Isolamento & Caracterização da Hoechst ^Baixa CD45 ^Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento de células-tronco mesenquimais pulmonares baixas CD45 negativas do hospedeiro. As células-tronco mesenquimais ressonantes teciduais ou CTMs são importantes reguladores do reparo ou regeneração tecidual, fibrose, inflamação e angiogênese. Primeiro, os pulmões são dissecados de um rato sacrificado.

O tecido pulmonar é digerido para obter uma única suspensão celular. As células são coradas com matriz falsa e CD 45 e classificadas por citometria de fluxo para obter MSCs pulmonares negativas para baixo CD 45 do hospedeiro. As MSCs pulmonares são então expandidas em cultura e um ensaio de formação de colônias é realizado para avaliar as capacidades de diferenciação das MSC.

Outros estudos podem ser realizados para examinar o papel das MSCs durante a homeostase e a doença do tecido. O método que mostramos aqui pode ser usado para isolar células-tronco mesenquimais de pulmão de camundongo ou humano e pode ser aplicado a este estudo de doenças pulmonares, como fibrose pulmonar, hipertensão pulmonar e DPOC. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à variedade de métodos disponíveis para a preparação do tecido, bem como aos controles e análises apropriados da configuração do citômetro de fluxo.

A demonstração visual desse método é crítica, pois é difícil descrever a técnica adequada para picar e digerir o tecido pulmonar para a viabilidade ideal das células apenas com palavras. Além disso, a configuração e as análises do instrumento de citometria de fluxo são melhor comunicadas por meio de demonstração. Comece este protocolo removendo os pulmões que serão usados para obter células-tronco mesenquimais de um camundongo adulto sacrificado.

Use uma pequena tesoura afiada para cortar a caixa torácica lateralmente em cada lado do mouse. Abra a cavidade torácica e remova o diafragma. Insira uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 20 e meio no ventrículo cardíaco direito e pressione suavemente o êmbolo para perfundi-lo com três a cinco mililitros de PBS, liberando o sangue dos pulmões.

Em seguida, usando uma tesoura, corte a traqueia e o bronch grande e descarte-os. Em seguida, usando fórceps. Pegue os pequenos lobos pulmonares brancos e coloque-os em uma placa de Petri cheia de solução salina tamponada de hank ou HBSS.

Em seguida, remova o coração e separe os lobos pulmonares. Repita esse processo para todos os camundongos do estudo. Transfira os lóbulos pulmonares para a tampa do prato.

Umedeça o tecido com HBSS apenas o suficiente para evitar que sequem. Em seguida, usando um bisturi descartável, pique os lobos pulmonares para obter a medula óssea para usar o controle de sustentação para citometria de fluxo. Use uma tesoura afiada para cortar o tornozelo e a parte superior do fêmur.

Coloque o membro em uma nova placa de Petri. Em seguida, corte o joelho, deixando um pedaço linear de fêmur e um segundo pedaço contendo a tíbia e a fíbula. Usando uma pinça, puxe o músculo para revelar a tíbia, a fíbula e o fêmur.

Agora pegue uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de calibre 26 e meio e insira a agulha na abertura da medula óssea. Em uma extremidade da tíbia, segure o osso com a outra extremidade direcionada para um tubo cônico de 50 mililitros cheio de 15 mililitros de HBSS e pressione o êmbolo para dispensar HBSS e liberar a medula óssea no tubo. Repita esse processo com uma fíbula e fêmur.

Manchar a medula óssea com o hospedeiro 3 3 3 4 2 morrer a uma concentração final de cinco microgramas por mililitro em DMEM suplementado com alto teor de glicose. Em seguida, uma única suspensão celular de tecido pulmonar será gerada a partir do tecido isolado. Coloque cada pulmão em um tubo contendo pré-aquecimento.0,2%Worthington.

Colagenase tipo dois Preparado em HBSS estéril, depois mergulhe o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius e incube por 30 minutos. Após a incubação, use a pipeta de 10 mililitros para tritar a amostra até que o digestor flua facilmente através da pipeta. Aproximadamente 10 repetições incubam por mais 15 minutos, a 37 graus Celsius para completar a digestão do tecido.

Quando a digestão estiver completa, diluir a suspensão celular com HBSS e usar uma pipeta de cinco mililitros para tri novamente para dispersar quaisquer fragmentos de tecido residual. Em seguida, para remover fragmentos de tecido não digeridos, despeje a suspensão através de um filtro de células micromolares de 70 em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione a suspensão um pouco de cada vez para permitir que a amostra flua através do filtro da célula.

