Name: Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a preparar o nervo ciático de ratos para neurofisiologia ex vivo usando técnicas de dissecação eletrofisiológicas. Este método minimiza interferências fisiológicas e melhora a precisão das medições em estudos de função nervosa.

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Os autores reconhecem o Dr. Gerald Hunsberger da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Rei da Prússia, PA, EUA e Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartilharem sua técnica original de preparação nervosa conosco. Os autores reconhecem Robert Toth pelo projeto do banho nervoso de Câmara Dupla. Os autores reconhecem o financiamento da bolsa do Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC). Os autores reconhecem o Centro de Sistemas Incorporados e Distribuídos de Alto Desempenho para Treinamento de Doutorado (HiPEDS CDT) do Imperial College London por financiar Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux é atualmente financiado pelo Uk Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Os autores agradecem Zack Bailey do Imperial College, no Departamento de Bioengenharia, por ajuda com experimentos e acesso a tecidos animais durante a produção do artigo de vídeo jove.

Todos os cuidados e procedimentos de animais foram realizados sob licenças apropriadas emitidas pelo Escritório do Reino Unido sob a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) (1986) e foram aprovados pelo Conselho de Bem-Estar Animal e Revisão Ética do Imperial College London.
1. Preparação de tampões
NOTA: Esta parte do protocolo pode ser realizada bem antes do resto do protocolo, exceto para as etapas finais envolvendo a preparação do Buffer Krebs-Henseleit modificado (mKHB) na concentração de 1x.
<ol><li>Prepare a solução de estoque cacl 2 de 1 M CaCl2<ol>
<li>Adicione 14,701 g de diethidrato caCl2 a um béquer limpo de 100 mL. Adicione ~75 mL de água deionizada e mexa até a dissolução completa do sal.</li>
		<li>Transfira a solução para um frasco graduado de 100 mL e adicione água deionizada até que o volume de 100 mL seja atingido. Transfira a solução para uma garrafa e armazene-a em uma geladeira a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 10x estoque mKHB concentrado<ol>
<li>Adicione 66,03 g de cloreto de sódio (NaCl), 3,57 g de cloreto de potássio (CÍNula), 1,63 g de fosfato de dihidrogênio de potássio (KH2PO4) e 1,44 g de sulfato de magnésio a um béquer de 2 L.</li>
		<li>Adicione ~750 mL de água deionizada ao béquer e mexa até que os sais tenham dissolvido (pode haver pequenos cristais de sal deixados na parte inferior). Adicione 25 mL de 1 M CaCl2 solução de estoque (passo 1.1) e mexa; certifique-se de que este é o último sal adicionado.</li>
		<li>Transfira a solução para um frasco graduado em 1 L e adicione água deionizada para atingir um volume total de 1 L. Transfira a solução para uma garrafa de 1 L. Armazene concentrado 10x mKHB a 4 °C em uma geladeira. NOTA: O estoque concentrado de mKHB pode ser armazenado por aproximadamente 1 mês antes da substituição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a placa de dissecção Petri (revestimento)<ol>
<li>Prepare uma placa de vidro limpo (120 mm de diâmetro) para revestimento, lavando e secando cuidadosamente o prato.</li>
		<li>Seguindo as instruções do fabricante para o uso e a cura do revestimento alkoxy conformal, cubra a parte inferior da Placa de Petri com ~3-5 mm de revestimento, despejando cuidadosamente a mistura de revestimento conformal no prato até que a espessura desejada tenha sido atingida.</li>
		<li>Cure o revestimento em um forno a 60 °C até ficar firme ao toque. A placa de dissecção Petri está pronta. NOTA: A limpeza suave do prato após cada uso garantirá que o revestimento dure por anos antes da necessidade de substituição. Ao substituir o revestimento, certifique-se de remover todo o material de revestimento antes de aplicar um novo revestimento. Observe que o revestimento alkoxy conformal (Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo tem uma vida útil menor que um ano.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparações de pré-dissecação
NOTA: Esta etapa inicia o experimento. As etapas abaixo devem ser realizadas no mesmo dia, nesta ordem.
<ol><li>Prepare 1x mKHB<ol>
<li>Prepare um béquer 2 L limpo para o buffer. Transfira 200 mL de 10x mKHB para o béquer 2 L. Adicione 2,1 g de carbonato de sódio (NaHCO3) e 0,99 g de Dextrose anidro (D-glicose) ao béquer 2 L.</li>
		<li>Adicione aproximadamente 1 L de água deionizada ao béquer. Mexa até que os sais tenham sido completamente dissolvidos. Transfira a solução para um frasco graduado em 2 L e adicione água deionizada para atingir um volume total de 2 L.</li>
