Name: Imagem bacteriana Bioluminescent Em Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Aprenda a usar imagem por bioluminescência em corpo inteiro para estudar o tráfego bacteriano em camundongos vivos. Este método permite monitorar o crescimento bacteriano em xenotransplantes tumorais de forma não invasiva.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio relevante para este manuscrito da Comissão Europeia Sétimo Programa-Quadro (PIOF-GA-2009-255466) e do Conselho de Pesquisa irlandês Saúde (HRA_POR/2010/138). Lux-marcado E. coli foi um presente tipo de Dr. Cormac Gahan, Universidade College Cork.

1. Indução de tumores <ol><li> Para a indução do tumor de rotina, a dose tumorigénica mínima de células em suspensão em 200 uL de meio isento de soro da cultura foi injectado por via subcutânea (sc) no flanco de infecção livre 6-8 semanas de idade, ratinhos fêmea Balb / C ou atímicos MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Reino Unido) (1 x 10 6 células 4T1), utilizando uma agulha de seringa de calibre 21. A viabilidade de células utilizadas para inoculação foi superior a 95%, tal como determinado por contagem visual utilizando um hemocitómetro e Exclusão Trypan Blue Dye (Gibco). </li><li> Seguindo estabelecimento do tumor, os tumores foram deixados crescer e desenvolver e foram monitorados duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula V = (ab 2) Π / 6, em que a é o diâmetro maior do tumor e b é o maior diâmetro perpendicular ao diâmetro a. </li></ol> 2. Preparação bacteriana <ol><li> A estirpe bacteriana utilizada neste protocoEu era E. coli K-12 MG1655, um não-proteína toxina que expressam, estirpe portadora de um plasmídeo que codifica luxABCDE que permite que as bactérias a ser detectada pelo BLI. E. coli MG1655 contendo o luxABCDE integrado foi cultivada aerobicamente a 37 ° C em meio LB (Sigma-Aldrich, Irlanda) suplementado com 300 ug / ml de eritromicina (Em). O derivado de bioluminescente MG1655 foi criada usando o plasmídeo p16S lux que contém a P AJUDA constitutiva luxABCDE operon 1. </li><li> Para a preparação para a administração a ratinhos, as culturas foram incubadas em meio LB a 37 ° C num agitador a 200 rpm a mid-log de fase (densidade óptica a 600 nm). As bactérias foram colhidas por centrifugação (6000 xg durante 5 min), lavadas com PBS (Sigma), diluído em PBS e 1 x 10 7 unidades formadoras de colónias (ufc) / ml para administração IV, ou 1 x 10 10 por meio de sonda. </li></ol> 3. Administração bacterianação <ol><li> Os ratos foram aleatoriamente divididos em grupos experimentais quando os tumores atingiram cerca de 100 mm 3 em volume. Para administração intravenosa, os ratos receberam cada conteve 10 6 células em 100 uL, injectado directamente para dentro da veia lateral da cauda utilizando uma agulha de seringa de 28G. A contagem de viáveis ​​de cada inoculo foi determinada por plaqueamento retrospectiva. </li><li> Para os estudos de colonização GIT, 10 9 células bacterianas foram administradas oralmente em 100 ul por rato por gavagem, em três dias consecutivos. Pré-existentes comensais níveis bacterianos foram reduzidos, antes da alimentação, por adição de 5 mg de estreptomicina / ml, em água potável rato durante 7 dias antes do início de uma sonda oral. </li></ol> 4. Imagem de bioluminescência <ol><li> 2D in vivo BLI imagem foi realizado usando o IVIS100 (Caliper). No tempo definido após a administração pontos bacteriana, os ratos foram anestesiados usando XGI-8 Caliper Anestesia GasSistema com Isofluorano 3%, e em todo o corpo a análise de imagens foi realizada nos 100 IVIS sistema para 2-5 min com uma sensibilidade elevada. </li><li> Para imagens