Name: Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Aprenda a cultivar fatias organotípicas de cérebros de ratos E18 usando microscopia de dissecação, agarose de baixo ponto de fusão e vibratome. Esta técnica permite estudar desenvolvimento cortical e migração neuronal in vitro.

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cultura slice organotípicas de e18 cérebros de ratos

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Culturas fatia organotípicas de cérebros de roedores embrionárias são amplamente utilizados para estudar o desenvolvimento do cérebro. Embora muitas vezes há vantagens para um sistema de in-vivo, culturas fatia organotípicas permitem realizar uma série de manipulações que não são actualmente viável in-vivo. Até à data, organtotypic culturas fatia embrionárias cérebro têm sido utilizados para acompanhar células individuais usando a microscopia de lapso de tempo, manipular a expressão de genes no emanances ganglionares (uma região que é difícil de alvo por in-utero eletroporação), bem como para farmacológicos estudos. Neste protocolo de vídeo demonstramos como fazer culturas fatia organotípicas de rato dia embrionário 18 embriões. O protocolo envolve dissecar os embriões, incorporando-os no gelo derreter em baixo agarose, cortando o cérebro incorporado na vibratome e, finalmente, as fatias de revestimento para filtros em placas de cultura. Este protocolo também é aplicável na sua forma actual de fazer culturas fatia organotípicas de diferentes idades embrionárias para ambos os ratos e camundongos.

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Culturas de fatias organotípicas de cérebros de roedores embrionários são amplamente utilizadas para estudar o desenvolvimento cerebral. Embora sistemas in vivo frequentemente apresentem vantagens, ...