		<li>Transfira a solução para uma garrafa de vidro 2 L colocada em um agitador de aquecimento com a temperatura definida para 37 °C. NOTA: O agitador de aquecimento menor muitas vezes não será capaz de atingir a temperatura alvo de 37 °C devido à inércia térmica de grandes recipientes cheios de água. Ajuste a temperatura para cima para que o conteúdo da garrafa atinja 37 °C com agitação. Monitore a temperatura durante o experimento e reduza a temperatura definida em caso de sobrecarga.</li>
		<li>Coloque um termômetro na garrafa 2 L para monitorar a temperatura, usando pinças para evitar que o termômetro seja impactado pela pulga agitada. Aerar o tampão com carbogen por um mínimo de 30 minutos para oxigenar a solução. Isso deve definir o pH para 7,4. Meça o pH com um medidor de pH para garantir que ele esteja dentro de 0,1 pH unidades de 7,4 (a 37 °C). NOTA: Para ajustar o pH para 7,4, use ácido clorídrico ou hidróxido de sódio quando necessário.</li>
		<li>Encha dois tubos de centrífugas de 15 mL e uma garrafa de 100 mL com mKHB e coloque-os no gelo para esfriar. NOTA: Os tubos de centrífugas e a garrafa podem ser limpos e reutilizados após cada experimento sem autoclaving.</li>
		<li>Para partes posteriores do experimento, continue a aerar o tampão na garrafa de 2 L com carbogen a 37 °C com agitação contínua. NOTA: O uso não supervisionado de carbogen pode ser perigoso se nenhum sistema automático estiver no local para desligar o fluxo de gás em caso de vazamento. Um sensor automatizado e uma válvula de desligamento eletrônico podem mitigar isso; caso contrário, uma pessoa deve ser deixada para supervisionar o equipamento se a dissecção ocorrer em uma sala diferente. Em todos os casos, um sensor de oxigênio deve ser usado perto da configuração para alertar os operadores quando a concentração de oxigênio ambiente sobe acima de 25%. Use uma sala com ventilação ativa, se possível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligue o dispositivo de aquisição de sinal, preamplificador de baixo ruído, filtro de ruído de linha e osciloscópio para gravação e estimulação, para permitir tempo suficiente para estabilização da temperatura.</li>
	<li>Certifique-se de que todos os equipamentos de gravação elétrica estão configurados corretamente<ol>
<li>Defina o preamplificador de baixo ruído para a entrada acoplada ao AC com o filtro de banda-pass de entrada definido para 6 dB roll-off por década, e as frequências de corte definidas para 30 Hz e 3 kHz para os filtros de alta passagem e baixa passagem, respectivamente.</li>
		<li>Defina o ganho do preamplificador com baixo ruído para 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Anestesia animal e eutanásia
NOTA: Foram utilizados ratos fêmeas entre 250 e 330 g (Tabela de Materiais) para os estudos.
<ol><li>Preparar ferramentas cirúrgicas e materiais de consumo: tesoura reta de 12 cm (contundente); Tesoura de mola angular de 2 mm; Tesoura fina de 4 cm, afiada ou semi-afiada; #7 Fórceps Dumont; 45° angulado de fórceps finos e 6-0 suturando seda ou rosca.</li>
	<li>Coloque o rato em um recipiente de anestesia ou câmara. Conecte oxigênio e o difusor anestésico ao recipiente. Defina a concentração anestésico (isoflurane) para 3,5% e espere aproximadamente 10 minutos ou até que o animal mostre sinais de anestesia, como perda de reflexo de direito.</li>
	<li>Depois que o rato mostrar sinais de anestesia, confirme a perda de consciência com um teste de reflexo de abstinência do dedo do dedo. Proceda somente quando não houver retirada do dedo do dedo; caso contrário, verifique todas as conexões e níveis anestésicos no difusor e repita o passo 3.2.</li>
	<li>Tire o animal do recipiente e proceda com luxação cervical, seguida de incisão de artéria femoral para confirmação da morte.</li>
</ol>4. Protocolo de dissecação
NOTA: Coloque o animal com a barriga para baixo na mesa de dissecção. Repita os passos a seguir para ambas as pernas. Normalmente, a perna direita é dissecada primeiro.
<ol><li>Segurando o tornozelo firmemente entre o polegar, o dedo indicador e o dedo médio, corte o tendão calcâneo usando uma tesoura sem corte de 12 cm.</li>
	<li>Com uma tesoura fina e afiada, faça uma incisão de pele do tendão calcâneo ao longo da parte de trás da perna até a base da coluna vertebral, tomando cuidado para não dissecar o tecido muscular abaixo.</li>
	<li>Usando fórceps finos e tesouras finas, faça incisões cuidadosas através das camadas musculares perto do meio da parte de trás da perna até que o nervo ciático seja exposto. Assim que o nervo ciático estiver visível, hidratar a cavidade usando mKHB gelado para evitar que o nervo seque.</li>
