimais (pulmão MSC) População com corante Hoechst efluxo para detectar uma População Side (SP) <ol><li> Este ensaio tem os requisitos instrumento seguinte: </li><ul><li> 488 nm e UV (350-355 nm) lasers </li><li> 2 detectores no caminho de laser UV com o azul (450/65) e (675/50) vermelho filtros. </li><li> O detector UV vermelho deve ter alta sensibilidade para o sinal vermelho. Este pode ser um problema com a triagem mais velhos celular. </li><li> Unidade de resfriador para manter a amostra a 50-10 ° C. </li></ul><li> Alinhar lasers e configurar para separação de células seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Recolher o vermelho (eixo-x) e azul (eixo y) sinais Hoechst, usando uma escala linear. </li><li> Ajustar as tensões tubo fotomultiplicador para colocar o pico G0/G1 no canto superior direito do centro sobre o enredo para permitir a exibição adequada da população lado de trás. Uma parte da fase S e G2 do total do ciclo celular pode ser fora de escala no canto superior direito da trama. O sig azulnal é relativamente brilhante enquanto o sinal vermelho é fraca. Típico MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) tensões são 425 para o azul e 650 para o vermelho. </li><li> As células mortas são fechados por meio PI. O caminho padrão PI (excitação 488nm, emissão 630nm) pode ser usado. Alternativamente, PI também está animado com o laser UV ea população de células mortas está fora da escala do lado direito da população lado (SP) enredo. Isto alivia a necessidade de compensar o sinal PI a partir de qualquer outro, como fluorocromos FITC e PE. O método original seguido Goodell que estes últimos procedimentos 5-7. </li><li> Manter um diferencial de pressão relativamente baixa durante a análise e triagem para garantir a resolução firme da população lado. </li><li> A SP aparece como um braço do lado para além da população principal de células do pulmão. Esta população é denominado Hoechst baixo. </li><li> A baixa Hoechst / SP é analisado para separar as populações CD45 positivo e negativo usando um 2,3 histograma (FIGURA 1). </li><li> Após a selecção ea propagação do CD45 baixo Hoechst neg pulmão população MSC as células podem ser coletadas por triagem ou como uma população mista em um tubo ou uma única célula para isolar clones em uma placa de 96 poços 3. </li><li> Para placa de classificação do desvio de fluxo tipo é ajustada para 25% para criar um fluxo tipo mais vertical do que que normalmente usado para classificação tubo. </li><li> Aponte o tipo de fluxo através do envio de um pulso de corrente de teste para o canto superior esquerdo e inferior direito, em seguida, o poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Definir o classificador mapa da placa software para depositar o número desejado de células em cada poço. </li><li> Para isolar clones uma única célula MSC único pulmão é classificado dentro do poço de uma placa de 96 poços em 150μl da cultura da mídia (α-MEM suplementado com SFB 20%). Após o ordenar um adicional de 100μl médio é adicionado. </li></ol> 5. Cultura, isolamento e caracterização de pulmão MSC e Clones <ol><li> Culture e expansão de população mista de pulmão MSC e clones única célula seguinte classificação é idêntica usando condições de cultura padrão (37 ° C, 5% CO 2 e&gt; 95% de umidade). Células estão autorizados a aderir isolamento por 16 horas seguintes. Media é substituído a cada 48 horas (α-MEM suplementado com SFB 20%). Quando as células começam a proliferar mais rapidamente e atingir entre 75-80% confluência são várias passagens (Figura 2). </li><li> Células são lavadas com HBSS pré-aquecida e incubadas com 0,5% de tripsina / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) a 37 ° C por menos de 2 min. Células são monitoradas através de um escopo invertida para confirmar a aparência de uma suspensão de células. </li><li> MSC pulmão são divididos então em relação 1:2 ou 1:3, dependendo da taxa atual proliferação da cultura. </li><li> A capacidade da MSC pulmão de se diferenciar em linhagens mesenquimais tradicionais de osteoblastos, adipócitos e condrócitos e sua expressão na superfície celular de marcadores aceita mesenquimais is avaliados para cada preparação celular. A análise citogenética de bandas também é realizada para confirmar a ausência de graves anomalias cromossômicas 2,3,8-11. </li></ol> 6. Enumeração de MSC de pulmão usando uma Assay Formadoras de Colônias (CFU-F) <ol><li> Diluir as células em meio MesenCult completa (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) para uma concentração final de 1x10 6 células / ml. </li><li> Realizar diluições