Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato
24 de setembro de 2010
Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.
O objetivo geral deste procedimento é isolar o citoplasma axonal puro ou ectoplasma do nervo periférico. Isso é feito dissecando primeiro o nervo ciático. A segunda etapa do procedimento é remover o tecido conjuntivo do nervo e separar os les.
A terceira etapa do procedimento é a incubação de segmentos curtos de nervos em meio hipotônico. A etapa final do procedimento é a incubação em centrifugação com solução isotônica e opsm milian. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um alto grau de enriquecimento para componentes axonais pela análise de western blot.
Oi, meu nome é eu, Elle E eu posso Rosenbaum. Somos do laboratório do Professor Mike F, Departamento de Trabalho do Instituto de Ciências com base em Química Biológica. Hoje vamos representar uma nova técnica de Oxi Opat Mesylation.
A principal vantagem desta técnica acima dos métodos existentes, como o OIS de compressão manual do nervo periférico. Ou seja, esse procedimento reduz a contaminação do soro e glos atinge o conteúdo axonal. Usamos esta nova técnica para metilação de OP PLAs para explorar a retrosinalização baseada em D após lesão do nervo ciático.
Então vamos começar. Coloque um dos dois ratos wistar sacrificados de oito a 10 semanas de idade de lado em um tapete de dissecação para uma abordagem direta da parte distal do nervo ciático. Depile a pele no meio da coxa e troque bem por 70% de etanol.
Use uma tesoura para cortar a pele da coxa. Corte cuidadosamente a gordura e o tecido conjuntivo entre o bíceps femoral e os músculos glúteos superficiais. Use uma pinça para levantar a região exposta do nervo ciático e removê-la.
A seção removida terá aproximadamente 1,5 centímetros de comprimento. Transfira o nervo para 500 microlitros de PBS 2X gelado com inibidores de protease em um tubo de microcentrífuga. Mantenha o tubo no gelo.
Repita o procedimento de dissecção do outro lado do rato e de ambos os lados de um segundo rato. Raspe o fundo de uma placa de Petri com uma pipeta de paster e encha-a com dois mililitros de temperatura ambiente. Aponte dois X PB s com inibidores de protease.
Transfira um único nervo para o prato sob o microscópio de dissecação. Use uma pinça fina para remover o epi nearium do nervo, puxando-o e descartando-o, deixando os fáceis no prato. Separe cuidadosamente as instalações umas das outras e do fundo do prato.
Fales individuais ficarão turvos e flutuarão na superfície da solução. Transfira imediatamente as falas separadas para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microlitros de 0,2 X PB s com inibidores de protease. Mantenha os sles no gelo.
Separe e colete os sles do ciático restante no tubo com a prática. Remoção do epineuro e separação dos sles. Não deve levar mais de 10 minutos por nervo.
Remova o tubo que contém o SLES separado do gelo. Incube por duas horas em temperatura ambiente para liberar mielina e estruturas não axonais de piolhos. Lave os sles para cada lavagem.
Use uma pinça para levantar suavemente as estumes e transferi-las para um tubo novo contendo um mililitro de 2X PB s com inibidores de protease. Agite o tubo em um balancim por cinco minutos. Lave o SLES desta forma três vezes após a lavagem.
Transfira o SLES para um novo tubo einor vazio para remover o excesso de fluido e, em seguida, transfira para um tubo contendo 300 microlitros de um XPBS com inibidores de proteus incubar em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Para eluir o opsm, concentrações mais altas de sal interferem em outros procedimentos proteômicos. Centrifugar o fascículo a 10 000 queijo durante 10 minutos a quatro graus Celsius para sedimentar os tecidos e os restos celulares pipetados do sobrenadante para um tubo einor limpo.
O sobrenadante obteve. Deve ser claro. Use um espectrofotômetro para medir a concentração de proteínas.
Deve obter-se um rendimento de 200 a 250 microgramas de proteína. Armazene a preparação de plasma op em alíquotas a 80 graus Celsius negativos por até seis meses. Evite ciclos de descongelamento e congelamento.
Aqui está um bloco ocidental comparando o plasma op isolado pelo método de compressão manual com amostras de opsm isoladas conforme mostrado neste protocolo. Observe os níveis reduzidos de albumina e GFAP representando contaminações de proteínas do sangue e células gliais, respectivamente. Em contraste, a tubulina axonal beta três é enriquecida nesta preparação, indicando um alto nível de proteínas axonais.
Depois de assistir a todo este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar o nervo sático e como separar o Paco corretamente. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar o axoplasma do nervo ciático de ratos adultos. O método envolve a dissecção de fascículos nervosos e incubação em um meio hipotônico para liberar efetivamente a mielina e lisar estruturas não axonais, levando à extração de material enriquecido em axônios.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa Axonal
Fundo
- O isolamento do citoplasma axonal é crucial para estudar a função neuronal.
- O nervo ciático serve como um modelo para estudos de nervos periféricos.
- A compreensão dos componentes axonais pode auxiliar na pesquisa neurológica.
- Métodos anteriores podem não produzir material axonal puro.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para isolamento de axoplasma.
- Melhorar a pureza do citoplasma axonal para análises adicionais.
- Facilitar o estudo de componentes axonais usando técnicas bioquímicas.
Métodos Utilizados
- Dissecção do nervo ciático para acessar fascículos nervosos.
- Remoção do tecido conjuntivo ao redor do nervo.
- Incubação de segmentos nervosos em um meio hipotônico.
- Centrifugação subsequente e incubação em solução isotônica.
Principais Resultados
- O protocolo isola com sucesso o citoplasma axonal.
- A análise de Western blot confirma o alto enriquecimento de componentes axonais.
- Os resultados demonstram a eficácia do método.
- Aplicações potenciais no estudo da biologia axonal são destacadas.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem robusta para o isolamento de axoplasma.
- Pode ser utilizado em vários estudos relacionados à função neuronal.
- Os resultados contribuem para a compreensão da estrutura e função axonal.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