	<li>Usando hemostatas, puxe os retalhos de pele de cada lado e mantenha a incisão aberta para um trabalho de dissecção mais fino. A partir da localização da incisão do tendão calcâneo, com uma tesoura fina, interrompa o músculo do lado medial da perna para liberar o nervo. Continue mantendo os níveis de umidade na área com mKHB gelado.</li>
	<li>À medida que o nervo é exposto enquanto se move para cima da perna, dissecar o tecido muscular sobreposto. Liberte o nervo mais próximo da coluna vertebral dos tecidos conjuntivos até atingir a fissura espinhal, momento em que há uma torção no nervo. Não tente limpar o nervo ainda, pois a velocidade é essencial nesta fase.</li>
	<li>Corte o nervo o mais próximo possível da coluna com uma tesoura fina. Para facilitar a dissecção, puxe suavemente a extremidade do nervo perto do tornozelo usando fórceps. Nunca belisque o nervo no meio, mas apenas as pontas. Nunca puxe um nervo tenso. OPCIONAL: Neste ponto, se o tempo permitir, a sutura das duas extremidades do nervo pode ser realizada para ajudar a manter a viabilidade. Continue manuseando ao mínimo para evitar danos. Se houver tempo insuficiente (ver passo 4.5), pule esta etapa e siga o passo 5.2 mais tarde.</li>
	<li>Coloque o nervo dissecado no tubo de centrífuga de 15 mL preenchido com mKHB (passo 2.1.5), feche o tubo e coloque o tubo de volta no gelo até o início do procedimento de limpeza.</li>
	<li>Repita as etapas 4.1-4.7 para a outra perna. Idealmente, cada nervo deve levar de 5 a 10 minutos para extrair, a fim de maximizar a viabilidade tecidual.</li>
</ol>5. Procedimento de limpeza nervosa
<ol><li>Encha a placa de Petri revestida aproximadamente no meio do caminho com mKHB oxigenado refrigerado. Coloque um dos nervos ciáticos dissecados no prato e fixe ambas as extremidades do nervo para o prato de tal forma que o nervo é reto sem torções, torção ou torções. Fixar o nervo o mais perto possível das extremidades.</li>
	<li>Usando suturas de seda 6-0 ou rosca fina, amarre um nó duplo em cada extremidade do nervo para evitar o vazamento de citoso no tampão. Coloque os nós ao lado dos pinos de insetos ao lado mais perto do centro do nervo, pois isso evitará o vazamento do tecido nervoso no tampão. Não realize esta etapa se o nervo já foi previamente ligado.</li>
	<li>Usando o microscópio para precisão e a tesoura de mola angular de 2 mm, remova gordura, vasos sanguíneos e tecido muscular do nervo. Podar quaisquer ramos nervosos que não serão usados no protocolo de estimulação e gravação.<ol>
<li>A cada 5 minutos de limpeza, substitua o tampão por mKHB oxigenado fresco. Use fórceps finos para puxar tecidos conjuntivos, gordura e vasos sanguíneos para facilitar a dissecção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os nervos de volta nos tubos de transporte cheios de mKHB resfriado fresco e coloque os tubos no gelo.</li>
</ol>6. Configuração do equipamento
NOTA: A configuração do equipamento utilizada para realizar experimentos é ilustrada na Figura 1. Resumidamente, consiste em um banho de nervo de compartimento duplo, uma garrafa de 2 L colocada em um agitador de aquecimento, uma fonte de carbogen para aeração do buffer, e tubos para permitir que o tampão flua da garrafa para o banho, e de volta para a garrafa usando uma bomba peristáltica. O banho pode ser usinado a partir de plexiglass ou impresso em 3D a partir de materiais impermeáveis. Tem uma profundidade de aproximadamente 2 cm, e a partição que separa as duas câmaras do banho apresenta um orifício de 1,5 mm de diâmetro para permitir a rosca de um nervo periférico em ambas as câmaras. Uma câmara é grande, deve ter pelo menos 4 ou 5 cm de comprimento, e será preenchida com tampão. A outra câmara deve ter pelo menos 3 cm de comprimento e será preenchida com silicone ou óleo mineral. O banho não deve ser muito grande, pois isso irá degradar o controle da perfusão, temperatura e pH. Diferentes tamanhos de banho podem ser necessários dependendo do tamanho do tecido nervoso que está sendo estudado.
<ol><li>Prepare um banho de nervo de câmara dupla limpo (consulte Arquivo Suplementar para especificações de design). Coloque o banho de nervo abaixo do nível da garrafa 2 L colocada no agitador de aquecimento, usando cabeças e pegadores padrão de laboratório. Conecte o dreno do banho à entrada da bomba peristáltica.</li>
	<li>Conecte a saída da bomba peristáltica a um tubo que leva de volta ao frasco tampão 2 L. Conecte a entrada do banho a um tubo com uma válvula de fluxo ajustável e coloque o tubo dentro da garrafa de 2 L. Use uma válvula de três vias com uma seringa conectada à tomada do meio para ajudar a preparar o tubo como um sifão para entrada de buffer assistido pela gravidade.</li>
	<li>Prime o sifão desenhando a seringa até que o buffer flua para dentro dele. Configure a válvula de tal forma que a taxa de fluxo do buffer no banho seja ~5-6 mL·min-1. O fluxo pode ser aumentado inicialmente para encher o banho. Uma vez que o nível do tampão do banho tenha atingido o ralo, coloque os nervos no banho.</li>
