Separação magnética de células de Schwann de nervos ciáticos de camundongos

Pegue uma suspensão de células e detritos de fibras do nervo ciático de camundongo digeridas enzimaticamente.

Passe por uma peneira, removendo os detritos.

Centrifugar o filtrado e remover o sobrenadante.

Ressuspenda as células em meio contendo soro e semeie-as em uma placa de cultura revestida com proteína de adesão.

Incube para adesão celular. Substitua a mídia pela mídia de célula de Schwann. Incubar para formação de monocamada de células de Schwann.

Remova a mídia e lave com tampão. Incube com tripsina para separar as células.

Adicione meios contendo soro para interromper a atividade enzimática.

Recolha as células e centrifugue. Descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as células em tampão e adicione microesferas magnéticas revestidas com anticorpos.

Incubar para ligar anticorpos a glicoproteínas de fibroblastos.

Centrifugue e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em tampão e carregue-as em uma coluna de separação magnética contendo esferas ferromagnéticas colocadas no campo magnético do separador magnético.

O campo magnético retém os fibroblastos ligados às microesferas, permitindo que as células de Schwann sejam coletadas no fluxo.

Transferir os nervos digeridos para um tubo de 50 mililitros para centrifugar a 188 g durante 10 minutos a 4 graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 10 mililitros de DMEM contendo 10% de FCS e 50 microgramas por mililitro de gentamicina.

Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 100 micrômetros. Depois de centrifugar a 188 g durante 10 minutos a 4 graus Celsius, ressuspender o pellet com 4 mililitros de DMEM contendo FCS e gentamicina. Adicione 2 mililitros da suspensão celular a cada uma das duas placas de cultura de tecidos de 60 milímetros revestidas com poli-L-lisina e laminina. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, deixando as placas intocadas por 2 dias na incubadora.

Centrifugue a suspensão de células de Schwann a 188 g por 10 minutos a 4 graus Celsius e ressuspenda o pellet de células em 90 microlitros de tampão de separação de células magnéticas por 1 x 10⁷ células. Em seguida, adicione 10 microlitros de microesferas de Thy-1 por 1 x 10⁷ células. Incube a solução ressuspensa por 15 minutos no escuro a 8 graus Celsius.

Em seguida, adicione 2 mililitros do tampão de separação de células magnéticas à suspensão da célula. Depois de centrifugar a 300 g por 10 minutos a 4 graus Celsius, ressuspender o pellet em 500 microlitros de tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células e umedeça a coluna com 1 mililitro do tampão de separação de células magnéticas. Em seguida, aplique as células a ele para coletar o fluxo.