Name: Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprenda a isolar axoplasma puro do nervo ciático de rato usando meio hipotônico e centrifugação. Este método reduz contaminação glial e sérica, enriquecendo componentes axonais para análises bioquímicas.

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Este protocolo permite o isolamento axoplasma com minimização de contaminação dos tecidos gliais e vasculares. O método rende aproximadamente 70-100 mg de proteína total por um axoplasma 10/08 ratos Wistar semanas de idade. 1. Dissecar nervo ciático <ol><li> Euthanize dois ratos por inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical. Confirmar a morte pela palpação por falta de batimentos cardíacos antes do início dissecção. </li><li> Swab a área de dissecção com etanol 70%. </li><li> Cortar a pele, músculos separar e isolar do nervo isquiático com tesoura e pinça com cuidado, sem danificar os vasos sanguíneos. Dissecar ambos os nervos ciático (cerca de 1,5 cm cada) de cada animal e recolher todos os quatro nervos em um eppendorf com 500 mL PBS 0,2 X + inibidores, conservados no gelo. </li><li> Transferir os segmentos nervosos para pratos de plástico contendo pelo menos 2 mL de PBS + 0,2 X inibidores da protease. </li><li> Remover o epineuro dos nervos usando uma pinça fina no âmbito binocular. Separar os fascículos com muito cuidado até que se tornem nublado e começar a flutuar na superfície da solução. Esta etapa deve ser praticado até que possa ser realizada com rapidez e precisão (não tendo mais de 10 min por nervo). </li></ol> 2. Lavar incubação, e eluição <ol><li> Transferência de fascículos separados para um novo tubo Eppendorf com 500 mL de PBS contendo inibidores da protease de 0,2 para a incubação por 2 horas em temperatura ambiente. </li><li> Lavar pelo menos 3 vezes com 1 mL do mesmo tampão, transferindo os fascículos a partir de tubo eppendorf para tubo eppendorf e agitação por 5 min após a transferência. </li><li> Para remover o excesso de líquido colocar os fascículos em um tubo eppendorf novo vazio e depois transferir os fascículos para um tubo eppendorf novo com 300 mL de PBS 1X contendo inibidor da protease para a incubação por 20-30 min em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar 10 min a 10.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Leve o sobrenadante e concentração de proteína medida. Esta é a sua preparação axoplasma. </li></ol> 3. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ocidental axoplasma blot comparando isolados pelo método de aperto manual com amostras axoplasma isolado como mostrado neste protocolo. Observe a redução dos níveis de albumina e GFAP, representando proteína do sangue e contaminações de células gliais, respectivamente. Em contraste, axonal tubulina b3 é enriquecida nesta preparação, o que indica um alto nível de proteínas axonal.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Análises bioquímicas e proteômica confirmaram que este procedimento reduz a contaminação de células gliais soro e 3 em relação aos métodos descritos anteriormente para o isolamento por axoplasma espremer mecânica 1. Nós temos usado esse protocolo de isolamento axoplasma para explorar dineína baseado sinalização retrógrada após a lesão do nervo ciático 2, e esperar que ela tenha utilidade na exploração de muitos outros processos no nervo periférico de adultos, incluindo axônio glia intera...

<ul><li> Ratos Wistar (80-10 semanas) </li><li> PBS 0,2 X e PBS 1X soluções contendo inibidores da protease (Roshe) 2 comprimidos por 50 ml </li><li> Eppendorfs por 1,5 ml </li><li> Pratos de plástico esterilizado 35 milímetros </li><li> Ferramentas de dissecação, incluindo: uma tesoura e uma pinça fina </li><li> Luz binocular e tabela </li></ul> Anticorpos Clone de rato anti-GFAP GA-5 foi da Sigma (G6171). Coelho anti-albumina foi de Cedarlane (CLAG5140). Β3 rato anti-tubulina e coelho anti-Gerk eram da Sigma (T2200 e M5670, respectivamente).

isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolamento do citoplasma axonal puro (axoplasma) de nervo periférico é fundamental para estudos bioquímicos de muitos processos biológicos. Neste artigo, vamos demonstrar e descrever um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base nas seguintes etapas: (1) dissecção dos fascículos do nervo e separação do tecido conjuntivo, (2) de incubação de pequenos segmentos de fascículos nervosos em meio hipotônico a liberação de mielina e lise não-axonal estruturas, e (3) extração do material axônio enriquecido restantes. Caracterização proteômica e bioquímica desta preparação confirmou um alto grau de enriquecimento para componentes axonal.

Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

O isolamento de citoplasma axonal puro (axoplasma) de nervos periféricos é crucial para estudos bioquímicos de diversos processos biológicos. Neste artigo, nós...

O objetivo geral deste procedimento é isolar citoplasma axonal puro ou ectoplasma do nervo periférico. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do nervo ciático. O segundo passo do procedimento consiste em remover o tecido conjuntivo do nervo e separar os fascículos.O terceiro passo do procedimento é a incubação de segmentos curtos de filetes nervosos em meio hipotônico. O passo final do procedimento é a centrifugação em solução isotônica e opsm milian. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram um alto grau de enriquecimento para componentes axonais por meio de análise por western blot.Olá, meu nome é I, Elle And I may Rosenbaum. Somos do laboratório do Professor Mike F Labor, Departamento de Química Biológica, Instituto de Ciência. Hoje vamos apresentar uma nova técnica de metilação Oxi Opat.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a OIS por esmagamento manual de nervos periféricos, é que este procedimento reduz a contaminação por soro e glóbulos e alcança o conteúdo axonal. Utilizamos esta nova técnica para op metilação de PLAs a fim de explorar a sinalização retrógrada mediada por D após lesão do nervo ciático.Então va

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Este vídeo descreve o isolamento e a cultura de células de Schwann das raízes espinhais de camundongos. As células isoladas são então cultivadas em meios específicos. As células de Schwann são isoladas por digestão diferencial e aderência. Eles são posteriormente transferidos para lamínulas revestidas com matriz extracelular para fixação e proliferação.

Isolamento de células de Schwann de raízes espinhais de camundongos

Este vídeo demonstra um método para isolar células de Schwann das fibras do nervo ciático de camundongos.

Separação magnética de células de Schwann de nervos ciáticos de camundongos

Este vídeo demonstra uma gravação de fibra única da condução nervosa da fibra C em ratos. Um rato anestesiado é incisado para expor o nervo ciático, que fornece suprimento sensorial e motor aos membros inferiores. As fibras C individuais são então expostas. A estimulação elétrica é fornecida usando eletrodos de estímulo implantados no pé e uma resposta é registrada a partir de uma única fibra nervosa.

Registro in vivo de fibras C do nervo ciático em ratos

Aqui, apresentamos uma técnica in vivo para transferência de genes para células de Schwann (SCs) no nervo ciático de roedores. Esta técnica simples é útil para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos no desenvolvimento e manutenção de SCs mielinizantes.

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

Aqui, apresentamos um protocolo para extrusão hidráulica da medula espinhal, bem como identificação e isolamento de gânglios da raiz dorsal (DRGs) específicos no mesmo roedor. Comparado aos métodos padrão de isolamento da medula espinhal, esse método é significativamente mais rápido e reduz o risco de danos aos tecidos.

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Este método permite o registro da força de contrações de contração e tetanic e potenciais de ação em três tipos de unidades motoras no músculo gastrocnemius medial de rato. O isolamento funcional de uma única unidade motora é induzido por estimulação elétrica do axônio.

Isolamento Funcional de Unidades Motoras Únicas do Músculo Gastrocnemius Medial de Rato

Este protocolo descreve a preparação de tecido nervoso ciático inteiro de rato para estimulação eletrofisiológica ex vivo e registro em um banho salino ambientalmente regulado, com dois compartimentos e perfumado.

Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Aprenda a isolar axoplasma puro do nervo ciático de rato usando meio hipotônico e centrifugação. Este método reduz contaminação glial e sérica, enriquecendo componentes axonais para análises bioquímicas.

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

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