	<li>Usando um pino de inseto, fixe a extremidade do nervo no canto da câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps finos de ângulo de 45° e beliscando o nervo apenas nas extremidades, enfie cuidadosamente o nervo para ser estimulado através do orifício na divisória entre as duas câmaras de banho.</li>
	<li>Fixar a outra extremidade do nervo na câmara de óleo do banho com um pino de inseto, garantindo que o nervo esteja reto sem ser esticado e esteja livre de torções e torções. Usando graxa de silicone, faça uma vedação para evitar o vazamento de tampão da câmara tampão na câmara de óleo. Encha a câmara de óleo com silicone ou óleo mineral.</li>
	<li>Coloque os ganchos de eletrodo Ag/AgCl na câmara de banho de óleo e fixe-os usando cabeças de chefe e pinças. Coloque a porção do nervo no banho de óleo sobre os ganchos sem puxar o nervo esticado. Não belisque o nervo; usar fórceps angulares para levantar o nervo sem beliscar.</li>
	<li>Ajuste ou repare a vedação de graxa de silicone se algum vazamento for observado após mover o nervo.</li>
	<li>Conecte o eletrodo Ag/AgCl de referência ao solo do amplificador e coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de buffer, fixando-o usando um gripper de laboratório.</li>
</ol>7. Implantação de eletrodo no nervo no banho
<ol><li>Prepare um eletrodo de punho nervoso limpo para estimulação de acordo com a referência21. Coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps ou pinças finas com pontas cegas ou angulares, abra o eletrodo no banho para molhar o interior da braçadeira.</li>
	<li>Se as bolhas permanecerem, use uma seringa fina para extrair tampão do banho e forçar as bolhas a sair da braçadeira. Com uma pinça sob o nervo, abra suavemente a braçadeira e deslize-a sob o nervo. Feche a braçadeira ao redor do nervo, tomando cuidado para evitar qualquer torção ou torção do nervo.</li>
	<li>Conecte o eletrodo de estimulação ao estimulador e proteja o chumbo eletrodo de estimulação com fita. Conecte o eletrodo de retorno atual ao estimulador e fixe o chumbo com fita. Se usar uma folha de platina quadrada como o eletrodo de retorno atual, posicione a folha longe do nervo no banho.</li>
</ol>8. Estimulação e gravação
<ol><li>Conecte a saída do sinal TTL estimulador ao canal 4 do osciloscópio, que será usado para acionar o osciloscópio. Na tela do osciloscópio, pressione a guia Do canal Trigger e especifique o Canal 4 como o canal de acionamento. Defina o nível do gatilho para 1 V usando o botão Level .</li>
	<li>No osciloscópio, defina a resolução de tempo para 1 ms/divisão e resolução de tensão para 10 mV/divisão. Centralizar a referência do gatilho no tempo e definir o nível do gatilho para 1 V. NOTA: Siga as etapas 8.3 a 8.6 se usar o estimulador personalizado (ver Tabela de Materiais). Presume-se que o software MATLAB e os drivers de dispositivos foram instalados no computador de laboratório usando instruções fornecidas livremente on-line para o estimulador neural personalizado21. Caso contrário, siga as instruções do fabricante para o uso de um estimulador comercialmente disponível como alternativa.</li>
	<li>Conecte o estimulador ao computador de laboratório. Ligue o estimulador conectando a fonte de alimentação da bateria à entrada de alimentação. Inicie o software MATLAB no computador de laboratório.</li>
	<li>Execute o script MATLAB personalizado: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Tabela de Materiais). NOTA: O cabo de comunicação USB entre o computador e o estimulador deve piscar de olhos. Se isso não acontecer, então há um erro de configuração, e a fonte de alimentação e conexões devem ser verificadas.</li>
	<li>Abra o roteiro do MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Tabela de Materiais). Ao editar diretamente o script MATLAB, defina os parâmetros da seguinte forma: amplitude de pulso estimulador = --300 μA, largura do pulso do estimulador = 300 μs, número estimulador de pulsos = 10 e tempo estimulador entre pulsos = 1 s.</li>
	<li>Inicie o protocolo de estimulação clicando em Executar no software MATLAB.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.
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Neste trabalho, descrevemos um protocolo para preparar nervos ciáticos de ratos para neurofisiologia ex vivo. A extração de tecidos leva aproximadamente 30 minutos, incluindo manuseamento animal, anestesia, abate e dissecção, enquanto a limpeza nervosa, a colocação no banho e a implantação de eletrodos devem exigir 30 minutos adicionais antes que a gravação possa ser iniciada. A preparação do buffer pode ser realizada em 30 minutos, embora isso possa ser feito antes do resto do experimento. Este tipo de preparaç...

