Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

Este protocolo permite a observação de muitos fenômenos neurofisiológicos que não são bem compreendidos, como a transferência do bloqueio nervoso após a alta frequência/alta injeção de corrente de amplitude, evitando interferências de outros processos em um corpo vivo. Essa técnica produz resultados altamente repetitivos e robustos e é mais prática do que a eletrofisiologia in vivo, pois variáveis complexas como a profundidade da anestesia não têm que ser controladas e, portanto, não podem influenciar as medições. Após um procedimento de eutanásia sob anestésico, coloque um rato fêmea na mesa de dissecção, segure firmemente o tornozelo entre o polegar, o dedo indicador e o dedo médio, e corte o tendão calcâneo usando uma tesoura sem cortes de 12 centímetros.

Usando fórceps finos e tesouras, faça incisões cuidadosas através das camadas musculares perto do meio da parte de trás da perna até que o nervo ciático seja exposto. Uma vez que o nervo seja visível, hidrate a cavidade usando tampão Krebs-Henseleit modificado no gelo, ou MKHB, para evitar que o nervo seque. Usando hemostatas, puxe os retalhos da pele de cada lado e mantenha a incisão aberta para dissecção mais fina.

A partir do local de incisão do tendão calcâneo, usando uma tesoura fina, interrompa o músculo do lado medial da perna para liberar o nervo. Continue mantendo os níveis de umidade na área com MKHB gelado. À medida que o nervo é exposto enquanto se move para cima da perna, dissecar o tecido muscular sobreposto.

Liberte o nervo mais próximo da coluna vertebral dos tecidos conjuntivos até atingir a fissura espinhal, momento em que há uma torção no nervo. Não limpe o nervo ainda, pois a velocidade é essencial nesta fase. Para facilitar a dissecção, usando fórceps, puxe suavemente a extremidade do nervo perto do tornozelo.

Em seguida, usando uma tesoura fina, corte o nervo perto da coluna. Coloque o nervo dissecado em um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio de MKHB e coloque o tubo de volta no gelo até o início do procedimento de limpeza. Encha a placa de Petri revestida no meio do caminho com MKHB oxigenado resfriado, em seguida, coloque um nervo ciático dissecado na placa e fixe ambas as extremidades do nervo para o prato de tal forma que o nervo é reto sem torções, torção ou torções.

Usando suturas de seda 6-0 ou rosca fina, amarre um nó duplo em cada extremidade do nervo para evitar o vazamento de citoso no tampão. Coloque os nós ao lado dos pinos de insetos ao lado mais perto do centro do nervo para evitar vazamentos do tecido nervoso no tampão. Sob um microscópio, usando tesouras de mola angular de dois milímetros e fórceps finos, remova gordura, vasos sanguíneos e tecido muscular do nervo.

Podar quaisquer ramos nervosos que não serão usados na estimulação e gravação. Após cada cinco minutos de limpeza, substitua o tampão por MKHB fresco, refrigerado e oxigenado. Após a limpeza, coloque o nervo de volta no tubo de transporte cheio de tampão e descanse o tubo no gelo.

Prepare um banho de nervo de câmara dupla. Usando chefes de laboratório padrão e pinças, coloque o banho de nervo abaixo do nível da garrafa de dois litros colocada no agitador de aquecimento. Conecte o dreno do banho à entrada da bomba peristáltica.

Conecte a saída da bomba peristáltica a um tubo que leva de volta ao frasco tampão. Conecte a entrada do banho a um tubo com uma válvula de fluxo ajustável e coloque o tubo dentro da garrafa. Use uma válvula de três vias com uma seringa conectada à tomada do meio para ajudar a preparar o tubo como um sifão para entrada de buffer assistido pela gravidade.

Prime o sifão desenhando a seringa até que o buffer flua para dentro dele. Configure a válvula de tal forma que a taxa de fluxo do buffer no banho seja de cinco a seis milímetros por minuto. A vazão pode ser aumentada inicialmente para encher o banho.

