Name: O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a cultivar biofilmes bacterianos de Staphylococcus aureus usando reatores de fluxo de gotejamento e reatores de disco rotativo. Este método permite produzir alta biomassa para análise de microscopia eletrônica e testes antimicrobianos.

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NIAID conceder K22AI081748.

1. O gotejamento Reactor Biofilm Fluxo <ol><li> O reator de biofilme fluxo de gotejamento (disponível a partir Technologies Biosurface ou personalizado versões projetadas geralmente pode ser feita por oficinas de mecânica da universidade, ver Figura 1) é montado e autoclavada. Assembléia envolve cupons aposição em câmaras e as tampas de câmara de segurança. A câmara, juntamente com o meio biofilme (caldo tripticase soja 2 gramas / L e glicose de 2 gramas / L), e tubos de nutrientes influentes são esterilizados em autoclave. </li><li> Inoculação do reator de fluxo de gotejamento é pré-formado, colocando o reator em uma superfície plana, de fixação das linhas de tubulação de efluentes, preenchendo cada uma das câmaras com 10 mL de caldo de soja tríptica e adicionando 10 mL de um S. cultura aureus cresceu durante a noite em caldo tripticase soja. O reator é inoculado em seguida, coloque em uma incubadora de 37 ° C por 18 horas. </li><li> Após 18 horas de incubação, o tubo efluente é despinçada eo reator é colocado em um bloco de madeira cortada a um ângulo de 10 °. </li><li> Assepticamente conectar a tubulação influentes de nutrientes para o frasco contendo o caldo nutriente fluxo contínuo. Alimentar a linha de tubos através da bomba e os tubos principais, executando a bomba a uma velocidade máxima (irá variar dependendo do modelo da bomba). </li><li> Uma vez que a tubulação afluente está preparado parar a bomba e anexar agulhas connect (calibre 22, 1 polegada) ao final de cada tubo. Limpe a tampa de entrada de câmara com uma limpeza e assepsia do etanol inserir as agulhas através da rolha de entrada. </li><li> Ligue a bomba e deixe que a mídia lentamente por gotejamento (taxa de fluxo de ~ 125 mL / minuto) ao longo dos cupons. A mídia deveria fluxo descendente ao longo do vale do porto rolha de entrada para o porto de efluentes. Operar o reator em fluxo contínuo por 2-5 dias (dependendo da aplicação), ocasionalmente verificar o reator para a drenagem adequada. </li><li> Para colher o gotejamento biofilmes reator de fluxo, parar a bomba e remova cuidadosamente as agulhas do reator. O reator pode ser colocado sobre uma superfície plana e os cupons podem ser assepticamente removidos com pinças estéreis. Se microscopia é desejado, os cupons podem ser processados ​​em conformidade (Figura 2B é uma micrografia eletrônica de varredura de um biofilme de S. aureus cresceu em um reator de biofilme por gotejamento). Se a quantificação da biomassa do biofilme ou estudos de fisiologia são o objetivo do estudo, o biofilme pode ser removida do cupom usando um raspador de celular. Enquanto mantém os cupons com uma pinça, raspe o biofilme off o cupom em um tubo cônico contendo tampão fosfato salino com uma espátula celular. Nota: para quantificar a unidades formadoras de colônias nos biofilmes, é necessário homogeneizar os biofilmes colhida com um lenço de papel homogeneizador para desagregar aglomerados e formar uma suspensão homogênea. Vários modelos de homogeneizadores de tecidos são adequados para esta aplicação. Nós utilizamos um Fisher Scientific Tissuemiser Homogeneizador (produto # 15-338-420) em velocidade máxima durante 1 minuto para homogeneizar as amostras de biofilme. Falta de homogeneizar o biofilme irá resultar em uma subestimação da unidades formadoras de colônias presentes na amostra. </li></ol> 2. O Reactor Biofilm Rotating Disk <ol><li> O reator de biofilme rotação do disco (disponível disponível a partir Technologies Biosurface ou podem ser feitos, veja a Figura 3) é montado e autoclavada. Montar o reator por primeiro lugar a fiação cupons disco nas ranhuras do disco de fiação e colocá-lo em uma proveta de vidro de 1 litro com uma porta de overflow. A número 15 de borracha rolha com furos nele para permitir o fluxo de mídia e aeração é usado como a tampa do reator. O reator, biofilme media (caldo tripticase soja 2 g / L e