A compreensão atual da função nervosa fundamental modelada no sílico está em falta em vários aspectos, notadamente no que diz respeito aos efeitos da compartimentação do tecido nervoso fora da soma, axônio e dendritos. As interações axon-mielina ainda são mal compreendidas como evidenciadas pelo fato de que mesmo modelos detalhados de nervo computacional, como o MRG1 (para nervos mamíferos) que captam adequadamente a resposta convencional de estimulação elétrica, não capturam outros comportamentos experimentalmente observados, como o transporte de blocos de alta frequência2 ou a resposta de início secundário3.
Este protocolo fornece um método para investigar eficientemente processos neurofisiológicos ao nível nervoso em um pequeno modelo animal de laboratório agudo, utilizando um protocolo de preparação padronizado para isolar o nervo, controlar seu ambiente e removê-lo de um contexto in vivo para um contexto ex vivo. Isso evitará outros processos corporais ou anestésicos usados por protocolos de estimulação nervosa in vivo para alterar o comportamento nervoso e confundir resultados medidos ou sua interpretação 4,5. Isso permite o desenvolvimento de modelos mais realistas focando apenas em efeitos específicos para tecidos nervosos que são mal compreendidos. Este protocolo também é útil como um teste para novos materiais e geometrias de estimulação nervosa e gravação, bem como novos paradigmas de estimulação, como o bloco de alta frequência 2,3. Variações dessa técnica têm sido utilizadas anteriormente para estudar fisiologia nervosa em condições bem controladas6, por exemplo, para medir a dinâmica e propriedades do canal de íons ou os efeitos dos anestésicos locais7.
Esta técnica oferece várias vantagens em comparação com alternativas como a experimentação aguda in vivo de pequenos animais8. A técnica evita a necessidade de manter a profundidade da anestesia, uma vez que o tecido foi extraído do corpo, reduzindo a quantidade de equipamentos necessários, como difusor anestésico, concentrador de oxigênio e almofada de aquecimento. Isso simplifica o protocolo experimental, reduzindo o risco de erros. Como os anestésicos podem potencialmente alterar a função nervosa4, esta técnica garante que as medidas não serão confundidas por efeitos colaterais desses compostos anestésicos. Finalmente, essa técnica é mais apropriada do que experimentos in vivo agudos ao estudar os efeitos de compostos neurotóxicos como a tetrodotoxina, que mataria um animal anestesiado por paralisia.
As seções nervosas periféricas são um sistema ex vivo único, pois há uma grande chance de que as fibras responsáveis pelos sinais neurais registrados não contenham nenhuma soma. Como estes normalmente seriam localizados, para neurônios motores, na coluna vertebral, e para neurônios sensoriais no gânglio dorsal ao lado da coluna vertebral, a preparação de uma seção do nervo mamífero pode ser aproximadamente modelada como uma coleção de membranas tubulares com canais de íons, abertas em ambas as extremidades9. O metabolismo é mantido pelas mitocôndrias localizadas no axônio no momento da dissecação tecidual10. A sutura das extremidades abertas do axolemma é encorajada após a extração para fechá-las e, assim, ajudar a manter os gradientes iônicos existentes em toda a membrana, que são essenciais para a função nervosa normal.
Para manter a homeostase tecidual fora do corpo, várias variáveis ambientais devem ser fortemente controladas. Sãotemperaturas 11, oxigenação12, osmolaridade, pH13,14 e acesso à glicose para manter o metabolismo. Para este protocolo, a abordagem é usar um buffer Krebs-Henseleit modificado 15,16 (mKHB) continuamente arejado com uma mistura de oxigênio e dióxido de carbono. O mKHB está na família de tampões cardioplégicos 6,17 usados para preservar tecidos dissecados fora do corpo, por exemplo, em experimentos ex vivo. Estes tampões não contêm hemoglobina, antibióticos ou antifúngicos e são, portanto, adequados apenas para preparações envolvendo pequenas quantidades de tecido por um tempo limitado. o controle de pH foi alcançado com o par de carbonato e dióxido de carbono redox, exigindo aeração constante do tampão com dióxido de carbono para manter o equilíbrio do pH. Isto é para evitar o uso de outros agentes de buffering comuns, como o HEPES, que pode modificar a função da célula nervosa18. Para oxigenar o tampão e fornecer controle de pH, foi utilizada uma mistura de 5% de dióxido de carbono em oxigênio chamado carbogen (95% O2, 5% CO2). Um agitador de aquecimento foi usado para o controle de temperatura de um recipiente tampão, e o tampão foi perfundido através de um banho nervoso, e depois recirculado para o recipiente de partida. Um experimento típico duraria de 6-8 h antes que o nervo perca sua viabilidade e não responda mais o suficiente à estimulação de medidas representativas do tecido saudável.
Para otimizar a relação sinal-ruído, foram utilizados eletrodos de cloreto de prata para gravação, que foram preparados de acordo com os métodos descritos anteriormente19. Para estimulação, uma combinação de eletrodos comerciais de punho de platina fora da prateleira e eletrodos de manguitos condutores personalizados podem ser usados. Os eletrodos condutores do manguito de polímero têm capacidades de carga notavelmente mais elevadas, que são úteis ao estimular o nervo usando formas de onda de alta amplitude20.
O estimulador utilizado neste protocolo foi descrito anteriormente20. Documentação, arquivos de design e scripts de software para usá-lo estão disponíveis publicamente21. Outros estimuladores podem ser usados para executar este protocolo; no entanto, o estimulador personalizado também é capaz de bloquear 2,20 blocos de corrente alternativa de alta frequência (HFAC), que permite uma gama mais ampla de experimentos de neurofisiologia. Para usar o bloco HFAC, recomenda-se que as algemas elastômeras condutoras evitem danos ao nervo. As algemas hemóstulas condutoras são matrizes de eletrodos suaves e totalmente poliméricas produzidas a partir de elastômeros condutivos como componente condutor e polidimtilsiloxano como o isolamento22. Os dispositivos foram fabricados em uma configuração bipolar utilizando técnicas convencionais de microfabização a laser.