Uma vez que o nível do tampão do banho tenha atingido o ralo, coloque os nervos no banho. Usando um pino de inseto, fixe a extremidade do nervo no canto da câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps finos angulares de 45 graus e beliscando o nervo apenas nas extremidades, enfie cuidadosamente o nervo para ser estimulado através do orifício na divisória entre as duas câmaras de banho.

Usando um pino de inseto, proteja a outra extremidade do nervo na câmara de óleo do banho, garantindo que o nervo esteja reto sem ser esticado e livre de torções e torções. Usando graxa de silicone, faça uma vedação para evitar o vazamento de tampão da câmara tampão na câmara de óleo Encha a câmara de óleo com silicone ou óleo mineral. Coloque os ganchos de eletrodo de gravação de cloreto de prata/prata na câmara de banho de óleo e fixe-os usando cabeças de chefe e pinças.

Em seguida, coloque a porção do nervo no banho de óleo sobre os ganchos sem puxar o nervo esticado. Ajuste ou repare a vedação de graxa de silicone se algum vazamento for observado após mover o nervo. Conecte o eletrodo de cloreto de prata/prata de referência ao solo do amplificador e coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de tampão, fixando-o usando um gripper de laboratório.

Depois de preparar um eletrodo de punho nervoso limpo para estimulação, coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps ou pinças finas com pontas cegas ou angulares, abra o eletrodo no banho para molhar o interior da braçadeira. Se as bolhas permanecerem, use uma seringa fina para extrair tampão do banho e forçar as bolhas a sair da braçadeira.

Usando uma pinça, abra suavemente a braçadeira e deslize-a sob o nervo. Feche a braçadeira ao redor do nervo, evitando qualquer torção ou torção do nervo. Conecte o eletrodo de estimulação e o eletrodo de retorno atual ao estimulador.

Se usar uma folha de platina quadrada como o eletrodo de retorno atual, posicione a folha longe do nervo no banho. Segure o chumbo dos dois eletrodos com fita adesiva. Conecte a saída de sinal TTL do estimulador ao canal quatro do osciloscópio.

Na tela do osciloscópio, pressione a guia Do canal Trigger e especifique o canal quatro como o canal de acionamento. Defina o nível do gatilho para um volt usando o botão de nível. No osciloscópio, defina a resolução de tempo para um milissegundo por divisão e resolução de tensão para 10 milivolts por divisão.

Centralizar a referência do gatilho no tempo e definir o nível do gatilho para um volt. Depois de conectar o estimulador ao computador, ligue o estimulador conectando a fonte de alimentação da bateria à entrada de alimentação. Em seguida, inicie o software MATLAB no computador.

Execute o script MATLAB personalizado. Em seguida, abra o script MATLAB indicado. Edite o script e defina os parâmetros estimuladores de amplitude de pulso para menos 300 microamperes, largura de pulso estimulador para 300 microssegundos, número estimulador de pulsos para 10, e tempo estimulador entre pulsos a um segundo.

Inicie o protocolo de estimulação clicando em Executar no software. O potencial de ação composto, ou CAP, tinha uma amplitude de pico a pico de um mililitro no eletrodo e 100 milvolts quando amplificado. A excitação típica do nervo para punhos nervosos de platina padrão e punhos nervosos de elastômero condutivo personalizados são mostrados aqui.

O CAP obteve ex vivo durante um dia de experimentos usando ambos os nervos ciáticos é mostrado aqui. A redução mínima da amplitude do PAC foi observada com o nervo ciático direito. Em contraste, a amplitude do nervo ciático esquerdo em aproximadamente três milivolts foi semelhante à do nervo ciático direito no início do experimento mais de seis horas após a extração nervosa.

Enfatize a precisão e a repetibilidade na técnica de dissecção, limpeza e implementação. Preste atenção no que está acontecendo no banho. Se o sinal nervoso for perdido, pode ser simplesmente que os eletrodos não estão em bom contato ou que há soro fisiológico na partição de óleo do banho, e não que o nervo tenha morrido.

Pela primeira vez, os usuários podem ser tentados a correr, especialmente durante a fase de dissecção. Isso provavelmente levará a erros e danificará o nervo. Precisão e consistência são fundamentais aqui e levarão a resultados de maior qualidade.

Atenção especial também deve ser dada à consistência na preparação do buffer.