glicose 2 g / L), e tubulação de entrada são, então, esterilizados em autoclave. </li><li> O reator de biofilme rotação do disco é inoculada, colocando 250 mL de meio estéril para o reator, e adicionando 0,5 mL de uma noite de S. cultura aureus cultivadas em caldo tripticase soja. O reator é então colocado em uma placa de agitação ajustado para 250 rpm e incubados durante a noite na temperatura desejada. </li><li> Após 16 horas de incubação conectar a tubulação de entrada para a porta no reservatório de médio e conectá-lo à bomba peristáltica. A bomba é, então, ligar e fluxo definido como ~ 0,25 mL / min (fluxo pode ser alterada dependendo da taxa de crescimento desejado). </li><li> Depois de 24 horas parada do reator e assepticamente remover o disco, sem tocar os cupons biofilme. Remove os cupons usando uma pinça estéril e mergulhe cada um em tampão fosfato salina para remover qualquer bactéria fracamente ligados. </li><li> Para os testes de compostos antimicrobianos, os chips podem ser colocados em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo compostos de interesse. Após a incubação, os chips são transferidos para tubos de 1,5 mL de microcentrífuga contendo 1 mL de tampão fosfato salina e homogeneizado com um lenço de papel homogeneizador para dispersar o biofilme intacta. </li><li> Células são então diluídas em série e semeados em ágar nutriente para determinar viável colônia formiunidades ng. </li><li> Nota: muitas variações podem ser feitas no protocolo acima. Por exemplo, disco giratório cupons podem ser revestidos com ou feito de potenciais compostos anti-biofilme para testar a eficácia. Dispersantes biofilme pode ser avaliada também estar a incubar cupons em compostos dispersantes e bactérias quantificar anexado contra destacados. </li></ol> 3. Resultados representante Um exemplo de um conjunto de reator de fluxo de gotejamento é mostrado se a Figura 1. Após três dias de fluxo de grandes quantidades de biofilme se acumulam na superfície do cupom, Figura 2A. A biomassa total irá variar de acordo com cepas bacterianas e condições de crescimento precisa. A micrografia eletrônica de varredura de um S. biofilme aureus cresceu no reator de fluxo de gotejamento é mostrado na Figura 2B. Um reator de disco rotativo é mostrado na figura 3A. O protocolo descrito podem ser adaptados às necessidades específicas de qualquer microorganismo geralmente capaz de formar um biofilme. Figura 3B mostra o disco giratório com 18 discos de plástico aposta. Estes biofilmes disco-grown são particularmente bem adaptado para testes antimicrobianos e produzir resultados altamente reprodutíveis 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gotejamento configuração do reator de fluxo. Componentes importantes são rotulados. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Exemplo de um fluxo de gotejamento S. biofilme aureus. A) O biofilme foi cultivado por três dias após o protocolo descrito. Tampas das duas primeiras câmaras do reator são removidos para mostrar a S. amarela biomassa biofilme aureus. B) Sacnning micrografia eletrônica de um S. biofilme aureus cresceu no reator de fluxo de gotejamento. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. O reator disco rotativo. A) Exemplo de um reator de disco executando spinning. Componente-chave são rotulados. B) Feche acima da vista de um disco giratório.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Biofilmes cultivados em reatores diferentes, muitas vezes, têm características diferentes e cada reator tem aplicações diferentes. Neste trabalho, descrevemos a utilização de dois reatores de biofilme: um reator de biofilme por gotejamento e um reator de fluxo de disco rotativo. Reatores de fluxo de gotejamento são úteis para o crescimento de biofilmes baixo cisalhamento de uma interface ar-líquido e são adaptáveis ​​a uma variedade de condições. Encontramo-las extremamente conveniente para estudos, onde uma grande quan...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Reatores de Fluxo por Gotejamento</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Reatores de Disco Rotativo</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o uso do fluxo de gotejamento e reatores de disco rotativo para staphylococcus aureus análise de biofilme

