Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Meu nome é Laura Elias. Eu sou um estudante de pós-graduação em neurociência trabalhando no laboratório de Arnold k Stein. Estamos no instituto de medicina de regeneração aqui na UCSF, e hoje vou mostrar a vocês como fazer cultura de fatias típicas orgânicas de cérebros de ratos E 18.

Portanto, este procedimento envolve dissecar os cérebros, incorporá-los em agros de baixo derretimento, depois cortá-los no vioma e pegar suas seções de corona e, em seguida, colocá-los no sistema de cultura Slice. Portanto, existem algumas ferramentas importantes em reagentes que usamos para este procedimento de cultura de fatias. Você precisará de um microscópio de dissecação para dissecar os cérebros.

Também usamos este V como um VT 1000 S vibram, e esse é um bom sistema para cortar suas fatias. A cola pode ser importante. Usamos esse tipo de bloqueio para cola que cola muito bem os cérebros porque, às vezes, se você usar o tipo errado de cola, os cérebros se soltarão quando você estiver tentando cortá-los, e isso pode ser problemático.

Também usamos esses filtros de células milimétricas, pois esses são os filtros nos quais colocamos nossas fatias enquanto estão em cultura, e essa também é uma parte importante do processo. Tudo bem, então antes de iniciar o processo de Slice of culture, há algumas etapas que você deve seguir. Então, primeiro, você precisa fazer seu A CSF, e você quer, depois de terminar de fazer seu A CSF, você quer colocá-lo no gelo para que esfrie e comece a borbulhá-lo com carbogênio.

Você também vai querer fazer seus 4%agros. Então, para isso, você quer usar agros de baixo ponto de fusão e dissolvê-lo em um LCR, colocá-lo no micro-ondas e mantê-lo a 50 graus até incorporar seu cérebro. Você também quer fazer seu meio de cultura de fatias e, depois de fazer seu meio de cultura de fatias, coloque-o a 37 graus para que comece a aquecer para que, quando você colocar suas fatias no final, esteja na temperatura certa.

E neste ponto, você deve estar pronto para coletar suas ferramentas e iniciar o processo de cultura de fatias. Tudo bem, agora vamos fazer culturas de fatias a partir dos cérebros de embriões embrionários de ratos do dia 18. Então, primeiro vou verificar se a mãe está totalmente anestesiada pelo beliscão do dedo do pé.

Aqui está um exemplo em que o rato ainda tem um pequeno reflexo e está puxando a perna traseira um pouco para trás quando eu aperto seu pé. E então teremos que esperar mais ou anestesiar um pouco, e não vemos nenhuma reação. Então, vou abri-la para recuperar os embriões.

E eu só quero puxar a pele para cima para que eu possa obter um corte limpo e agradável. Remova alguns dos embriões aqui e eu vou cortá-los. Então você pode cortar entre dois embriões e depois nós cortaremos.

E agora podemos remover esse embrião e separá-lo da placenta fazendo uma incisão bem adjacente à placenta. Agora vamos mover o embrião para o frio A CSF e remover o restante do saco aqui. Sim, isso é e cortar lá.

Então agora este embrião está pronto e vamos fazer seções cerebrais. Tudo bem, agora temos nosso embrião, e eu vou remover a cabeça aqui e a tesoura. Ok, agora estou pronto para dissecar o cérebro.

Primeiro temos que imobilizar a cabeça, e fazemos isso colocando pinos nas órbitas oculares, bem como no cérebro posterior. E isso nos ajuda a imobilizar o cérebro no prato. E então, como você vê aqui agora, temos um cérebro imobilizado em nosso prato, e começaremos fazendo uma incisão no cérebro posterior e depois avançando mais rechonchudo.

Então, vou começar fazendo uma incisão aqui perto do cerebelo. Vou colocar minha tesoura sob a pele e o crânio e, em seguida, mover minha incisão até a área de Roswell. Então eu vou fazer mais duas incisões lateralmente perto do final do córtex, perto do sero meum.

Vou fazer uma incisão lateralmente nessa direção e, em seguida, uma incisão ali. E então vou usar minha pinça para descascar o crânio como tal. E agora expusemos a trança, e eu vou retirá-la da cabeça Como tal.