<table><tbody><tr><td>1 L Frasco de vidro</td><td>VWR International Ltd</td><td>215-1595</td><td>Vidro borossilicato</td></tr><tr><td>1 L Balão graduado de vidro</td><td>VWR International Ltd</td><td>612-3626</td><td>Vidro borossilicato</td></tr><tr><td>2 L Frasco de vidro</td><td>VWR International Ltd</td><td>215-1596</td><td>Vidro borossilicato</td></tr><tr><td>2 L Balão graduado de vidro</td><td>VWR International Ltd</td><td>BRND937254</td><td>Vidro</td></tr> <tr><td>borossilicatoAdaptador, pneumático, 8 mm a 1/4 NPT</td><td>RS UK</td><td>536-2599</td><td>adaptador reto push-to-fit entre a mangueira de oxigénio e o tubo de dispersão de gás</td></tr><tr><td>Revestimento isolante Alcoxi</td><td>Farnell</td><td>1971829</td><td>ACC15 Revestimento isolante alcoxi para dissecção preparação de placas de Petri</td></tr><tr><td>Anestésico</td><td>Chanelle</td><td>N/A</td><td>Anestésico por inalação de isoflurano, frasco de 250 ml</td></tr><tr><td>Copo, 2 L</td><td>VWR International Ltd</td><td>213-0469</td><td>Vidro borossilicato</td></tr><tr><td>Braçadeira de nervo bipolar</td><td>Cortec GMBH</td><td>N/A</td><td>800 mícrons de diâmetro interno, saída perpendicular, sem terminação de conector</td></tr><tr><td>Bossheads</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bossheads de laboratório úmido padrão para fixação de pinças a hastes</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td>500 g em garrafa plástica</td></tr><tr><td>Recipiente de carbogênio</td><td>BOC</td><td>Tubos</td> de centrífuga de <td>canister tamanho F N/</td>A</tr><tr><td>, volume de 15 mL</td><td>VWR International Ltd</td><td>734-0451</td><td>Tubos de falcão</td></tr><tr><td>Braçadeira nervosa de elastômero condutor</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>braçadeira nervosa de alta capacidade de carga para estimulação, consulte o protocolo para referência de fabricação</td></tr><tr><td>Conector, Termimate</td><td>Mouser UK</td><td>538-505073-1100-LP</td><td>Estes devem ser soldados ao fio terminado com pinças de crocodilo (consulte entrada 11)</td></tr> <tr><td>Conectores de clipe de crocodilo</td><td>RS UK</td><td>212-1203</td><td>Estes devem ser soldados ao fio terminado com conectores TermiMate (consulte a entrada 10)</td></tr> <tr><td>Água deionizada</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Obtido do dispensador de água deionizada</td></tr><tr><td>Fórceps inclinado 45 graus</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91110-10</td><td>Fórceps fino, faixa de estudante</td></tr><tr><td>Fórceps padrão Dumont # 7</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91197-00</td><td>Pinça de gama de estudantes</td></tr><tr><td>Tubo de dispersão de gás, porosidade 3</td><td>Merck</td><td>12547866</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Glicose anidra, pó</td><td>VWR International Ltd</td><td>101174Y</td><td>500 g em garrafa de plástico</td></tr><tr><td>Pinças N/A</td><td>N/A</td><td>Pinças padrão montadas em haste de laboratório húmido</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de aquecimento</td><td>RS UK</td><td>768-9672</td><td>Stuart US152</td></tr><tr><td>Hemostáticos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer hemostático >12 cm de comprimento é adequado</td></tr><tr><td>Pinos de inseto, aço inoxidável, tamanho 2</td><td>InterFocus Ltd</td><td>26001-45</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Computador portátil</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer computador portátil seguro para laboratório com pelo menos 2 portas USB não utilizadas é adequado</td></tr><tr><td>Filtro de ruído de linha</td><td>Digitimer</td><td>N/A</td><td>Eliminador de ruído de humbug (filtro de ruído de linha de 50 Hz)</td></tr><tr><td>Baixo ruído Pré-amplificador, SR560</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR560</td><td>Pré-amplificador de tensão de baixo ruído</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de magnésio</td><td>VWR International Ltd</td><td>291184P</td><td>500g em garrafa de plástico</td></tr><tr><td>Scripts MATLAB</td><td>Github</td><td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td><td>Scripts de inicialização, calibração e estimulação para o</td></tr><tr><td>software MATLAB do estimulador personalizado</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>Pacote padrão</td></tr><tr><td>de luz para microscópio, PL-2000</td><td>Fonte de luz fotônica</td><td>N/A</td><td>com pescoços de cisne. O produto pode ser obtido de um fornecedor terceirizado</td></tr><tr><td>Microscópio, SMZ 745</td><td>Nikon</td><td>SM745</td><td>Microscópio estereoscópico</td></tr><tr><td>Óleo mineral, não tóxico</td><td>VWR International Ltd</td><td>31911.A1</td><td>Óleo para banho nervoso</td></tr><tr><td>Banho de nervos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Banho de nervo usinado em plexiglas, consulte o protocolo para obter detalhes.