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

A maioria dos micróbios na natureza são pensados ​​para existir como superfície associados comunidades em biofilmes. Um biofilme bacteriano são encerradas dentro de uma matriz e anexado a uma superfície de formação de biofilmes. 2 e desenvolvimento são comumente estudados em laboratório, utilizando sistemas de lote, tais como placas de microtitulação ou fluxo sistemas, tais como o fluxo de células. Estas metodologias são úteis para triagem bibliotecas mutante e química (placas de microtitulação) 3 ou crescente biofilmes para visualização (células de fluxo) 4. Aqui apresentamos protocolos detalhados para Staphylococcus aureus crescendo em dois tipos adicionais de biofilmes sistema de fluxo: o gotejamento reator biofilme fluxo e reator de biofilme rotação do disco. Reatores de gotejamento biofilme de fluxo são projetados para o estudo de biofilmes cultivados sob condições de cisalhamento baixa. 5 O reator de fluxo de gotejamento consiste em quatro canais de teste em paralelo, cada um capaz de manter um padrão de vidro cupom lâmina de microscópio de tamanho, ou um comprimento de cateter ou stint. O reator de fluxo de gotejamento é ideal para monitoramento microsensor, estudos gerais biofilme, as amostras de biofilme cryosectioning, alta produção de biomassa, as avaliações material médico e teste de dispositivo de habitação médica. 6,7,8,9 O reator de disco giratório consiste em um disco de teflon contêm recessos para cupons removível. 10 Os cupons podem removível pelo feito de qualquer material usinável. A parte inferior do disco rotativo contém um ímã de barra para permitir a rotação de disco de corte para criar superfície do líquido sobre a superfície de descarga cupons. Todo o disco contendo 18 cupons é colocado em um copo mL mil vaso do reator lado-braço. Um meio de crescimento líquido é circulado através do navio enquanto o disco é girado por um agitador magnético. Os cupons são removidos do reator e, em seguida, raspado para coletar a amostra de biofilme para estudos adicionais ou imagens de microscopia. Reatores disco rotativo são projetados para avaliações laboratoriais de eficácia biocida, a remoção do biofilme eo desempenho do anti-incrustantes materiais. 9,11,12,13

Protocolos para a utilização de biofilmes fluxo de abrir o sistema com reatores de fluxo de gotejamento e girando reatores disco são apresentadas em detalhe.