Meu nome é Laura Elias. Sou aluna de pós-graduação em neurociência trabalhando no laboratório de Arnold K Stein. Estamos no Instituto de Medicina Regenerativa aqui na UCSF, e hoje vou mostrar a vocês como realizar o cultivo de fatias orgânicas de cérebros de ratos E18.Portanto, este procedimento envolve dissecar os cérebros, embuti-los em ágar de baixo ponto de fusão, cortá-los no viótomo e obter suas secções coronais, e então colocá-las no sistema de cultura de fatias. Existem algumas ferramentas e reagentes importantes que utilizamos neste procedimento de cultura de fatias. Você precisará de um microscópio estereoscópico para dissecar os cérebros.Também utilizamos este V como um vibram VT 1000 S, e esse é um bom sistema para cortar seus cortes. A cola pode ser importante. Utilizamos este tipo de travamento para cola que adere muito bem os cérebros, pois, às vezes, se você usar o tipo errado de cola, os cérebros podem se soltar quando você estiver tentando cortá-los, o que pode ser problemático.Também utilizamos esses filtros de célula milli, que são os filtros nos quais colocamos nossas fatias durante a cultura, e esta também é uma parte importante do processo. Muito bem, então antes de iniciar o processo de cultura de fatias, há algumas etapas que você precisará realizar. Primeiro, você precisa preparar o seu A CSF, e depois de terminar de preparar o seu A CSF, você deve colocá-lo no gelo para que esfrie, além de começar a borbulhá-lo com carbogênio.Você também precisará preparar seu agarose a 4%. Para isso, use agarose de ponto de fusão baixa, dissolva-a em LCR, aqueça em forno de micro-ondas e mantenha-a a 50 graus até a inclusão de seus encéfalos. Você também deverá preparar o meio de cultura para fatias; após o preparo do meio de cultura, coloque-o a 37 graus para que comece a aquecer, de modo que, quando as fatias forem colocadas ao final, o meio esteja na temperatura adequada.E neste momento, você já deve estar pronto para reunir seus instrumentos e iniciar o processo de cultura de fatias. Muito bem, agora vamos preparar culturas de fatias a partir do cérebro de embriões de ratos no dia embrionário 18. Primeiramente, vou verificar se a mãe está completamente anestesiada por meio de uma compressão no dedo do pé.Aqui temos um exemplo em que o rato ainda apresenta um pequeno reflexo e está recolhendo levemente a pata traseira quando aperto seu pé. Portanto, teremos que esperar mais um pouco ou reaplicar um pouco a anestesia, até que não observemos nenhuma reação. Assim, vou prosseguir e abrir a cavidade para recuperar os embriões.E eu só quero puxar a pele para poder fazer um corte limpo. Remova alguns dos embriões aqui, e eu vou cortá-los. Então, você pode cortar entre dois embriões e depois vamos cortar ao longo.E agora podemos remover este embrião e destacá-lo da placenta fazendo uma incisão logo adjacente à placenta. Agora vamos transferir o embrião para um LCR frio e remover o restante do, do saco aqui. Sim, isso, e cortar aqui.Agora este embrião está pronto e vamos preparar cortes cerebrais. Muito bem, agora temos nosso embrião e vou remover a cabeça aqui com a tesoura. Pronto, agora estou pronto para dissecar o cérebro.Primeiro, precisamos imobilizar a cabeça, o que fazemos inserindo pinos através das órbitas oculares e também no cérebro posterior. Isso nos ajuda a imobilizar o cérebro no recipiente. Assim, como você vê aqui agora, temos um cérebro imobilizado no nosso recipiente, e começaremos fazendo uma incisão no cérebro posterior e depois avançando mais rostralmente.Então, vou começar fazendo uma incisão aqui perto do cerebelo. Vou colocar minha tesoura sob a pele e o crânio, e depois deslocar a incisão até a região de Roswell. Em seguida, farei mais duas incisões lateralmente, bem no final do córtex, próximo ao sero meum.Vou fazer incisões que lateralmente nessa direção, e depois uma incisão aí. Em seguida, usarei minha pinça para destacar o crânio dessa forma. Agora expusemos o tecido nervoso, e então o retirarei do crânio assim.Então, aqui está seu cérebro completamente dissecado. Agora, vamos incluir esses cérebros em Agarose, e eu já preparei uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 4%. Você prepara essa solução em LCR, aquece no micro-ondas e depois mantém a aproximadamente 50 graus para que permaneça líquida.E agora vou começar o processo de inclusão. Então, vou pegar um pouco deste agar, colocá-lo nestas placas e vamos encher quase até o topo, estas aqui. Muito bem, o primeiro passo é pegar seus encéfalos e simplesmente enxaguá-los numa placa com agar.Você não quer excesso de líquido nos cérebros, porque isso impede que eles se incorporem e adiram bem ao agar. Portanto, se você não os lavar bem na primeira etapa, eles tendem a sair do agar quando você tenta cortá-los no viótomo. Por isso, basta rodopiá-los para remover o excesso de líquido.Em seguida, transferiremos esses cérebros para outros recipientes que contêm o ágar 4% mostrado aqui. Agora estamos posicionando os cérebros no ágar. Dessa forma, é importante não colocá-los muito próximos ao fundo ou à borda superior do recipiente, para que fiquem cercados por ágar em todas as direções.Em seguida, vamos colocar a tampa sobre este recipiente, cobri-lo e, então, colocaremos este recipiente sobre gelo para que o risolite endureça e o cérebro fique bem embutido nas sobrancelhas; o agar deverá endurecer em cerca de cinco a dez minutos. Muito bem, agora temos nossos cérebros embutidos em agar e vamos começar a seccioná-los no viotrófio para obter cortes com aproximadamente 300 mícrons de espessura, que utilizaremos para cultivo em fatias. Faremos isso, assim como todas as outras etapas realizadas nesta ACSF fria que está sendo borbulhada com carbogênio.E agora estamos prontos para começar. Muito bem, agora vamos iniciar removendo o cérebro do agros. Então vamos simplesmente retirar a parte superior aqui, e às vezes é necessário ajudar para garantir que o bloco de agros saia completamente pela parte superior.Vamos