Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

O objetivo geral deste procedimento é coletar dados representativos imparciais dentro de uma amostra limitada e analisar com precisão a complexa estrutura tridimensional do tecido. Isso é feito capturando primeiro fatias virtuais de imuno-histo, seções pancreáticas quimicamente coradas. Em seguida, os cortes virtuais são quantificados com a macro de fatias virtuais IHC no software image J, e os dados são analisados com scripts escritos para o Mathematica.

Em seguida, uma reconstrução 3D das fatias virtuais é realizada usando a Imagem J. A etapa final do procedimento é capturar uma pilha de imagens de ilhotas individuais usando o software de livro de slides e mapear as pilhas de imagens manualmente em três dimensões usando o investigador estéreo. Em última análise, a arquitetura precisa do ilhó com coordenadas 3D para cada célula do ilhó pode ser obtida por meio de um método combinado de imagem 3D e mapeamento manual. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos estudos de obesidade e diabetes, como como as condições fisiológicas e o caminho das condições fisiológicas afetam a pancreática, a massa de células beta, a distribuição de ilhós e a arquitetura.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico ou terapia da obesidade e diabetes Melitis porque uma melhor compreensão das mudanças na massa de células beta facilitará o desenvolvimento e a avaliação de intervenções terapêuticas. Embora os métodos descritos no presente estudo forneçam especificamente informações sobre a análise imuno-histoquímica dinâmica do pâncreas, também podem ser aplicados a uma série de outros organismos e tecidos. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de análise assistida por computador são difíceis de aprender.

Devido à complexidade de analisar conjuntos de dados tão grandes em duas e três dimensões. Comece este procedimento colocando uma lâmina limpa segurando uma seção inteira de um pâncreas quimicamente corado com imunohisto no suporte de um microscópio fluorescente. Abra o software de investigador estéreo e visualize a amostra clicando em aquisição.

E então imagem ao vivo. Determine os níveis de exposição para cada canal usando a janela de histograma de vídeo, que exibe a intensidade da fluorescência. Neste exemplo, o canal dois é usado para DAP, o canal P três para GFP, o canal quatro para RFP, o canal cinco para sci cinco e o canal seis para SCI sete.

Usando a janela de configurações da câmera, ajuste o nível de exposição para que a intensidade da fluorescência diminua. Na extremidade direita do histograma de vídeo, a imagem pode ser focada com a roda de foco do microscópio. Antes de criar uma fatia virtual, contorne a amostra clicando na tela em um ponto distante da amostra, que marcará um ponto de referência.

Em seguida, clique ao redor do contorno da amostra quando o contorno estiver concluído. Clique com o botão direito do mouse e selecione fechar contorno para conectar os pontos inicial e final quando o contorno for fechado, capture uma fatia virtual para a amostra selecionando aquisição e, em seguida, adquira a fatia virtual. Quando as opções da janela de fatia virtual forem abertas, selecione aquisição de alta velocidade, bem como desative o manual.

Focando desmarcando a caixa ao lado de manual. Salve o arquivo. Calibre o prefo clicando com o botão direito do mouse e selecionando adicionar à lista de sites de foco.

Focar manualmente várias seções aleatórias na visualização da fatia virtual Quando vários sites tiverem sido focados, inicie a fatia virtual clicando com o botão direito do mouse e selecionando. Inicie a fatia virtual com prefo depois que a fatia virtual for concluída para a primeira amostra, mude para o próximo canal e ajuste a exposição de acordo. Este procedimento é repetido para cada canal para realizar a quantificação dos ilhós, processar as imagens usando uma macro J de imagem chamada I-H-C-V-S, que primeiro prepara as imagens carregadas para análise e, em seguida, quantifica as características dos ilhós, como a composição celular.

As macros I-H-C-V-S dividem a pilha em seus respectivos canais de cores. Na imagem J converte cada imagem em uma máscara preta e branca de oito bits. Após a intensidade automática, o limite e adiciona as imagens de canal separadas juntas aritmeticamente em uma máscara composta.

A análise de partículas integrada da Image J na imagem composta identificará regiões de interesse ou ROIs, excluindo partículas menores que uma célula beta. A quantificação de ROIs. Usando a imagem J produz uma planilha de parâmetros de célula.