em série para atingir concentrações finais em um prato de 100 mm de 6x10 4 células, 3x10 4 células, 1,5 x10 4 células e 0,75 x10 4 células em 10ml de mídia. As análises são realizadas em triplicata duplicado ou para cada concentração de células e pode ser escalado para áreas menores superfície. </li><li> Células de cultura por 10 dias em condições normais. No dia 10 as células são lavadas com PBS e fixadas com metanol 100% por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Detectar as colônias CFU-F através da coloração com 0,4% de solução de coloração w / v Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluído 1:20 com água deionizada. Permitem que as amostras de ar seco e quantificar o número de colônias contendo mais de 25 células por colônia (Figura 3). </li></ol> 7. Análise das propriedades imunomoduladoras de MSC em pulmão de células T-Proliferação e Apoptose <ol><li> 6.25x10 4 células pulmonares MSC por poço são semeadas em placas de 96 poços e deixar repousar 2 durante a noite. </li><li> CD4 + células de baço de t-cell receptor (TCR) camundongos transgênicos, OT-II com células T que reconhecem a ovalbumina 323-339 peptídeo, são purificados, esgotando CD8 +, CD19 +, MHC-II + e CD25 + células com Miltenyi um classificador de células AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Células apresentadoras de antígenos (APC) são isolados por positivamente classificação MHC-II + células 12. </li><li> APC são fixados em paraformaldeído 4%, lavados três vezes em PBS / EDTA 5% BSA/2mM, e carregado com 0.5μg/ml ou 5μg / ml peptídeo OVA323. </li><li> Crescimento, simulados preso APC são adicionados à MSC de pulmão em placas de 96 poços. </li><li> Superior a 95% CD4 + pura 1x10 5 células são rotulados com 5m carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE; Sigma, St.Louis MO) em PBS e incubadas por 5 min no escuro, lavados com PBS-BSA 5%, e então adicionado ao APC e células MSC pulmão em DMEM 5% FBS mídia. Células são então incubadas por 96 horas. </li><li> T-células são então coradas com anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) e analisadas usando um Miltenyi MacsQuant 7 citômetro de fluxo do canal (Miltenyi, Aurburn, CA) e Flojo análise software (Treestar, Ashland, OR). Proliferação é medida como a diminuição da intensidade de fluorescência média de CFSE em comparação com o fundo, as células T marcado com CFSE e não expostos a APC (Figura 4). As células T são contados neste momento e de viabilidade avaliada com exclusão de tripan blue. </li></ol> 8. Resultados representativos: Figura análise de fluxo 1. Citometria e Definição de MSC Lung. Suspensões única célula de tecido pulmonar digerir são corados com Hoechst 33342 e analisados ​​por citometria de fluxo para detectar diferenças em A. dispersão para a frente (FSC) e dispersor lateral (SSC) e B. Hoechst azul e vermelho fluorescente. A presença de uma população lado (SP) é visível no portão. A Hoechst baixos SP é então analisado para separar o C. CD45 negativo da população MSC pulmão. O CD45 positivo para negativo de índices de pulmão SP normalmente são 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Isolamento e Cultura da MSC Lung. Após a colheita dos MSC pulmão por separação de células, as células são banhados em pratos de 30 milímetros usando α-MEM supplemtura orientada com FBS 20%. A. Células recém-ordenados parecem pequenos, redondos e brilhantes. B. Após cerca de 2-3 colônias semanas com um fenótipo mesenquimal tornar-se evidente e proliferação é mais óbvio. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Enumeração de MSC por Assay Formadoras de Colônias de fibroblastos. Expanded pulmão MSC são banhados por o protocolo descrito para o ensaio CFU-F. A. Depois de 10 dias e colônias Giemsa são evidentes. Colônias B. são grandes e composta por um algumas centenas de células. C. As células apresentam um fenótipo mesenquimal. A &amp; B, bar Escala = 0,5 cm; C = 0,14 bar Escala cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. CFSE Baseado T ensaio de proliferação celular. Na ausência de MSC pulmão e presença de antigen células apresentadoras (APC) + / - ovalbumina (OVA) CD40 de células T efetoras positivos demonstram uma diminuição na intensidade CFSE que indica a proliferação (círculo vermelho). Intensidade de fluorescência CFSE da membrana da célula T diminui estequiometricamente com cada ou seja a divisão celular. em cada divisão. Na presença de pulmão MSC, APC + / - OVA, CD40 de células T efetoras positivos demonstram nenhuma mudança significativa na intensidade CFSE o que indica uma falta de proliferação (círculo vermelho).