</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>LeCroy</td><td>N/A</td><td>434 Wavesurfer. O produto pode ser obtido de fornecedores terceirizados Mangueira de</td></tr><tr><td>oxigênio, 1 metro</td><td>BOC</td><td>N/A</td><td>1/4" NPT terminações</td></tr><tr><td>Regulador de oxigênio</td><td>BOC</td><td>C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica P-1</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>N/A</td><td>O produto pode ser obtido de um fornecedor terceirizado</td></tr><tr><td>Petri Dish, Glass</td><td>VWR International Ltd</td><td>391-0580&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sal de cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td>250 g em garrafa de plástico</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de di-hidrogênio de potássio</td><td>Merck</td><td>1.04873.0250</td><td>250 g em garrafa de plástico</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Sprague Dawley, 250-330 gramas, fêmea</td></tr><tr><td>Eletrodo de referência, ET072</td><td>eDaQ (Austrália)</td><td>ET072-1</td><td>Eletrodo de referência de cloreto de prata e prata</td></tr><tr><td>Haste</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hastes de laboratório húmidas padrão com acessórios para suportes</td></tr><tr><td>Balança</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>M-Power, para pesagem de pós. O produto pode ser obtido de fornecedores terceirizados</td></tr><tr><td>Tesoura reta 12 cm de borda</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91400-12</td><td>terminação romba-romba, alcance do aluno</td></tr><tr><td>Dispositivo de aquisição de sinal</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Micro3-1401</td><td>Micro3-1401 Multichannel ADC</td></tr><tr><td>Graxa de silicone, não tóxica</td><td>Farnell</td><td>3821559</td><td>para vedação de divisória de banho</td></tr><tr><td>Tubo de silicone, interno de 2 mm diâmetro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubo de silicone, 5 mm de diâmetro interior</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A Fio</td></tr><tr><td>de prata</td><td>Alfa Aesar</td><td>41390</td><td>0,5 mm,</td></tr><tr><td>recozido Sal de bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500g</td><td>500 g em garrafa de plástico</td></tr><tr><td>Sal de cloreto de sódio</td><td>VWR International Ltd</td><td>27810.295</td><td>1 kg em garrafa</td></tr> <tr><td>de plásticoTesoura de mola angular 2 mm de borda</td><td>InterFocus Ltd</td><td>15010-09</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Suporte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Suportes de laboratório húmidos padrão com tomadas para hastes</td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Digitimer</td><td>DS3</td><td>DS3 ou Estimulador Personalizado (ver referências)</td></tr><tr><td>Agitador de pulgas</td><td>VWR International Ltd</td><td>442-0270</td><td>Para utilização com o agitador de aquecimento</td></tr><tr><td>Ponta de seringa, romba, 1 mm de diâmetro</td><td>N/ A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ponta da seringa, romba, 2 mm de diâmetro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Seringa, plástico, volume de 10 mL</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>A seringa deve ter encaixe luer lock</td></tr><tr><td>Fita, resistente à água</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para fixar tubos e cablagem à bancada</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>VWR International Ltd</td><td>620-0806</td><td>termómetro de vidro</td></tr><tr><td>USB Power Banco</td><td>RS UK</td><td>135-1000</td><td>Fonte de alimentação do estimulador personalizado, totalmente carregada antes do experimento. Não é necessário se estiver usando a válvula DS3</td></tr><tr><td>, Leuer Lock, 3 vias</td><td>VWR International Ltd</td><td>229-7440</td><td>Para conectar a seringa ao tubo de alimentação do banho e ao sifão de escorva</td></tr></tbody></table>