em 3D, os ratos anestesiados foram colocados em um ônibus de imagem do rato dentro do sistema de imagem óptico para imagens dorsal (IVIS Spectrum, Caliper). Para a aquisição de imagens do sinal de luciferase bacteriana para a reconstrução 3D óptica, comprimentos de onda de emissão de filtro que variam 500-580 nm foram utilizados com caixa 16 tempos de aquisição de 3-4 min por filtro para maximizar a relação sinal-ruído. Como parte desta sequência de aquisição de imagem, uma imagem de luz estruturada foi obtida para definir um mapa de altura. Este mapa foi difuso de luz de entrada de imagem de tomografia (DLIT) reconstruções algoritmos que foram utilizados para formar uma imagem 3D óptico usando um não-negativo, pelo menos optimização quadrados 2. </li><li> Análise de Imagem: Regiões de interesse foram identificados e quantificados utilizando software imagem viva (Caliper). </li></ol> 5. RepresentanteResultados Neste estudo, as bactérias não patogénicas de E. coli comensal K-12 MG1655 expressando o operão luxABCDE IV foi administrada a ratos portadores de tumores de xenoenxerto sc 4T1. Bacterial lux sinal foi detectado especificamente em tumores de ratos pós-administração IV (Figura 2). Recuperação da cultura de bactérias a partir de ratinhos de amostra valida a existência de uma relação linear entre o número de bactérias viáveis ​​bem como a quantidade de luz detectada (Figura 3). In vivo imaging-administrados por via oral de bactérias comensais na GIT é também conseguida utilizando 3D BLI. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1highres.jpg"/> Figura 1. Protocolo Timeline. Tumores subcutâneos são induzidas em ratos, e as bactérias administrado mediante o desenvolvimento de tumores (100 mm 3). Camundongos vivos são BLI imenvelhecido a administração pós vários pontos temporais bacteriana (setas exibir vezes típicas). <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A administração de E. luxABCDE coli MG1655 a ratinhos portadores de tumor. tumores subcutâneos 4T1 foram induzidos em MF1 nu / nu e E. luxABCDE coli MG1655 administrado mediante o desenvolvimento de tumores. Cada animal recebeu 10 6 células injectadas directamente na veia lateral da cauda. Ratos foram fotografadas em quatro momentos durante o estudo (pontos pretos eixo z e imagens) com subsequente recuperação de células viáveis ​​(cfu) de tumores de ratinhos sacrificados amostra (gráfico de barras). Aumento no número de bactérias e expressão gênica plasmídeo especificamente nos tumores foi observada ao longo do tempo (mouse representante ilustrado por ponto de tempo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4318/4318fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Relação entre intratumoral Números bacteriana e Bioluminescência. Bactérias viáveis ​​em tumores foram enumerados pelo ex vivo cultura bacteriana de tumores após a BLI em vários pontos temporais pós administração IV. Os valores de log de ​​números bacterianas (cfu) em relação a unidades vivo bioluminesce estão representados graficamente. Uma correlação estreita entre as contagens bacterianas e sinais de bioluminescência é observada R 2 = 0,9717 1. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Imagem 3D IVIS do trato gastrointestinal Murino colonizada por E. coli MG1655. O GIT de ratinhos foi colonizada por administração oral de 10 9 CFU de E. coli durante três dias consecutivos. A imagem de amostra isolada de tomografia 3D do mouse colonizado é mostrado.Imagens em 3D mostram um atlas do mouse digital do esqueleto para fornecer registro anatômico. E. bioluminescência coli MG1655 é visível em verde na inferior, e roxo em níveis mais elevados.