Salve os resultados agregados em uma planilha do Excel. Armazenando dados como circularidade do perímetro da área, diâmetro do fer e centro do ilhó para cada ilhó, juntamente com os números correspondentes rotulados na imagem. A análise computacional desses parâmetros pode ser realizada conforme descrito no protocolo escrito Para revelar informações, incluindo distribuição de ilhós e análise de frequência, execute a reconstrução 3D de fatias virtuais executando um script que converte todas as duas imagens JP no diretório em arquivos TIF, que é o formato usado na construção e quantificação de pilhas tridimensionais das fatias virtuais.

Aqui, um script chamado I MJ two two tiff é usado. Copie o script para o diretório que contém as duas imagens JP. Execute o script com o shell do Linux digitando dot slash I am JP two two TIFF no console e pressionando enter.

Quando todas as imagens capturadas tiverem sido convertidas de JP dois para arquivos TIFF, elas estarão prontas para serem usadas para análise na imagem J. Usando a imagem J, abra todas as imagens da primeira amostra, que neste caso são de um pâncreas fetal humano e mescle-as como uma selecionando imagem, cor, e, em seguida, mesclar canais. Repita esse processo para cada uma das amostras quando todas as amostras tiverem sido combinadas como imagens únicas. Limpe as imagens selecionando regiões indesejadas com a ferramenta de seleções de polígonos.

Preencha-os selecionando editar e, em seguida, preencha. Converta cada imagem em uma imagem colorida RGB. Por fim, crie uma pilha a partir das imagens, após a qual elas podem ser alinhadas com o plug-in de registro de pilha.

Em última análise, mesclar os canais e combinar as imagens cria uma montagem 3D de todos os ilhós em todo o pâncreas. Para coletar pilhas de imagens, posicione todo o ilhó pancreático de montagem sob o microscópio. Aplique água se estiver usando uma lente objetiva de imersão em água.

Abra o software do livro de slides, acesse o controle de captura e foco pressionando control plus shift mais E na janela de controle de foco. Defina a objetiva para 20 ou 40 vezes, dependendo do tamanho do ilhó. Para usar a ocular do microscópio para localizar os ilhós, defina o compartimento para duas vezes e defina o conjunto de filtros para o usuário um.

Na janela de controle de foco, a seleção de emissão deve ser definida como 100% Os olhos em densidade neutra devem ser definidos como um clique GFP ey e, em seguida, abra o chão para visualizar a amostra no livro de slides, retorne à janela de controle de foco e alterne o filtro definido para corrigir. Em seguida, clique em G-F-P-D-S. Use o joystick para centralizar o ilhó na câmera em uma janela da melhor maneira possível.

Concentre-se em uma profundidade em algum lugar próximo ao centro do ilhó, onde as células possam ser discernidas facilmente. Na janela de controle de foco, selecione o zab. Use o controle de escopo para rolar até a profundidade superior do ilhó na qual os recursos podem ser discernidos claramente e clique em definir topo.

Role até a parte inferior do ilhó e clique em definir. Clique inferior em ir. Para retornar ao ponto de referência na janela de captura, clique em avançado e, em seguida, em alternar para o modo de canal.

Defina o fator de compartimento como duas vezes e o tipo de captura como 3D no lado direito da janela, clique em usar posições superior e inferior e retorne ao volume central após a captura. Defina o tamanho da etapa como três. Defina o conjunto de filtros para residir abaixo da caixa do conjunto de filtros.

Selecione DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U e SCI cinco DSU. Para cada um, clique em localizar melhor em ajustar exposição. Em seguida, clique em testar para certificar-se de que a exposição selecionada é adequada.

Clique em iniciar para iniciar a captura. Quando a captura for concluída, ajuste os níveis conforme necessário e altere a cor exibida da RFP para branco. Salve o slide e vá para exibir a série TIFF de exportação.

Digite o nome do slide com um traço no final e salve-o. Dezenas de arquivos TIF individuais são criados, portanto, pode ser útil manter cada pilha de imagens de ilhós em uma pasta separada. Para mapear pilhas de imagens, abra o software de investigação estéreo.

Visualize a imagem abrindo as pilhas de imagens no menu de dimensionamento de imagem. Defina a distância entre as imagens para três mícrons para corrigir duas vezes a dobra. No livro de slides, selecione substituir a escala X e Y e use uma fonte especificada para a escala x e Y.

Digite 0,65 para o centro X e Y e amplie a imagem clicando no botão de zoom e, em seguida, no meio da imagem de interesse no mercado de janela macro, pelo menos uma célula. Usando o marcador apropriado, as células beta aparecerão verdes. As células alfa aparecerão vermelhas e as células delta aparecerão brancas.