ver aqui. Então você pode simplesmente colocá-lo na parte inferior. Agora temos os agros, e o que vamos fazer é cortar o agros para que, basicamente, retiremos o cérebro.Então, vou fazer quatro cortes: um na parte traseira, outro na frente e mais dois ao longo dos lados. Estou basicamente removendo o cérebro exatamente como foi embutido. Agora fizemos as incisões e separamos o cérebro no agarose.E agora deveríamos ser capazes de simplesmente retirar nosso cérebro do agar aqui. Nosso cérebro acabou de sair e está embutido no agar. Agora vamos pegar a cola e colocá-la nesta pequena plataforma aqui. Fixar.Então vamos colocar um pouco de cola e posicionar nosso cérebro diretamente sobre essa cola. Basicamente, o cerebelo, o cérebro posterior, estará voltado para a cola, com o bulbo olfativo ou extremidade rostral voltada diretamente para cima. Em seguida, moveremos isso para a câmara de vibrosserrote.Agora estou transferindo o cérebro para o viótem, onde o seccionaremos. Então vamos lá. Colocamos-no no Vibram e apertamos bem assim.Em seguida, adicionaremos a ACS fria borbulhante que tenho aqui na gelo. Isso também endurece a cola, o que é importante. E agora nosso cérebro estará fixado à placa no vibratomo.Agora estamos prontos para começar a seccionar o cérebro no vibrátomo. Vou remover um pouco desse ágar em excesso aqui. Então, vamos fazer uma incisão e removê-lo.Agora temos nosso cérebro aqui. Vou colocar a lâmina sobre a cabeça do vibrátomo aqui. Assim, ela será simplesmente inserida aqui e posicione a lâmina sobre o vibrátomo.E eu também vou cortar um pouco esta pipeta aqui, apenas para que ela fique grande o suficiente para pegar as fatias assim que eu as cortar. Então, agora temos isso. E agora estamos prontos para começar a cortar.Então, como eu disse, usei seções de 300 mícrons para isso. Então vamos querer mover nossa lâmina em direção ao cérebro, elevando o estágio. Ok, então primeiro estamos apenas posicionando nossa lâmina exatamente antes do tecido, e os primeiros cortes irão atingir apenas o agar ou talvez áreas muito periféricas, mas na verdade é apenas para posicionar nossa lâmina.Temos a vibração em torno de sete e nossa velocidade em torno de cinco. Estamos cortando aqui para obter seções coronais corticais. Estamos começando na extremidade rostral do cérebro e, na verdade, mal entramos no cérebro agora.Então estamos apenas começando. Esta é nossa primeira fatia, mas quase tem, está muito rostral neste ponto. Então manteremos minhas seções manuais.À medida que os cortes são obtidos, eu os retiro com o pé e os coloco em LCR borbulhante à temperatura ambiente. Também é opcional colocar gelo nesta câmara para manter tudo ainda mais frio, especialmente com esses cérebros embrionários. Primeiro, cultura com gelo.Eles parecem sobreviver perfeitamente bem desde que seu LCR A esteja gelado. Mas para outros experimentos, ou se seus cérebros forem ligeiramente mais velhos, você pode querer colocar gelo na sua câmara apenas para manter tudo extremamente frio. Agora temos nossos cortes no LCR A borbulhante.Eles podem permanecer aqui por cerca de até uma hora, mas também podemos seguir em frente e colocá-los no nosso sistema de cultura de fatias. Ok, agora estamos prontos para preparar as placas e o sistema de cultura para que possamos incubar as fatias que acabamos de produzir. Então, vamos pegar uma placa de seis poços aqui.E vamos colocar, em cada um desses poços, cerca de um mil e meio de meio de cultura de fatias que preparamos previamente e aquecemos a 37 graus, cerca de um mil e meio em cada um desses recipientes. Então, vou pegar meus filtros. Na verdade, vamos posicionar as seções cerebrais sobre esses filtros, mas, previamente, esses filtros devem ser colocados sobre este meio aqui.Então vamos colocar os filtros sobre o meio que você deseja remover, afastando as bolhas, pelo menos, para o lado. Você não deve ter bolhas sob o filtro. Esses filtros permitem que as fatias absorvam os nutrientes do meio, ao mesmo tempo em que permanecem expostas ao ar, evitando, basicamente, que elas sofram asfixia.Agora temos nossos filtros na placa e estamos prontos para obter nossas fatias e transferi-las para os filtros. Agora temos nossas fatias nesta placa, das quais removi a maior parte do A CSF. Portanto, quero adicionar rapidamente o meio de cultura de fatias, pois, basicamente, você deseja transferi-las do A CSF para o meio de cultura de fatias.Então, vou apenas adicionar meio de cultura aqui às minhas fatias. Vou tentar fazê-lo com cuidado para não danificá-las muito. Agora minhas fatias estão no meio de cultura, e vou precisar transferi-las para esses filtros, os três filtros que tenho aqui.E então vou pegar minha pipeta aqui e aspirar a fatia, colocando-a no filtro. Você pode colocar algumas fatias no mesmo filtro ou, se preferir, apenas uma única fatia. Vou colocar algumas fatias aqui neste filtro.Em seguida, é importante remover esse excesso de meio transferido. Aqui, vou simplesmente retirar o meio adicional que foi transferido junto com as fatias, pois não se deseja muito meio nesses recipientes, caso contrário as fatias ficarão cobertas pelo meio e não durarão tanto tempo, já que tendem a não receber oxigênio suficiente. Assim, removi o meio excedente e agora minhas fatias estão apenas sobre este recipiente, prontas para ir ao incubador.Muito bem, agora essas fatias estão prontas para ir ao incubador a 37 graus. Elas devem permanecer boas por cinco a sete dias. Trocamos o meio a cada cerca de três dias, substituindo metade do meio por meio novo.E então, vou apenas colocar essas culturas na estufa. Muito bem, é isso. Terminamos tudo.Portanto, utilizamos esta técnica em nosso laboratório para estudar diversos aspectos do desenvolvimento cortical, incluindo as divisões de progenitores e a migração neuronal. Esta técnica pode ser particularmente útil quando combinada com microscopia de lapso de tempo, permitindo acompanhar células individuais enquanto se dividem e migram na sua cultura de fatias.

