Visualizando a distribuição de proteínas bacterianas em três dimensões por meio de imagem por fluorescência

Comece com uma lâmina lacrada contendo células bacterianas marcadas com um marcador fluorescente vermelho citoplasmático e um marcador fluorescente verde específico para proteína.

Observe a lâmina sob um microscópio de fluorescência.

Localize um campo contendo células bacterianas bem isoladas e foque no centro de uma célula representativa.

Defina o primeiro canal de fluorescência e adquira uma imagem do z-stack em parâmetros específicos para capturar a forma tridimensional da célula representativa e suas células próximas.

Depois, mude para o segundo canal de fluorescência e adquira outra imagem z-stack das mesmas células com os mesmos parâmetros.

Ela captura a distribuição das proteínas bacterianas dentro das células.

Corte células individuais de cada pilha z para isolá-las e análise de célula única.

Alinhe essas imagens para visualizar a distribuição das proteínas bacterianas em relação ao formato celular, permitindo uma análise precisa durante as interações hospedeiro-patógeno.

Imediatamente após selar a lâmina de cobertura, coloque a lâmina em um palco de microscópio e, após cinco minutos de equilíbrio térmico, use as rodas de foco do microscópio para focar o centro da célula. No software de microscópio associado em Aquisição ND, marque a caixa Z para adquirir uma pilha Z e clique no botão Home para definir o centro da célula como ponto de partida. Defina o tamanho do Passo para 0,1 micrômetros e o Alcance para quatro micrômetros, e certifique-se de que o Dispositivo Z esteja configurado para o estágio Piezo.

É fundamental que haja um desfoque suficiente tanto no topo quanto na parte inferior da célula, de modo que ela fique quase indistinguível do fundo. Ajuste os canais fluorescentes sob a janela lambda para as configurações das moléculas fluorescentes que estão sendo imagens e confirme que a ordem do experimento está definida para lambda, de modo que uma pilha completa de Z será obtida em cada canal de cor antes da troca. Depois, clique em Executar agora para iniciar a aquisição da imagem.

Quando todas as imagens forem adquiridas, abra os arquivos em um programa de análise de imagens apropriado. Desenhe uma caixa ao redor de uma célula individual e duplique essa célula duas vezes, uma para cada canal, certificando-se de que a caixa de Duplicar hiperpilha esteja marcada, e mude o canal para um ou dois. Quando ambas as pilhas estiverem disponíveis, selecione Imagens, Pilhas, Ferramentas e Concatenar para combinar as imagens.