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós adaptamos um método inicialmente utilizado para identificar BM células hematopoiéticas para isolar uma população específica de MSC pulmão residente. Devido à reprodutibilidade de isolamento dessas células foram então bem caracterizado como MSC. Sua origem tem sido definido como residente no pulmão do rato adulto (em oposição a BM derivados) e um perfil fenotípico e molecular documentada 2. A capacidade de isolar essa população repetidamente caracterizada permite que o estudo mais aprofundado da importância biológica e papel da MSC pulmão durante homeostase do tecido e da doença. A definição recente da população in vivo tanto em camundongos e humanos tecido pulmonar facilita o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica dirigida ao resgate de células endógenas para facilitar a reparação do pulmão durante a ferimentos e doenças.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Tampão fosfato (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks solução tamponada de sal (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington tipo 2 colagenase </td><td> Bioquímicos Worthington </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Vermelhas do sangue tampão de lise celular </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Corante Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD PharMingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Iodeto de propídio </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% de tripsina / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Médio completo MesenCult </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v solução de coloração Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% </td><td> Microscopia eletrônica de Serviços </td><td> 15710 </td><td> Paraformeldehyde 16% é diluída a 4% com PBS </td
></tr><tr><td> Carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolamento &amp; caracterização da hoechst baixa cd45 negativo mouse células-tronco mesenquimais de pulmão

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tecido residente células-tronco mesenquimais (MSC) são importantes reguladores de reparação tecidual ou regeneração, fibrose, inflamação, angiogênese e formação de tumores. Em conjunto, estes estudos sugerem que a MSC pulmão residentes desempenham um papel durante a homeostase do tecido pulmonar, lesão e reparo durante doenças como a fibrose pulmonar (PF) e hipertensão arterial (HAP). Aqui nós descrevemos uma tecnologia para definir uma população de MSC pulmão residente. A definição desta população no tecido pulmonar vivo usando um conjunto de definir marcadores facilita o isolamento repetido de uma população bem caracterizados com células-tronco por citometria de fluxo e do estudo de um tipo específico de célula e função.

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

As células-tronco mesenquimais (CTM) residentes nos tecidos são reguladores importantes do reparo ou regeneração tecidual, da fibrose, da inflamação, da angiogênese e do tumor...

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento de células-tronco mesenquimais pulmonares de baixa expressão de CD45 negativo do hospedeiro. As células-tronco mesenquimais residentes no tecido, ou CSMs, são importantes reguladoras da reparação ou regeneração tecidual, fibrose, inflamação e angiogênese. Primeiro, os pulmões são dissecados de um camundongo sacrificado.O tecido pulmonar é digerido para obter uma suspensão de células únicas. As células são coradas com corante hoax e CD 45 e separadas por citometria de fluxo para obter MSCs pulmonares CD 45 negativas e com baixa expressão de CD 45 de origem hospedeira. Os MSCs pulmonares são então expandidos em cultura e um ensaio de formação de colônias é realizado para avaliar a capacidade de diferenciação dos MSCs.Estudos adicionais podem então ser realizados para examinar o papel das MSCs durante a homeostase tecidual e doenças. O método que apresentamos aqui pode ser usado para isolar células-tronco mesenquimais pulmonares de camundongo ou humano e pode ser aplicado a esse estudo de doenças pulmonares, como fibrose pulmonar, hipertensão pulmonar e DPOC. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentarão dificuldades devido à variedade de métodos disponíveis para o preparo de tecidos, bem como para a configuração do citômetro de fluxo, controles apropriados e análise.A demonstração visual deste método é essencial, pois é difícil descrever adequadamente a técnica correta para picar e digerir o tecido pulmonar visando à viabilidade ótima das células apenas com palavras. Além disso, a configuração e as análises no instrumento de citometria de fluxo são melhor transmitidas por meio de demonstração. Inicie este protocolo removendo os pulmões que serão utilizados para obter as células-tronco mesenquimais de um camundongo adulto sacrificado.Use uma pequena tesoura afiada para cortar a caixa torácica lateralmente em cada lado do camundongo. Abra a cavidade torácica e, em seguida, remova o diafragma. Insira uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de 20 e meia polegadas no ventrículo cardíaco direito e pressione suavemente o êmbolo para perfundir com três a cinco mililitros de PBS, removendo o sangue dos pulmões.Em seguida, usando tesoura, corte a traqueia e os grandes brônquios e descarte-os. Então, com pinça, segure os pequenos lobos pulmonares brancos e coloque-os em uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com Hank ou HBSS.Em seguida, remova o coração e separe os lobos pulmonares. Repita este processo para todos os camundongos do estudo. Transfira os lobos pulmonares para a tampa da placa.Umedeça o tecido com quantidade suficiente de HBSS apenas para evitar que seque. Em seguida, usando um bisturi descartável, pique os lobos pulmonares para obter medula óssea a ser usada como controle de sustentação para citometria de fluxo. Use um par de tesouras afiadas para cortar no tornozelo e na parte superior do fêmur.Coloque o membro em uma nova placa de Petri. Em seguida, corte o joelho, deixando um segmento linear do fêmur e um segundo segmento contendo a tíbia e a fíbula. Usando pinça, remova o músculo para expor a tíbia, a fíbula e o fêmur.Agora, pegue uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de 26 e meia polegadas e insira a agulha na abertura da medula óssea. Em uma das extremidades da tíbia, segure o osso com a outra extremidade direcionada para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de HBSS e pressione o êmbolo para dispensar o HBSS e lavar a medula óssea para dentro do tubo. Repita este processo com a fíbula e o fêmur.Marque a medula óssea com o corante 3 3 3 4 2 do hospedeiro em uma concentração final de cinco microgramas por mililitro em DMEM com alto teor de glicose suplementado. Em seguida, será gerada uma suspensão de células únicas do tecido pulmonar a partir do tecido isolado. Coloque cada pulmão em um tubo contendo Worthington 0,2% pré-aquecido.Colagenase tipo II preparada em HBSS estéril, em seguida imergir o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius e incubar por 30 minutos. Após a incubação, usar a pipeta de 10 mililitros para triturar a amostra até que o digestivo flua facilmente pela pipeta. Aproximadamente 10 repetições, incubar por mais 15 minutos a 37 graus Celsius para completar a digestão do tecido.Após a conclusão da digestão, dilua a suspensão celular com HBSS e use uma pipeta de cinco mililitros para tentar novamente dispersar quaisquer fragmentos residuais de tecido. Em seguida, para remover os fragmentos de tecido não digeridos, despeje a suspensão através de um filtro celular de 70 micrometros em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione a suspensão pouco a pouco para permitir que a amostra escoe através do filtro celular.Se fragmentos de tecido não digeridos bloquearem completamente o fluxo da suspensão celular, despeje por um novo filtro celular em um novo tubo. Centrifugue a suspensão celular por 10 minutos a 450 RCF.Após a centrifugação, decante o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em tampão de lise de eritrócitos à temperatura ambiente. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione um volume igual de HBSS para inativar o tampão de lise.Despeje a suspensão celular em um filtro de células de 40 micrometros para remover detritos e agregados celulares, coletando o fluxo passante em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, utilizando um hemocitômetro, determine o número de células para as amostras de pulmão e medula óssea. Registre a concentração e o volume total da suspensão celular.Em seguida, pelletize a suspensão de células pulmonares únicas por centrifugação a 450 RCF durante 10 minutos. Para manter as células viáveis, reconstitua simultaneamente as células pulmonares e da medula óssea. Dez elevado a seis células por mililitro em DMEM de alta glicose suplementado e pré-aquecido.Para corar o DNA, adicione o corante HOAXED 3 3 3 4 2 até uma concentração