<ol><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Postgrad+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for prostate cancer.</a> Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).</li>
<li>Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+targeting+with+systemically+administered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumour targeting with systemically administered bacteria.</a> Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+cancer+immunotherapy%3A+which+vector+for+which+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy.</a> Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).</li>
<li>Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditions+required+for+tumor+colonization+by+intravenously+delivered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).</li>
<li>Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+as+vectors+for+gene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Bacteria as vectors for gene therapy of cancer.</a> Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bifidobacteria+as+vehicles+for+delivery+of+agents+to+systemic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors.</a> Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).</li>
<li>van Pijkeren, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Listeria+monocytogenes-based+DNA+delivery+system+for+cancer+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+effective+antitumor+response+after+mucosal+bacterial+vector+mediated+DNA+vaccination+with+endogenous+prostate+cancer+specific+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen.</a> J. Urol. 186, 687-693 (2011).</li>
<li>Riedel, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+luciferase+tagging+system+for+Listeria+monocytogenes+allows+real-time+monitoring+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+prodrug-activating+bacteria+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy.</a> Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).</li>
<li>Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+intestinal+colonization+by+Escherichia+coli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+For+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">PET Imaging For Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Tangney, M., Francis, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optical+Imaging+in+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

No contexto da terapia genética, o uso de agentes biológicos para a entrega de genes terapêuticos para pacientes mostrou uma grande promessa 3-5. Como vírus, as propriedades biológicas de bactérias inatas permitir a entrega eficiente do ADN a células ou tecidos, em particular no contexto do cancro. Tem sido demonstrado que as bactérias são naturalmente capazes de homing para tumores quando administrados sistemicamente, resultando em níveis elevados de replicação localmente, quer externas (para não-invasivos e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Linha celular 4T1 </td><td> ATCC </td><td> CRL-2539 </td><td> Modelo de cancro da mama singeneico derivado de um tumor espontâneo resultante BALB / c mamária </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td> Meio de Dulbecco Modificado de Eagle </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8537 </td><td> Solução salina tamponada com fosfato </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td> IVIS 100 para 2D imagem; IVIS Spectrum para 3D. </td></tr><tr><td> Luria Broth Miller (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2542 </td><td> O meio de crescimento para E. coli </td></tr&gt; <tr><td> Eritromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5389 </td><td> Antibiótico </td></tr><tr><td> Estreptomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9137 </td><td> Antibiótico </td></tr><tr><td> Camundongos MF1nu/nu </td><td> Harlan (UK) </td><td> 069 (nu) / 070 (nu / +) </td><td> Hsd: atímicos nu-Foxn1nu </td></tr><tr><td> Camundongos Balb / c </td><td> Harlan (UK) </td><td> 066 </td><td> Haplotipo H-2 d </td></tr><tr><td> Agulha de gavagem </td><td> Vet-Tech Solutions (UK) </td><td> DE009 </td><td> 22G x 38mm agulha reta gavagem </td></tr><tr><td> Seringa para injeção IV </td><td> BD BioSciences </td><td> 309309-1 ml </td><td> Seringa de insulina com 28 x ½ polegadas G micro-agulha fina IV. </td></tr><tr><td> Seringa para inoculação do tumor </td><td> Braun </td><td> 9161376V </td><td> Omnifix 26 G x &amp;frac12; agulha polegadas </td></tr></tbody></table>

imagem bacteriana bioluminescent<em&gt; em vivo</em

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Este vídeo descreve o uso de todo o corpo bioluminesce imaging (BLI) para o estudo de tráfico bacteriana em ratos vivos, com ênfase no uso de bactérias na terapia génica e celular para o cancro. As bactérias presentes uma classe atraente de vetor para terapia de câncer, possuindo uma capacidade natural de crescer preferencialmente dentro de tumores após a administração sistêmica. As bactérias manipuladas para expressar o gene lux cassete autorização BLI detecção das bactérias e simultaneamente locais tumorais. A localização e níveis de bactérias ao longo do tempo dentro de tumores pode ser facilmente examinado, visualizado em duas ou três dimensões. O método é aplicável a uma ampla variedade de espécies bacterianas e tipos de xenoenxertos de tumor. Este artigo descreve o protocolo para a análise de bactérias bioluminescentes dentro ratinhos portadores de tumores subcutâneos. A visualização das bactérias comensais no tracto gastrointestinal (TGI) por BLI é também descrito. Este poderoso e barato, em tempo real representação estratégia de imagemts um método ideal para o estudo da bactéria in vivo no contexto da pesquisa de cancro, em particular, a terapia génica, e doenças infecciosas. Este vídeo descreve o procedimento para estudar lux-marcado E. coli em murganhos vivos, demonstrando a leitura espacial e temporal BLI alcançável utilizando o sistema IVIS.

