Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

O objetivo geral deste procedimento é isolar citoplasma axonal puro ou ectoplasma do nervo periférico. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do nervo ciático. O segundo passo do procedimento consiste em remover o tecido conjuntivo do nervo e separar os fascículos.

O terceiro passo do procedimento é a incubação de segmentos curtos de filetes nervosos em meio hipotônico. O passo final do procedimento é a centrifugação em solução isotônica e opsm milian. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram um alto grau de enriquecimento para componentes axonais por meio de análise por western blot.

Olá, meu nome é I, Elle And I may Rosenbaum. Somos do laboratório do Professor Mike F Labor, Departamento de Química Biológica, Instituto de Ciência. Hoje vamos apresentar uma nova técnica de metilação Oxi Opat.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a OIS por esmagamento manual de nervos periféricos, é que este procedimento reduz a contaminação por soro e glóbulos e alcança o conteúdo axonal. Utilizamos esta nova técnica para op metilação de PLAs a fim de explorar a sinalização retrógrada mediada por D após lesão do nervo ciático.

Então vamos começar. Coloque um dos dois ratos Wistar eutanasiados, com idade entre oito e dez semanas, de lado sobre uma placa de dissecação para ter acesso direto à parte distal do nervo ciático. Depile a pele na região medial da coxa e limpe cuidadosamente com etanol 70%.

Use uma tesoura para cortar a pele da coxa. Corte cuidadosamente através da gordura e do tecido conjuntivo entre os músculos bíceps femoral e glúteo superficial. Use uma pinça para levantar a região exposta do nervo ciático e removê-lo.

A seção removida terá aproximadamente 1,5 centímetro de comprimento. Transfira o nervo para 500 microlitros de PBS 2X gelado com inibidores de protease em um tubo de microcentrífuga. Mantenha o tubo no gelo.

Repita o procedimento de dissecação no outro lado da rata e em ambos os lados de uma segunda rata. Risque o fundo de uma placa de Petri com uma pipeta Pasteur e preencha-a com dois mililitros de PBS 0,2 X à temperatura ambiente contendo inibidores de protease.

Transfira um único nervo para a placa sob o microscópio estereoscópico. Use pinças finas para remover o epineúrio do nervo puxando-o para longe e descarte-o, deixando os fascículos na placa. Separe cuidadosamente os fascículos uns dos outros e do fundo da placa.

As fálulas individuais ficarão turvas e flutuarão na superfície da solução. Transfira imediatamente as fálulas separadas para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microlitros de PB 0,2 X com inibidores de protease. Mantenha as amostras em gelo.

Sequencie e colete os SLES do nervo ciático remanescente no tubo com prática. A remoção do epineúrio e a separação dos SLES devem levar não mais de 10 minutos por nervo.

Retire o tubo contendo o SLES separado do gelo. Incube por duas horas à temperatura ambiente para liberar a mielina e estruturas não axônicas dos lice. Lave o SLES a cada lavagem.

Use uma pinça para levantar suavemente os SLES e transferi-los para um tubo novo contendo um mililitro de PBS 2X com inibidores de protease. Agite o tubo em um agitador durante cinco minutos. Lave os SLES desta forma três vezes após a lavagem.

Transfira o SLES para um novo tubo eppendorf vazio para remover o excesso de fluido e, em seguida, transfira para um tubo contendo 300 microlitros de um XPBS com inibidores de protease, incubando à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Para eluir o opsm, concentrações mais altas de sal interferem em procedimentos subsequentes de proteômica. Centrifugue o fascículo a 10.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius para sedimentar o tecido e os detritos celulares; remova o sobrenadante com pipeta e transfira para um tubo eppendorf limpo.

O sobrenatante obtido deve estar claro. Utilize um espectrofotômetro para medir a concentração de proteína.

Deve-se obter um rendimento de 200 a 250 microgramas de proteína. Armazene o preparo do plasmídeo em alíquotas a menos 80 graus Celsius por até seis meses. Evite ciclos de descongelamento e congelamento.

Aqui está um bloco western comparando o líquido perivascular isolado pelo método manual de espremer com amostras de LPM isoladas conforme mostrado neste protocolo. Observe os níveis reduzidos de albúmina e GFAP, representando respectivamente contaminações por proteínas sanguíneas e células gliais. Em contraste, a tubulina axonal beta três está enriquecida nesta preparação, indicando um alto nível de proteínas axonais.

Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar o nervo ciático e como separar o Paco corretamente. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.