Rastreando a dinâmica da infecção bacteriana em um camundongo usando bioluminescência

Comece com uma suspensão de uma cepa atenuada de uma bactéria patogênica.

A cepa atenuada exibe patogenicidade reduzida devido a deleções direcionadas em genes de virulência.

As bactérias são marcadas cromossomicamente com um operon bioluminescente que permite a produção autônoma de luz.

As bactérias expressam o operon bioluminescente, produzindo uma enzima luciferase e um complexo enzimático que sintetiza o substrato da luciferase.

A luciferase oxida o substrato para produzir luz visível.

Centrifugar a suspensão e rejeitar o sobrenadante.

Lave as células com um tampão, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante para remover os componentes não celulares residuais.

Ressuspenda as células no tampão para atingir uma concentração bacteriana ideal e coloque a suspensão em uma seringa.

Injetar a suspensão por via intraperitoneal num ratinho e transferi-la para uma gaiola.

Visualize o sinal bioluminescente em intervalos regulares.

A cepa atenuada permanece localizada e a bioluminescência diminui gradualmente, indicando eliminação da infecção.

Na manhã das injeções, descongele os criogenianos das células bacterianas a quatro graus Celsius por três a quatro horas. Mantenha os frascos no gelo após o descongelamento e injete os camundongos dentro de duas horas. Transfira o conteúdo de cada criogenia para um novo tubo de dois mililitros e centrifugue-o a 4.500 vezes G por 10 minutos.

Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular num mililitro de PBS. Repita a centrifugação e ressuspenda as células em PBS até uma concentração final de 2,5 vezes 10 elevado às unidades formadoras da nona colônia por mililitro. Pegue três amostras da suspensão final de cada cepa para validar a concentração, genótipo e fenótipo.

Para cada cepa, alíquota de 1,5 mililitros da suspensão celular em um tubo de dois mililitros e prepare o PBS para injeções de controle. Reúna os camundongos e os materiais necessários para as injeções em uma sala cirúrgica estéril para animais e limpe todas as superfícies com lenços desinfetantes antes de começar. Use dois pares de luvas de látex para limitar o risco de perfuração, se mordido, bem como um jaleco, óculos de segurança e máscara facial.

Remova o mouse da gaiola e pese-o, marcando a cauda com marcador permanente para rastreamento pós-injeção. Abra uma nova seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 27 e retire 200 microlitros de PBS estéril. Pegue o mouse atrás das orelhas, usando o polegar e o indicador, e aperte para criar uma dobra de pele na nuca.

Em seguida, prenda a cauda na palma da mão usando o dedo mindinho para segurar o mouse plano e imóvel. Insira a agulha em um ângulo de 30 graus na cavidade peritoneal à esquerda ou à direita da linha média. Levante levemente a agulha para garantir que ela não foi inserida nos órgãos.

Em seguida, injete lentamente o PBS e retire a agulha. Um bolus no local da injeção é típico. Coloque a agulha no recipiente de descarte de objetos cortantes designado e mova o mouse para uma gaiola separada.

Repita o procedimento com o próximo mouse e, depois que todos os camundongos de uma gaiola forem injetados, mova-os de volta para a gaiola original. Depois de injetar o grupo de controle, injete os grupos de teste usando o mesmo procedimento. Quando todas as injeções estiverem concluídas, devolva os ratos à sala de alojamento e limpe a área de trabalho com lenços desinfetantes.

Defina o fluxo de oxigênio para 1,5 litros por minuto e isoflurano para 3,5% e mova o mouse para a câmara anestésica e, em seguida, para o estágio de estabilização da temperatura, após a anestesia. Posicione o mouse de costas com os braços estendidos e coloque um cone nasal para administração de isoflurano a 2,5% durante a imagem.

Feche a porta e tire imagens bioluminescentes e raios-x do mouse. Quando a imagem estiver concluída, retorne o mouse à gaiola e monitore-o. Ele deve recuperar a consciência dentro de três a cinco minutos.