organotypic-slice-culture-of-e18-rat-brains

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma...

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

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Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

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Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Este vídeo demonstra um método para preparar culturas organotípicas de fatias de hipocampo a partir do cérebro de um filhote de rato. Ele descreve as etapas envolvidas na dissecação do hipocampo, fatiamento e condições de cultura necessárias para promover a viabilidade celular e o crescimento nas fatias do hipocampo, gerando culturas de fatias organotípicas.

Preparação de culturas organotípicas de fatias do hipocampo de um filhote de rato

O vídeo demonstra um método para obter fatias de córtex rinal-hipocampo do cérebro de um filhote de rato e cultivá-las em inserções membranosas dentro de uma placa de vários poços cheia de mídia para análise posterior.

Preparando fatias de córtex rinal-hipocampo de um cérebro de filhote de rato

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

Aqui, descrevemos a preparação de fatias organotipicas do córtex-hipocampo rhinal. Sob uma privação gradual e controlada de soro, essas fatias retratam eventos epilépticos em evolução e podem ser consideradas um modelo ex vivo de episetogênese. Este sistema representa uma excelente ferramenta para monitorar a dinâmica da atividade espontânea, bem como para avaliar a progressão das características neuroinflamatórias ao longo do curso da epipesogênese.

Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

Aprenda a cultivar fatias organotípicas de cérebros de ratos E18 usando microscopia de dissecação, agarose de baixo ponto de fusão e vibratome. Esta técnica permite estudar desenvolvimento cortical e migração neuronal in vitro.

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

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