Se fragmentos de tecido não digeridos bloquearem completamente o fluxo da suspensão celular. Despeje através de um novo filtro de células em um novo tubo. Chupar a suspensão celular por 10 minutos a 450 RCF.

Após a centrifugação, decanta o sobrenadante e ressuspende suavemente o sedimento celular à temperatura ambiente. Tampão de lise de glóbulos vermelhos, incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione um volume igual de HBSS para desativar o buffer de lise.

Despeje a suspensão de células em um filtro de células de 40 micromolares para remover detritos e agregados de células, coletando o fluxo em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, usando um hemocitômetro, determine o número de células para as amostras de pulmão e medula óssea. Registar a concentração e o volume total da suspensão celular.

Em seguida, pulverize a suspensão de células pulmonares individuais por centrifugação a 450 RCF por 10 minutos. Para sustentar as células, ressuspenda as células do pulmão e da medula óssea de uma só vez. 10 para as seis células por mililitro em DMEM de glicose alta suplementada pré-quente.

Para corar o DNA, adicione o corante HOAXED 3 3 3 4 2 a uma concentração final de cinco microgramas por litro. Em seguida, misture as células por inversão suave e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por exatamente 90 minutos. Em seguida, centrifugue por 10 minutos a 450 Gs a quatro graus Celsius após a centrifugação.

Proceder à coloração do tecido pulmonar e da medula óssea com anti-CD 45 e iodeto de propídio em preparação para análise por citometria de fluxo. Uma vez que as células tenham sido coradas, armazene os tubos em gelo protegido da luz até que a análise por citometria de fluxo seja realizada. Prepare-se para a citometria de fluxo, certificando-se de que os lasers dos instrumentos estejam alinhados e configurados para classificação de células.

O instrumento utilizado deve ser equipado com lasers azuis de 488 nanômetros, vermelhos de 635 nanômetros e UV de 350 a 355 nanômetros, com dois detectores no caminho do laser UV, com filtros azuis 45 sobre 65 e vermelhos 6, 75 sobre 50. Além disso, o detector vermelho UV deve ter alta sensibilidade para o sinal vermelho e o instrumento deve ser equipado com uma unidade de resfriamento para manter a amostra a 10 graus Celsius. No software do instrumento, configure gráficos de histograma para exibir dispersão linear direta versus lateral, um gráfico de discriminação dupla apropriado para o instrumento.

Um gráfico de histograma de PI usando um sinal de log, uma costa vermelha versus azul usando sinais lineares e um gráfico de histograma de CD 45 A PC usando um sinal de log. Quando o instrumento estiver pronto, coloque a amostra de medula óssea corada na porta de carregamento do instrumento. Esta amostra é usada como um controle de coloração e configuração do instrumento.

Comece a coletar eventos e ajuste os sinais lineares de dispersão para a frente. Para visualizar claramente a população de células, as células devem residir aproximadamente no centro inferior da dispersão direta do gráfico como o eixo x. Como a coloração nuclear PI é permeante à membrana IMP, ela será excluída das células vivas.

Desenhe uma região de marcha nas células mortas positivas para PI no histograma PI. Instrua o software do instrumento a colorir as células mortas. Neste portão vermelho.

É útil usar as células mortas ventiladas coloridas como um navegador para identificar a população hospedeira G zero G um. A coloração PI também é excitada pelo laser UV e a maioria das células mortas deve estar fora da escala. No lado direito do gráfico de fluorescência falsa vermelho versus azul, a população G zero G um da medula óssea deve ser vista como um conjunto apertado de eventos no gráfico simulado vermelho versus azul.

Ajuste as tensões do detector para colocar o cluster G zero G um no canto superior direito do centro do gráfico. Uma parte da fase S e todo o G dois do ciclo celular podem estar fora de escala. No canto superior direito do gráfico simulado vermelho versus azul, os hosts da população lateral serão vistos seguindo do lado esquerdo do cluster G zero G um até o canto inferior esquerdo do gráfico.

Agora desenhe uma porta ao redor do aglomerado de células no FSC versus SSC. Plote a população singlete identificada no gráfico duplo e as células vivas no histograma PI. Em seguida, atribua o gráfico fraudulento para exibir apenas essas populações fechadas.