O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

Acredita-se que a maioria dos micróbios na natureza exista como comunidades associadas a superfícies em biofilmes.1 Os biofilmes bacterianos são envoltos por uma matriz e aderidos...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar biofilmes bacterianos sob força de cisalhamento baixa ou moderada, utilizando um reator de fluxo por gotejamento ou um reator de disco rotativo. As cunhas no reator de biofilme são primeiramente inoculadas com bactérias e incubadas a 37 graus Celsius para permitir que as células bacterianas adiram às superfícies de crescimento. Uma vez que as células tenham se fixado nas cunhas, inicia-se um fluxo de meio de crescimento, gerando uma força de cisalhamento que atua durante o desenvolvimento do biofilme.Os biofilmes maduros podem então ser colhidos para análise e observação. Pode-se realizar microscopia eletrônica de varredura para determinar a ultraestrutura dos biofilmes produzidos. Eu sou Blaze Balls.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como células de fluxo, é que permite obter facilmente alta produção de biomassa e múltiplos biofilmes idênticos. A demonstração deste procedimento será feita por Rachel Stevenson e Kelly Schwartz, uma técnica e uma aluna de pós-graduação do meu laboratório. O reator de biofilme por fluxo gotejado consiste em quatro câmaras com portas de entrada para o meio de cultura e portas de saída para o escoamento de resíduos.Dentro de cada câmara há um cupom removível no qual o biofilme cresce. Para montar o reator de biofilme de fluxo contínuo, coloque os cupons em cada câmara paralela e fixe as tampas das câmaras. Autoclave o reator montado, bem como os tubos de nutriente de entrada, para esterilizar o sistema antes do uso.Também esterilize em autoclave o meio de crescimento para biofilme para inocular o reator de fluxo por gotejamento esterilizado. Coloque o equipamento sobre uma superfície plana e prenda as linhas de efluente. Em seguida, encha cada câmara com 10 mililitros de meio de crescimento estéril à base de caldo triptico de soja e adicione 100 microlitros de staphylococcus aureus.Cultura mantida durante a noite cresceu no mesmo meio em cada câmara separadamente. Coloque o reator inoculado em uma incubadora a 37 graus Celsius por 18 horas para permitir que as células aderissem à superfície do disco. Após a incubação, prenda com grampos UNC a tubulação de efluente e coloque o reator sobre um bloco de madeira inclinado a um ângulo de 10 graus. De forma asséptica.Conecte o tubo de nutriente fluente a um frasco contendo caldo nutritivo de fluxo contínuo. Passe a linha do tubo pela bomba e escarre o tubo operando a bomba em velocidade máxima. Uma vez que o tubo fluente esteja escarreado, pare a bomba e conecte agulhas de calibre 22 com um polegada de comprimento à extremidade de cada tubo.Limpe o tampão da entrada da câmara com um lenço umedecido em etanol de forma asséptica. Insira as agulhas através do tampão da entrada. Ligue a bomba e permita que o meio goteje sobre os discos.Com uma vazão de aproximadamente 125 microlitros por minuto, o meio deve fluir de cima para baixo, desde a porta da rolha de entrada até a porta de efluente. Opere o reator em fluxo contínuo por três dias. Verifique ocasionalmente o reator para garantir a drenagem adequada.A drenagem é verificada por inspeção visual das câmaras para garantir que o meio não esteja acumulando nas câmaras. Se houver acúmulo de meio, pinçar o tubo de saída geralmente promove a drenagem adequada para colher os biofilmes, pare a bomba e remova as agulhas do reator. Em seguida, coloque o reator sobre uma superfície plana.Após três dias de fluxo contínuo, os biofilmes de Staphylococcus aureus aparecem como biomassa amarela espalhada ao longo do comprimento dos discos inoculados. Uma micrografia eletrônica de varredura do biofilme revela Staphylococcus aureus cobrindo o disco em uma comunidade de biofilme associada à superfície. Para quantificar a biomassa obtida, utilize pinças estéreis para remover os discos de forma asséptica, colher as bactérias usando um raspador celular e, em seguida, transferi-las para um tubo cônico contendo cinco mililitros de PBS estéril.Usando um tecido, desagregue os agregados bacterianos com um homogeneizador até obter uma suspensão uniforme. As unidades formadoras de colônia são quantificadas por meio do plaqueamento de diluições seriadas em placas de ágar triptico, incubadas por 24 horas a 37 graus Celsius, seguido de contagem de colônias. O reator de biofilme com disco rotativo é composto por um quimostato pelo qual o meio de crescimento é bombeado.Um disco giratório com uma barra em forma de estrela e 18 corpos de prova projetados para encaixar no disco giratório. Para montar o reator, primeiro insira os corpos de prova do disco giratório nas ranhuras do disco. Em seguida, coloque o disco carregado dentro de um béquer de vidro de um litro com um orifício de transbordamento e tampe o reator com uma rolha de borracha número 15 com um orifício para fluxo de meio e outro orifício para aeração.Autoclave o reator montado e os tubos de entrada para esterilizar o sistema. Para inocular o reator, encha o béquer com 250 mililitros de meio de cultura estéril e adicione 500 microlitros de uma cultura de 24 horas de Staphylococcus aureus cultivada em caldo tripticase de soja. Coloque o reator sobre uma placa agitadora ajustada em 250 rotações por minuto e incube durante a noite a 37 graus Celsius para permitir que as células adiram aos discos.Após a incubação durante a noite, conecte a tubulação de entrada à porta do reservatório de meio e à bomba peristáltica. Ligue a bomba e ajuste o fluxo para 0,25 mililitros por minuto. Deixe o reator funcionar por 24 horas a 37 graus Celsius para colher os biofilmes resultantes.Pare o reator e, de forma asséptica, remova o disco sem tocar nas amostras. Usando pinças estéreis, remova as amostras e mergulhe cuidadosamente cada uma em PBS estéril para remover as bactérias fracamente aderidas antes do teste do composto antimicrobiano.De forma asséptica, coloque as amostras em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo os compostos de interesse. Incube a placa por quatro horas a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira as amostras para tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro contendo PBS 1x e disperse os biofilmes utilizando um homogeneizador.Por fim, plaque diluições seriadas das células em meio ágar nutriente para determinar o número de unidades formadoras de colônias viáveis por amostra, conforme descrito anteriormente. Este gráfico mostra o número de unidades formadoras de colônias em biofilmes preparados utilizando o reator de disco rotativo e expostos ao peróxido de hidrogênio, demonstrando a capacidade de produzir até 18 biofilmes idênticos. O uso do reator de disco rotativo torna esta técnica ideal para testes de compostos antimicrobianos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como operar biofilmes em reatores de fluxo gotejado e em reatores de disco rotativo. Esses reatores de biofilme oferecem alternativas aos biofilmes em células de fluxo e em placas de microtitulação, sendo ideais quando é necessário uma grande quantidade de biomassa de biofilme ou quando se deseja realizar testes antimicrobianos em biofilmes estabelecidos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Protocolo que descreve a aplicação de um sistema de célula de fluxo para o cultivo e análise de biofilmes microbianos para Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM).

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