Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

Coloque uma fatia de hipocampo do cérebro de um rato em um poço contendo um tampão. A fatia contém uma rede de neurônios que se comunicam por meio de sinapses.

Os terminais dos neurônios pré-sinápticos contêm vesículas cheias de neurotransmissores com transportadores transmembranares característicos, enquanto os terminais pós-sinápticos apresentam proteínas de andaime características que regulam os receptores de neurotransmissores. Ambos servem como marcadores importantes para estruturas sinápticas.

Substitua o tampão por uma solução de bloqueio de permeabilização e incube com agitação para permeabilizar as membranas celulares e bloquear locais de ligação não específicos.

Adicione anticorpos primários direcionados aos marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos e incube com agitação para permitir a ligação.

Lave a fatia, adicione anticorpos secundários conjugados com fluoróforo específicos para os anticorpos primários e incube com agitação no escuro.

Lave a fatia e monte-a em uma lâmina.

Usando um microscópio confocal, identifique a região de interesse e amplie para visualizar as sinapses.

Capture imagens para identificar os marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos marcados com fluorescência e avaliar sua colocalização nas sinapses.

Para iniciar a coloração por imunofluorescência, substitua o PBS nos poços de fatia por tampão de bloqueio e permeabilização e incube em temperatura ambiente por 4 a 6 horas no agitador. No final da etapa de bloqueio, dilua o anticorpo para VGLUT1 1 a 2000 em tampão de bloqueio e permeabilização. Observe que essa diluição pode diferir dependendo da empresa e do lote do anticorpo usado. Incube as fatias na solução de anticorpo primário durante a noite a 4 graus Celsius. Use uma plataforma agitada com movimento vigoroso.

A distribuição uniforme dos anticorpos primários e secundários é importante para uma coloração ideal. Em nossa experiência, a agitação vigorosa permite a melhor penetração de anticorpos.

Após a incubação em anticorpo primário, lave as fatias três vezes em PBS por 10 minutos de cada vez, como antes. Durante a última lavagem, dilua os anticorpos secundários apropriados de 1 a 500 no tampão de bloqueio. Em seguida, incube as fatias nesta solução por 2 a 3 horas em temperatura ambiente. Certifique-se de que as fatias estejam protegidas da luz, pois os anticorpos secundários são sensíveis à luz.

Depois de lavar as fatias como antes, use um pincel para remover cuidadosamente as fatias da placa de 24 poços e coloque-as uniformemente em lâminas de vidro pré-rotuladas. Adicione uma gota de meio de montagem em cima de cada fatia. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula de vidro em cima das fatias, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar.

Proteja da luz e deixe as lâminas secarem por no mínimo três a quatro dias em temperatura ambiente. Armazene as lâminas a 4 graus Celsius a curto prazo. Mas para armazenamento de longo prazo, mantenha-os a menos 20 graus Celsius. Comece usando uma objetiva de 10x ou 20x para identificar a região do hipocampo a ser fotografada - neste caso, as sinapses entre os neurônios piramidais CA1 e os axônios colaterais de Schaffer.

Mude para uma objetiva de imersão em óleo de 40x ou 63x e certifique-se de que a anatomia da fatia esteja intacta, identificando neurites contínuos e uma estrutura organizada. Use um marcador neuronal, como MAP2, como referência. Ajuste as configurações de cada canal para obter sinal e contraste ideais com uma resolução de 1024 por 1024 pixels. Defina a intensidade de cada laser para evitar a saturação de pixels.

Avalie a profundidade onde a coloração é uniforme e, em seguida, configure o software para adquirir pilhas de imagens de pelo menos oito planos equidistantes de 250 nanômetros. Em seguida, pegue três pilhas de imagens representativas adjacentes da mesma área de interesse por fatia. Repetir a aquisição em pelo menos três fatias por condição e de seis a oito animais por grupo de tratamento.