Então aí está seu cérebro totalmente dissecado. Tudo bem, agora vamos incorporar esses cérebros em Agros, e eu pré-fiz agros de 4% de baixo derretimento. E então você faz isso em um LCR, coloca no micro-ondas e depois mantém a cerca de 50 graus para que fique líquido.

E agora vou iniciar o processo de incorporação. Então, vou pegar um pouco desses agros, colocá-los nesses pratos, e vamos preenchê-los praticamente até o topo, esses. Tudo bem, então o primeiro passo é pegar seu cérebro e basicamente enxaguá-lo em um prato de agro.

Você não quer excesso de líquido no cérebro porque isso os impede de se encaixar bem e aderir bem aos agros. E assim, se você não lavá-los bem na primeira etapa, eles tendem a cair dos agros quando você tenta cortá-los no viome. E então nós apenas os giramos e tentamos tirar o excesso de líquido.

Então, vamos transferir esses cérebros para esses outros pratos que estão cheios dos 4% agros mostrados aqui. Então, agora estamos posicionando os cérebros nos agros. Como tal, você não quer que fique muito perto do fundo ou do topo do prato para que fique cercado por agros por todos os lados.

E então vamos colocar a tampa sobre este prato, cobri-lo e, em seguida, vamos colocar esse prato no gelo para que o ris endureça e o cérebro fique bem embutido nas sobrancelhas e o agro deve endurecer em cerca de cinco ou 10 minutos. Tudo bem, agora temos nossos cérebros embutidos em agros e onde vamos começar a seccioná-los no vioma aqui para fazer seções de aproximadamente 300 mícrons de espessura que usaremos para cultivo fatiado. Vamos fazer isso, assim como todas as outras coisas que fizemos neste frio A CSF que está sendo borbulhado com carbogênio.

E agora estamos prontos para começar. Tudo bem, então agora vamos começar removendo o cérebro dos agros. Então, vamos apenas tirar o topo aqui, e às vezes você tem que ajudar a garantir que o bloco de agros saia do topo.

Vamos ver aqui. Então você pode simplesmente colocá-lo na parte inferior. Então agora temos os agros, e o que vamos fazer é cortar os agros para que basicamente cortemos o cérebro.

Então, vou fazer quatro cortes, um coddly, e depois um na frente, e depois dois nas laterais. E então eu estou basicamente cortando o cérebro assim como o incorporamos. Então, agora fizemos incisões e cortamos nosso cérebro nos agros.

E agora devemos ser capazes de basicamente tirar nosso cérebro dos agros aqui. Então, nosso cérebro acabou de sair e está embutido nos agros. E agora vamos pegar a cola e colocá-la neste pequeno palco aqui. Pôr.

Então, vamos colocar um pouco de cola e colocar nosso cérebro bem em cima dessa cola. Então, basicamente, o cerebelo, o cérebro do pinheiro, está voltado para a cola com a tigela olfativa ou a extremidade rostral voltada para cima. E então vamos mover isso para a câmara Vibram.

Então agora estou transferindo o cérebro para o vioma onde vamos seccioná-lo. Então vamos lá. Nós o colocamos no Vibram e o apertamos de tal forma.

Em seguida, adicionaremos o A CSF borbulhante frio que tenho no gelo aqui. Portanto, isso também endurece a cola, o que é importante. E agora nosso cérebro estará ligado à placa no vibrato.

Então, agora estamos prontos para começar a seccionar o cérebro no vibrato. Vou remover um pouco desse excesso de agro aqui. E então vamos apenas fazer uma incisão, removê-la.

Então agora temos nosso cérebro aqui. Vou colocar a lâmina na cabeça do vibrato aqui. Então, isso será inserido aqui e coloque a lâmina no vibrato.

E também vou cortar essa pequena pipeta aqui só para que fique grande o suficiente para pegar as fatias depois de cortá-las. Então aí temos isso. E agora estamos prontos para começar a cortar.

Então, como eu disse, usei seções de 300 mícrons para isso. Então, vamos querer mover nossa lâmina em direção ao cérebro subindo no palco. Ok, então primeiro estamos apenas posicionando nossa lâmina bem em, antes do tecido e os primeiros cortes atingirão apenas agro ou talvez as áreas muito erupções cutâneas, mas na verdade é apenas para posicionar nossa lâmina.