Depois de fechar o gráfico hospedeiro, desenhe uma região ao redor da população lateral. Atribua essa região como uma porta para o histograma de PC CD 45 A junto com as portas de dispersão de luz, singleto e célula ativa. Agora que o sistema está configurado, remova a amostra da porta de carregamento e coloque-a na porta de carregamento.

As configurações do instrumento não devem precisar ser ajustadas novamente para este exemplo. Comece a coletar eventos no gráfico de farsa vermelho versus azul. O cluster G zero G um para a amostra de pulmão geralmente aparece mais alongado na direção do eixo x e se assemelha ao símbolo tilda em um teclado.

O hoax de marcha da população lateral baixo deve estar em uma posição semelhante à definida para a amostra de medula óssea. Esses pequenos ajustes para cima ou para baixo podem ser necessários para garantir uma resolução rigorosa da população lateral. Mantenha um diferencial de baixa pressão durante a classificação, garantindo que a válvula de fluxo de amostra não esteja muito aberta.

Em seguida, isolar o MSC, coloque uma placa de coleta de 96 poços na câmara de classificação e configure as portas de classificação no histograma CD 45 A PC para separar a população positiva e negativa. Finalmente, colete as células como uma população mista em um tubo ou células únicas para isolar clones em uma placa de 96 poços após a coleta do MSC pulmonar por classificação de células, as células são plaqueadas em placas de 30 milímetros usando um MEM suplementado com 20% FBS. Em primeiro lugar, as células classificadas parecem pequenas, redondas e brilhantes após aproximadamente duas a três semanas.

As colônias com o fenótipo mesenquimal tornam-se evidentes e a proliferação é mais óbvia para cada preparação celular. Avaliar a capacidade das MSC pulmonares de se diferenciar em linhagens mesenquimais tradicionais de osteoblastos, adipócito e condrócitos e sua expressão na superfície celular de marcadores mesenquimais aceitos. Realize análises citogenéticas para confirmar a ausência de anormalidades cromossômicas macroscópicas.

Após o isolamento por citometria de fluxo e geração de clones de células únicas, um ensaio de formação de colônias é realizado para caracterizar as células MSC e as capacidades de diferenciação. Comece com células diluídas para três vezes 10 das quatro células por mililitro. Meio cul incompleto em placas de 100 milímetros, realizar a diluição de cereais duas, seis vezes 10 dos quatro, três vezes 10 dos quatro, 1,5 vezes 10 para o quatro e 0,75 vezes 10 para as quatro células por prato em 10 mililitros de mídia em triplicata.

Em seguida, coloque as placas na incubadora após 10 dias de cultura, despeje o meio e enxágue as células com PBS. Em seguida, corrija-os adicionando 100% de metanol por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, despeje o metanol.

Em seguida, para detectar a formação de colônias, adicione 0,4% de peso por volume diluído de um a 20 com a incubação de água ionizada por 10 a 15 minutos. Em seguida, retire a mancha e enxágue com água ionizada. Deixe as amostras secarem ao ar e quantifique o número de colônias contendo mais de 25 células por colônia usando um microscópio invertido ou visualização.

As colônias são grandes e compostas por algumas centenas de células, como mostrado aqui, e exibem um fenótipo mesenquimal. As CTM foram isoladas como mostrado neste vídeo e plaqueadas em 96 placas de poços de crescimento simulado. As células apresentadoras de antígenos marcadas com CFSE presas foram então adicionadas às MSCs pulmonares.

A proliferação de MSCs isoladas foi então medida como a diminuição na intensidade média de fluorescência do CFSE em comparação com o fundo, que foi apenas as células T marcadas com CFSE, conforme mostrado nesta figura, na ausência de SC pulmonar e presença de células apresentadoras de antígenos, A PC mais menos O albumina CD 40 células T efetivas positivas demonstram uma diminuição na intensidade do CFSE, que indica proliferação circulada em vermelho. A intensidade de fluorescência CFSE da membrana das células T diminui econometricamente com cada divisão celular IE metade com cada divisão na presença de pulmão M-S-C-A-P-C mais menos OVA CD 40 positivo As células T afetadas não demonstram alteração significativa na intensidade do CFSE, o que indica uma falta de proliferação Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de células-tronco pulmonares explorarem o papel das células-tronco mesenquimais em doenças pulmonares, como hipertensão arterial pulmonar e fibrose pulmonar.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em aproximadamente cinco horas Após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de diferenciação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, incluindo se as células-tronco mesenquimais pulmonares putativas exibem ou não diferenciação de múltiplas linhagens apropriada, potencial para gordura óssea e cartilagem.