final de cinco microgramas por litro. Em seguida, homogeneíze as células por inversão suave e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por exatamente 90 minutos. Então, centrifugue por 10 minutos a 450 Gs a quatro graus Celsius após a centrifugação.Prossiga com a coloração do tecido pulmonar e da medula óssea com anti-CD45 e iodeto de propídio, em preparação para análise por citometria de fluxo. Após as células terem sido coradas, armazene os tubos no gelo, protegidos da luz, até que a análise por citometria de fluxo seja realizada. Prepare-se para a citometria de fluxo garantindo que os lasers do instrumento estejam alinhados e que ele esteja configurado para separação celular.O instrumento utilizado deve ser equipado com lasers azul de 488 nanômetros, vermelho de 635 nanômetros e UV de 350 a 355 nanômetros, com dois detectores no percurso do laser UV com filtros azul 45/65 e vermelho 675/50. Além disso, o detector UV-vermelho deve ter alta sensibilidade para o sinal vermelho, e o instrumento deve estar equipado com unidade refrigeradora para manter a amostra a 10 graus Celsius. No software do instrumento, configure gráficos de histograma para exibir dispersão para frente linear versus dispersão lateral e um gráfico de discriminação de dupletos apropriado para o instrumento.Um gráfico de histograma de PI utilizando um sinal logarítmico, um gráfico de dispersão de vermelho versus azul utilizando sinais lineares e um gráfico de histograma de CD45 APC utilizando um sinal logarítmico. Quando o instrumento estiver pronto, coloque a amostra de medula óssea corada na porta de carregamento do instrumento. Esta amostra é utilizada como controle de coloração e de configuração do instrumento.Inicie a coleta de eventos e ajuste os sinais lineares de dispersão direta. Para visualizar claramente a população celular, as células devem situar-se aproximadamente no centro inferior do gráfico de dispersão direta, com este no eixo x. Como o corante nuclear PI é permeável à membrana IMP, será excluído das células vivas.Desenhe uma região de análise na população de células mortas positivas para PI no histograma de PI. Instrua o software do instrumento a colorir as células mortas com esta cor vermelha.É útil utilizar a coloração com ventilação de células mortas como guia para identificar a população de hospedeiro G zero G um. A coloração com PI também é excitada pelo laser UV e a maioria das células mortas deve estar fora da escala. No lado direito do gráfico de fluorescência vermelha versus azul falsificada, a população G zero G um da medula óssea deve ser observada como um agrupamento compacto de eventos no gráfico de fluorescência vermelha versus azul falsificada.Ajuste as tensões do detector para posicionar o agrupamento G0G1 no canto superior direito central do gráfico. Uma porção da fase S e todo o G2 do ciclo celular podem estar fora da escala. No canto superior direito do gráfico de cor vermelha versus azul manipulado, a população lateral com baixa intensidade será vista estendendo-se do lado esquerdo do agrupamento G0G1 até o canto inferior esquerdo do gráfico.Agora desenhe um quadrante ao redor do agrupamento celular na dispersão FSC versus SSC. Represente graficamente a população de células únicas identificada no gráfico de duplos e as células viáveis no histograma de PI. Em seguida, configure o gráfico de controle para exibir apenas essas populações selecionadas.Após definir o enquadramento no gráfico do hospedeiro, desenhe uma região ao redor da população lateral. Atribua esta região como um enquadramento ao histograma de CD 45 A PC, juntamente com os enquadramentos de células únicas pela dispersão lateral e de células viáveis. Agora que o sistema está configurado, remova a amostra do porto de carregamento e coloque a amostra de pulmão no porto de carregamento.As configurações do instrumento não precisam ser ajustadas novamente para esta amostra. Comece a coletar eventos no gráfico de vermelho versus azul. O agrupamento G zero G um para a amostra de pulmão geralmente aparece mais alongado na direção do eixo x e assemelha-se ao símbolo til em um teclado.A posição do gradiente de passagem da população lateral deve ser semelhante à definida para a amostra de medula óssea. Pequenos ajustes para cima ou para baixo podem ser necessários para garantir uma boa resolução da população lateral. Mantenha uma diferença de pressão baixa durante a separação, assegurando-se de que a válvula de fluxo da amostra não seja aberta em excesso.Em