O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

O objetivo geral deste procedimento é cultivar biofilmes bacterianos sob força baixa ou moderada usando um reator de biofilme de fluxo de gotejamento ou um reator de disco rotativo. Os cupons no biofilme reagem à medida que são inoculados com bactérias e incubados a 37 graus Celsius para permitir que as células bacterianas adiram às superfícies de crescimento. Uma vez que as células se ligam aos cupons, um fluxo de meios de crescimento é iniciado, produzindo uma força absoluta que opera durante o desenvolvimento do biofilme.

Os biofilmes maduros podem então ser colhidos para análise e observação dos biofilmes. O uso de microscopia eletrônica de varredura pode ser realizado para determinar a ultraestrutura dos biofilmes produzidos. Eu sou Blaze Balls.

A principal vantagem dessa técnica de métodos existentes, como células de fluxo, é que a alta produção de biomassa e vários biofilmes idênticos são facilmente alcançados. Demonstrando este procedimento estarão Rachel Stevenson e Kelly Schwartz, uma técnica e estudante de pós-graduação do meu laboratório. O reator de biofilme de fluxo de gotejamento consiste em quatro câmaras com portas de entrada para entrada de mídia e portas de saída para saída de resíduos.

Dentro de cada câmara há um cupom removível sobre o qual o biofilme cresce. Para montar o reator de biofilme de fluxo de gotejamento, coloque os cupons em cada câmara paralela e prenda as tampas da câmara. Autoclave o reator montado, bem como a tubulação de nutrientes fluente para esterilizar o sistema antes do uso.

Também autoclave o meio de crescimento de biofilme para inocular o reator de fluxo de gotejamento esterilizado. Coloque o aparelho em uma superfície plana e prenda as linhas de efluentes. Em seguida, encha cada câmara com 10 mililitros de meio de crescimento estéril à base de caldo de soja tríptico e adicione 100 microlitros de staphylococcus aureus.

Cultura noturna cultivada no mesmo meio para cada câmara separadamente. Coloque o reator inoculado em uma incubadora a 37 graus Celsius por 18 horas para permitir que as células adiram à superfície do cupom. Após a incubação, a UNC prende a tubulação do efluente e coloca o reator em um cortador de blocos de madeira inclinado em um ângulo de 10 graus. Assepticamente.

Conecte o tubo de nutrientes fluente a uma garrafa contendo caldo de nutrientes de fluxo contínuo. Passe a linha de tubulação pela bomba e prepare a tubulação operando a bomba em velocidade máxima. Assim que o tubo fluente estiver preparado, pare a bomba e conecte agulhas de calibre 22 de uma polegada na extremidade de cada tubo.

Limpe a tampa de entrada da câmara com um pano de etanol e assepticamente. Insira as agulhas através da tampa de entrada. Ligue a bomba e deixe o meio pingar sobre os cupons.

A uma taxa de fluxo de aproximadamente 125 microlitros por minuto, o meio deve fluir para baixo da porta de entrada para a porta de efluente. Operar o reator em fluxo contínuo por três dias. Ocasionalmente, verificar se o reator está com a drenagem adequada.

A drenagem é verificada por inspeção visual das câmaras para garantir que o meio não esteja se acumulando nas câmaras. Se o meio estiver se acumulando, comprimindo, a tubulação de saída geralmente promoverá a drenagem adequada para colher os biofilmes, parar a bomba e remover as agulhas do reator. Em seguida, coloque o reator em uma superfície plana.

Após três dias de fluxo contínuo, os biofilmes de Staphylococcus aureus aparecem como biomassa amarela espalhada ao longo do comprimento dos cupons inoculados. Uma micrografia eletrônica de varredura do biofilme revela staphylococcus aureus cobrindo o cupom em uma comunidade de biofilme associada à superfície. Para quantificar a biomassa obtida, use uma pinça estéril para septicamente, remova os cupons, colha as bactérias usando um raspador de células e transfira-as para um tubo cônico contendo cinco mililitros de PBS estéril.

Usando um tecido, o homogeneizador desagrega os aglomerados bacterianos até obter uma suspensão uniforme. As unidades formadoras de colônias são quantificadas por diluições seriais em placas trípticas de sogar, incubando por 24 horas a 37 graus Celsius e contando colônias. O reator de biofilme de disco rotativo é composto por uma estatística de quimioterapia através da qual o meio de crescimento é bombeado.

Um disco giratório com uma barra de estrela e 18 cupons projetados para caber no disco giratório. Para montar o reator primeiro, carregue os cupons do disco giratório nos slots do disco giratório. Em seguida, coloque o disco carregado dentro de um copo de vidro de um litro com uma porta de transbordamento e tampe o reator com uma rolha de borracha número 15 com um orifício para fluxo de mídia e um orifício para aeração.

Autoclave, o reator montado e a tubulação de entrada para esterilizar o sistema. Para inocular o reator, encha o béquer com 250 mililitros de meio de cultura estéril e adicione 500 microlitros de uma cultura noturna de Staphylococcus aureus cultivada em caldo de soja tríptico. Coloque o reator em uma placa de agitação ajustada a 250 rotações por minuto e incube-o durante a noite a 37 graus Celsius para permitir que as células adiram aos cupons.

Após a incubação durante a noite, conecte a tubulação de entrada à porta do reservatório médio e à bomba peristáltica. Ligue a bomba e ajuste o fluxo para 0,25 mililitros por minuto. Deixe o reator funcionar por 24 horas a 37 graus Celsius para colher os biofilmes resultantes.

Pare o reator e assepticamente. Remova o disco sem tocar nos cupons. Usando uma pinça estéril, remova os cupons e mergulhe cuidadosamente cada um em PBS estéril para remover bactérias frouxamente aderidas para testes de compostos antimicrobianos.

Assepicamente, coloque os cupons em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo compostos de interesse. Incube a placa por quatro horas a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira os cupons para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo uma vez PBS e disperse os biofilmes usando um homogeneizador.

Finalmente, diluições seriadas em placas das células em meio de ágar nutriente para determinar o número de unidades formadoras de colônias viáveis por amostra, conforme descrito anteriormente. Este gráfico mostra o número de unidades formadoras de colônias em biofilmes preparados usando o reator de disco giratório e expostos ao peróxido de hidrogênio, a capacidade de produzir até 18 biofilmes idênticos. O uso do reator de disco giratório torna essa técnica ideal para testes de compostos antimicrobianos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar biofilmes de fluxo de gotejamento e reator de disco rotativo. Esses reatores de biofilme oferecem alternativas aos biofilmes de células de fluxo e placas de microtitulação e são ideais quando uma grande quantidade de biomassa de biofilme é necessária ou testes antimicrobianos em biofilmes estabelecidos são desejados.