Este artigo descreve a administração de<em&gt; Lux-marcado</em&gt; Bactérias a ratos e subseqüentes<em&gt; In vivo</em&gt; Análise usando IVIS imagem de bioluminescência.

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

Este vídeo descreve o uso de imagem por bioluminescência de corpo inteiro (BLI) para o estudo do tráfego bacteriano em camundongos vivos, com ênfase no uso de ...

Este vídeo descreve o uso da imagem bioluminescente de corpo inteiro para o estudo do tráfego bacteriano em camundongos vivos, com ênfase na detecção da multiplicação bacteriana em xenoenxertos tumorais. As bactérias representam uma classe atrativa de vetor para terapia contra o câncer, possuindo a capacidade natural de crescer preferencialmente dentro de tumores, após administração intravenosa, multiplicando-se externamente ou no interior das células tumorais. Cepas bacterianas modificadas para expressar o cassete gênico lux permitem a detecção simultânea das bactérias e dos tumores. O valor do monitoramento longitudinal não invasivo de cepas bacterianas in vivo é amplamente reconhecido, reduzindo o uso de animais e gerando dados mais estatisticamente relevantes do que os ensaios de ponto final.Este procedimento envolve a indução de tumores subcutâneos em camundongos. Os tumores são permitidos desenvolver e monitorados ao longo do tempo. Bactérias são administradas e os camundongos são submetidos à imagem de bioluminescência em pontos de tempo determinados para os experimentos aqui descritos.Tumores subcutâneos são induzidos em camundongos de um fundo imunocompetente ou timectomiz

Research

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

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Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

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Fonte: Wang, Y., et al. In Vivo Investigação da Terapia Antimicrobiana de Luz Azul para Infecções por Queimaduras por Acinetobacter baumannii multirresistente a medicamentos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o procedimento para imagem de infecções por queimaduras em camundongos inoculados com Acinetobacter baumannii que transportam um operon bioluminescente. Ele demonstra como a oxidação do substrato catalisada por luciferase produz luz proporcional à...

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Combinado imagiologia óptica e μCT num modelo de rato com infecção de implante ortopédico, utilizando uma estirpe bioluminescente engenharia de Staphylococcus aureus, desde a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente controlar a dinâmica da infecção bacteriana, assim como a resposta inflamatória correspondente e alterações anatómicas na osso.

Combinado<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT imagem para monitorar infecções, inflamações, and Bone Anatomy em uma infecção Orthopaedic Implant em Ratos

As infecções causadas por cepas bacterianas multirresistentes (MDR) surgiram como uma séria ameaça à saúde pública, necessitando do desenvolvimento de terapias alternativas. Apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia da terapia antimicrobiana com luz azul (aBL) para infecções por Acinetobacter baumannii MDR em queimaduras de camundongos usando imagens de bioluminescência.

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Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Bactérias bioluminescentes produçãode luz através de uma variedade de mecanismos, tais como detecção de quórum. Este novo método permite que a investigação em situ de bioluminescência e a correlação de emissão de luz a densidade celular. Um artificial bioluminescentes Escherichia coli sistema permite a caracterização de operons lux , Lux proteínas e sua interação.

In Situ Medição e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes

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Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Aprenda a usar imagem por bioluminescência em corpo inteiro para estudar o tráfego bacteriano em camundongos vivos. Este método permite monitorar o crescimento bacteriano em xenotransplantes tumorais de forma não invasiva.

Imagem bacteriana Bioluminescent

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