Temos a vibração em torno de sete, e nossa velocidade está em torno de cinco. E então estamos cortando aqui para fazer seções coronais corticais. E estamos começando na extremidade mais rostral do cérebro e, na verdade, mal entramos no cérebro agora.

Então, estamos apenas começando. Então, nossa primeira fatia, mas quase tem, é muito rostral neste momento. Então, vamos manter minhas seções de mão.

Então, à medida que as seções saem, eu as removo com o pé e as coloco em temperatura ambiente borbulhante, A CSF. Também é opcional colocar gelo na câmara aqui para manter tudo ainda mais frio com esses cérebros embrionários. Primeira cultura de gelo.

Eles parecem sobreviver perfeitamente bem, desde que seu A CSF esteja gelado. Mas para outros experimentos, ou se seus cérebros forem um pouco mais velhos, você pode querer colocar gelo em sua câmara apenas para manter tudo extremamente frio. Então agora temos nossas fatias no borbulhante A CSF.

Eles podem ficar aqui por cerca de uma hora, mas também podemos simplesmente ir em frente e colocá-los em nosso sistema de cultura de fatias. Ok, agora estamos prontos para preparar os pratos e o sistema de cultura para que possamos incubar as fatias que acabamos de fazer. Então, vamos pegar uma placa de seis poços aqui.

E vamos, em cada um desses poços, colocar cerca de um moinho e meio desse meio de cultura de fatias que pré-preparamos e aquecemos a 37 graus cerca de um moinho e meio em cada um desses pratos. Então eu vou pegar meus filtros. E então, na verdade, vamos colocar as seções cerebrais nesses filtros, mas de antemão, esses filtros vão nessa mídia aqui.

Então, vamos colocar os filtros em cima da mídia da qual você deseja se livrar, colocar as bolhas pelo menos para o lado. Você não quer ter bolhas sob o filtro. Portanto, esses filtros permitem que as fatias absorvam os nutrientes do meio enquanto permanecem expostas ao ar para que não sufoquem basicamente.

Então, agora temos nossos filtros no prato e estamos prontos para pegar nossas fatias e transferi-las para os filtros. Agora que temos nossas fatias aqui neste prato, removi a maior parte do A CSF. E então eu quero adicionar rapidamente os meios de cultura de fatia, porque basicamente você deseja transferi-los do CSF A para o meio de cultura de fatia.

Então, vou adicionar mídia cultural aqui às minhas fatias. Tente fazê-lo com cuidado para não destruir muito as fatias. Então, agora minhas fatias estão na mídia de cultura, e eu só vou querer transferi-las para esses filtros, os três filtros que tenho aqui.

E então eu vou pegar minha pipeta aqui e, e sugar a fatia e colocá-la no filtro. Você pode colocar algumas fatias no mesmo filtro ou, se quiser, pode ter apenas uma fatia. Vou colocar algumas fatias aqui neste filtro.

E então é importante remover esse excesso de mídia aqui que você transferiu. E aqui eu vou basicamente pegar a mídia extra que transferi com as fatias porque você não quer muita mídia nesses pratos, ou então as fatias serão cobertas com a mídia e não durarão tanto quanto tendem a não receber oxigênio suficiente. E então, eu removi a mídia extra e agora minhas fatias estão apenas sentadas neste prato e estão prontas para ir para a incubadora.

Tudo bem, então agora essas fatias estão prontas para ir para a incubadora de 37 graus. Eles devem ser bons por cinco a sete dias. E trocamos a mídia a cada três dias, trocando metade da mídia, substituindo-a por uma nova mídia.

E então eu vou em frente e colocar essas culturas na incubadora. Tudo bem, é isso. Estamos todos prontos.

Portanto, usamos essa técnica em nosso laboratório para estudar vários aspectos do desenvolvimento cortical, incluindo as divisões progenitoras e a migração neuronal. Essa técnica pode ser particularmente útil juntamente com a microscopia de lapso de tempo para que você possa acompanhar as células individuais à medida que elas se dividem e migram em sua cultura de fatias.