preparação do nervo ciático de ratos para neurofisiologia ex vivo

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

As preparações ex vivo permitem o estudo de muitos processos neurofisiológicos isolados do resto do corpo, preservando a estrutura tecidual local. Este trabalho descreve a preparação de nervos ciáticos de ratos para neurofisiologia ex vivo, incluindo preparação de tampão, procedimentos animais, instalação de equipamentos e gravação neurofisiológica. Este trabalho fornece uma visão geral dos diferentes tipos de experimentos possíveis com este método. O método delineado visa fornecer 6h de estimulação e registro em tecido nervoso periférico extraído em condições bem controladas para a melhor consistência nos resultados. Os resultados obtidos usando este método são potenciais de ação composto de fibra A (CAP) com amplitudes de pico a pico na faixa de milívolo durante toda a duração do experimento. As amplitudes e formas da CAP são consistentes e confiáveis, tornando-as úteis para testar e comparar novos eletrodos aos modelos existentes, ou os efeitos de intervenções no tecido, como o uso de produtos químicos, alterações cirúrgicas ou técnicas de estimulação neuromodulatória. Ambos os eletrodos convencionais de punho disponíveis comercialmente com contatos de platina-irídio e eletrodos de elastômero condutivo personalizados foram testados e deram resultados semelhantes em termos de resposta de resistência ao estímulo nervoso.

Resultados representativos que podem ser obtidos com este protocolo são os potenciais de ação composto consistentes das fibras nervosas do tipo A dentro do nervo ciático. Esses potenciais de ação normalmente têm uma amplitude de pico a pico de aproximadamente 1 mV no eletrodo e, portanto, 100 mV uma vez amplificados (Figura 2). Amplitudes de estimulação semelhantes e larguras de pulso devem produzir amplitudes PAC semelhantes. Os eletrodos de manguitos de elastômero condutores geralmente exi...

Este protocolo descreve a preparação de tecido nervoso ciático inteiro de rato para estimulação eletrofisiológica ex vivo e registro em um banho salino ambientalmente regulado, com dois compartimentos e perfumado.

Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Este protocolo permite a observação de muitos fenômenos neurofisiológicos que não são bem compreendidos, como a transferência do bloqueio nervoso após a alta frequência/alta injeção de corrente de amplitude, evitando interferências de outros processos em um corpo vivo. Essa técnica produz resultados altamente repetitivos e robustos e é mais prática do que a eletrofisiologia in vivo, pois variáveis complexas como a profundidade da anestesia não têm que ser controladas e, portanto, não podem influenciar as medições. Após um procedimento de eutanásia sob anestésico, coloque um rato fêmea na mesa de dissecção, segure firmemente o tornozelo entre o polegar, o dedo indicador e o dedo médio, e corte o tendão calcâneo usando uma tesoura sem cortes de 12 centímetros.Usando fórceps finos e tesouras, faça incisões cuidadosas através das camadas musculares perto do meio da parte de trás da perna até que o nervo ciático seja exposto. Uma vez que o nervo seja visível, hidrate a cavidade usando tampão Krebs-Henseleit modificado no gelo, ou MKHB, para evitar que o nervo seque. Usando hemostatas, puxe os retalhos da pele de cada lado e mantenha a incisão aberta para dissecção mais fina.A partir do

preparation-of-rat-sciatic-nerve-for-ex-vivo-neurophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Este vídeo demonstra uma gravação de fibra única da condução nervosa da fibra C em ratos. Um rato anestesiado é incisado para expor o nervo ciático, que fornece suprimento sensorial e motor aos membros inferiores. As fibras C individuais são então expostas. A estimulação elétrica é fornecida usando eletrodos de estímulo implantados no pé e uma resposta é registrada a partir de uma única fibra nervosa.

Registro in vivo de fibras C do nervo ciático em ratos

Aqui, apresentamos uma técnica in vivo para transferência de genes para células de Schwann (SCs) no nervo ciático de roedores. Esta técnica simples é útil para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos no desenvolvimento e manutenção de SCs mielinizantes.

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

Técnicas de excitabilidade axonal fornecem uma poderosa ferramenta para examinar a fisiopatologia e alterações biofísicas que precedem eventos degenerativas irreversíveis. Este manuscrito demonstra a utilização destas técnicas no nervo ulnar de ratos anestesiados.

Na Vivo Medida eletrofisiológica do nervo Ulnar rato com teste de excitabilidade Axonal

Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração...

Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

A análise automatizada da marcha é uma ferramenta viável para avaliar a recuperação funcional em modelos de roedores de lesão nervosa periférica e lesão de contusão medular. Embora exija apenas uma configuração para avaliar a função locomotor em vários modelos experimentais, o ajuste meticuloso e macio e o treinamento dos animais é altamente importante.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Neste estudo, demonstramos um protocolo refinado de eletromiografia de fibra única (SFEMG) para permitir a medição in vivo da transmissão da junção neuromuscular (NMJ) em modelos de roedores. Uma abordagem passo a passo da técnica SFEMG é descrita para permitir a quantificação da variabilidade e falha da transmissão da JNM no músculo gastrocnêmio de ratos.

Eletromiografia de fibra única estimulada (SFEMG) para avaliação da transmissão da junção neuromuscular em modelos de roedores

Aprenda a preparar o nervo ciático de ratos para neurofisiologia ex vivo usando técnicas de dissecação eletrofisiológicas. Este método minimiza interferências fisiológicas e melhora a precisão das medições em estudos de função nervosa.

Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

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