Marque as células no centro de seu núcleo, que aparecerá em azul se a amostra tiver sido corada com DPI, use o marcador dois para marcar as células beta. Marcador cinco para marcar células alfa e marcador seis para marcar células delta. Uma vez que pelo menos uma célula tenha sido marcada, exiba a visualização ortogonal usando o ícone no menu superior, marque Filtro Z e simétrico.

O intervalo deve ser definido como 15,00. Começando no 0.0 Z.Percorra os ilhós usando a roda do mouse e marque cada célula com o marcador apropriado, marque cada célula apenas uma vez no centro de sua profundidade. Ao terminar de marcar cada um dos níveis Z, a caixa de seleção do filtro Z pode ser desmarcada.

Isso mostrará todos os marcadores de todos os níveis Z. Quando todas as células tiverem sido marcadas, salve o arquivo como um arquivo DAT. Em seguida, vá para o rastreamento de exportação de arquivo.

Salve o rastreamento como um arquivo TXT. Por fim, clique em novo arquivo de dados para limpar a área de trabalho antes de tentar mapear novos ilhós. A preparação de fatias virtuais a partir de uma amostra de pâncreas corada imuno-histoquímica permite o exame das células endócrinas alfa, beta e delta em todo o pâncreas, juntamente com a coloração imuno-histoquímica das ilhotas para insulina em verde, glucagon em vermelho, somatostatina em branco e dap em azul.

As imagens então convertidas para a máscara de oito bits após o limite automático. Aqui é mostrada a imagem composta de mesclagem. No entanto, a distribuição de ilhós usando fatia virtual também permite a análise individual em canais separados.

Aqui, as visualizações de cada canal são mostradas para revelar as células delta, células beta e células alfa. Análise de partículas realizada em cima de máscara composta mostrando cada estrutura de ilhós numerada e destacada em azul. A análise de partículas de máscaras compostas é gerada como uma tabela de dados contendo parâmetros como circularidade do perímetro da área de Islas e vários diâmetros para cada ilhó detectado, que possuem IDs que correspondem às tags numeradas na máscara composta.

A análise em larga escala dessas imagens resulta na produção de histogramas de distribuição de tamanho e número total de ilhós, bem como comparações detalhadas das áreas de células alfa, beta e delta. O mapeamento de ilhós e a análise matemática da composição e arquitetura celular podem revelar um único plano focal a partir de uma pilha reconstruída em 3D de imagens de um ilhós humano carregadas no investigador estéreo. Aqui, as células beta estão em verde, as células alfa em vermelho, as células delta em branco e os núcleos em azul.

Após a captura de ilhós distintos, as células alfa, beta e delta são marcadas em vários planos marítimos aqui, imagens fluorescentes e os dados de mapas correspondentes são mostrados para três planos focais diferentes em um intervalo de 10 mícrons. Uma vez que as células alfa, beta e delta tenham sido marcadas em vários planos, o ilhó pode ser visualizado em 3D. Aqui é mostrada uma reconstrução 3D do ilhó cortado com base nas coordenadas obtidas pelo mapeamento de ilhós.

Além disso, a análise matemática automatizada de ilhós mapeados pode exibir a composição e a arquitetura celular. Aqui, a frequência relativa das distâncias das células celulares entre duas células em uma única população de células é mostrada. Também é mostrada a frequência relativa das distâncias das células celulares entre duas populações de células diferentes.

Também são mostradas as probabilidades cumulativas das distribuições de distância célula a célula para células alfa para alfa, beta para beta e delta para delta. O teste cole OV smirnov ou KS pode ser realizado nessas probabilidades para obter as distâncias KS correspondentes. Uma vez dominado, a imagem e a análise em larga escala de uma seção inteira de tecido podem ser realizadas em quatro horas.

A reconstrução 3D de um bloco de tecido pode ser feita em 30 minutos. Finalmente, a imagem 3D e o mapeamento manual podem ser concluídos em quatro horas, se executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante começar com uma coloração imuno-histoquímica de alta qualidade das seções.

A precisão da análise subsequente dependerá dos dados brutos. Além disso, certifique-se de que seus computadores tenham pelo menos oito gigabytes de RAM para processar essa análise em larga escala após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores, não apenas no campo da obesidade e diabetes, mas amplamente em muitos outros campos que usam a análise patológica padrão.

Pode ser particularmente útil quando a disponibilidade de amostras é limitada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar dados representativos imparciais em um tamanho de amostra limitado usando técnicas padrão. Selecionar apenas uma região específica pode não ser representativo de todo o quadro, como mostramos usando nosso estudo de distribuição de ilhós pancreáticos.