seguida, para isolar as CMM, coloque uma placa de coleta de 96 poços na câmara de separação e configure os gates de separação no histograma de CD45 A PC para separar as populações positiva e negativa. Por fim, colete as células como uma população mista em um tubo ou células individuais para isolar clones em uma placa de 96 poços. Após a coleta das CMM pulmonares por meio de separação celular, as células são semeadas em placas de 30 milímetros utilizando MEM-A suplementado com 20% de FBS. Inicialmente, as células separadas aparecem pequenas, arredondadas e brilhantes após aproximadamente duas a três semanas.Colônias com fenótipo mesenquimal tornam-se evidentes e a proliferação é mais aparente para cada preparação celular. Avalie a capacidade dos MSC pulmonares de se diferenciarem em linhagens mesenquimais tradicionais de osteoblastos, adipócitos e condrócitos, bem como sua expressão de marcadores mesenquimais aceitos na superfície celular. Realize análise de bandagem citogenética para confirmar a ausência de anormalidades cromossômicas grosseiras.Após o isolamento por citometria de fluxo e a geração de clones de células individuais, realiza-se um ensaio de formação de colônias para caracterizar as células MSC e suas capacidades de diferenciação. Inicie com células diluídas a três vezes 10 à quarta células por mililitro. Em meio cul incompleto em placas de 100 milímetros, realize diluições seriadas de seis vezes 10 à quarta, três vezes 10 à quarta, 1,5 vezes 10 à quarta e 0,75 vezes 10 à quarta células por placa em 10 mililitros de meio, em triplicata.Em seguida, coloque as placas no incubador após 10 dias de cultivo, desprenda o meio e lave as células com PBS. Em seguida, fixe-as adicionando metanol a 100% durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, desprenda o metanol.Em seguida, para detectar a formação de colônias, adicione gza a 0,4% peso por volume, diluído na proporção de 1 para 20 com água ionizada, e incube por 10 a 15 minutos. Em seguida, descarte o corante e lave com água ionizada. Deixe as amostras secarem ao ar e quantifique o número de colônias contendo mais de 25 células por colônia utilizando um microscópio invertido ou visualização.As colônias são grandes e compostas por algumas centenas de células, como mostrado aqui, e exibem um fenótipo mesenquimal. As CMM foram isoladas conforme mostrado neste vídeo e semeadas em placas de 96 poços para simular o crescimento. Células apresentadoras de antígeno marcadas com CFSE e arrestadas foram então adicionadas às CMM pulmonares.A proliferação de MSCs isoladas foi então medida pela diminuição da intensidade média de fluorescência de CFSE em comparação com o fundo, que consistia em linfócitos T marcados com CFSE isoladamente, conforme mostrado nesta figura, na ausência de SC pulmonar e na presença de células apresentadoras de antígeno, A PC com e sem albumina O, linfócitos T efetores CD40 positivos demonstram uma diminuição na intensidade de CFSE, o que indica proliferação, circulada em vermelho. A intensidade de fluorescência de CFSE na membrana dos linfócitos T diminui de forma equimétrica a cada divisão celular, ou seja, pela metade a cada divisão, na presença de M-S-C-A-P-C pulmonar com e sem OVA, linfócitos T efetores CD40 positivos não demonstram mudança significativa na intensidade de CFSE, o que indica ausência de proliferação após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia de células-tronco pulmonares explorarem o papel das células-tronco mesenquimais em doenças pulmonares, como hipertensão arterial pulmonar e fibrose pulmonar.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco horas, seguindo este procedimento. Outros métodos, como ensaios de diferenciação, podem ser realizados para responder a questões adicionais, incluindo se as células-tronco mesenquimais pulmonares putativas exibem diferenciação multilinial apropriada, com potencial para os tecidos ósseo, adiposo e cartilaginoso.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Descreve-se aqui métodos para a dissecação de tecidos fetais e maternas de placenta humana, seguido por isolamento e expansão de células estaminais mesenquimais / estroma (MSC) a partir desses tecidos.

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Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

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Isolamento & Caracterização da Hoechst^Baixa CD45^Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

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