Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o isolamento de células-tronco putativas de glândulas SIV de neurônios. Isso é feito pela primeira colheita de glândulas sali submandibulares de camundongos adultos. A segunda etapa do procedimento é usar uma tesoura curva para processar o tecido em uma polpa homogênea.

A terceira etapa do procedimento é digerir ainda mais o tecido usando colagenase e enzimas de lise superior. Deve-se tomar cuidado para não digerir demais o tecido. Como uma suspensão celular completa não produz muitas esferas, aglomerados de duas a três células são ideais.

A etapa final do procedimento é a filtração do homogeneizado através de filtros de 100 mícrons e 50 mícrons. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a cultura e o isolamento de células-tronco da glândula siv por meio do uso combinado de digestão mecânica e enzimática de glândulas SIV inteiras. As implicações desta técnica estendem-se à terapia da Xerostomia, também conhecida como boca seca, e que pode resultar do tratamento radioterápico.

As células-tronco das glândulas salivares podem ser usadas para resgatar a xerostomia em pacientes que sofrem de câncer de cabeça e pescoço antes de iniciar este procedimento. Prepare tampões, camundongos, cultura de glândulas salinas, meios e soluções enzimáticas. De acordo com o protocolo escrito que acompanha, todas as etapas de dissecção e cultura de tecidos devem ser realizadas em uma capa de cultura de tecidos estéril.

Depois de isolar e dissecar as glândulas salivares do camundongo, pese o tecido da glândula sali em uma balança e registre o peso. Use uma espátula para transferir as glândulas sali para uma pequena placa de Petri e, usando uma tesoura de dissecção curva, corte as glândulas sali em uma polpa homogênea. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta P 1000 para produzir uma abertura maior.

Use isso para pipetar um mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido para a placa de Petri e transferir o homogeneizado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Bata outro, mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido na placa de Petri. Para coletar quaisquer pequenos pedaços de tecido restantes, adicione esta solução ao tubo da centrífuga.

Em seguida, adicione rapidamente 250 microlitros de solução de cloreto de cálcio, 25 microlitros de solução de hialuronidase e 25 microlitros de colagenase. Duas soluções enzimáticas por 80 miligramas de tecido. Coloque o tubo contendo a mistura de tecido e enzima em um banho de água a 37 graus Celsius, agitando e incube por 20 minutos.

Após a incubação, remova os tubos. Use uma ponta P 1000 com a extremidade removida como antes para misturar completamente o tecido e a solução enzimática aproximadamente 10 vezes. Retorne o tubo ao banho-maria de 37 graus Celsius por mais 20 minutos.

Após o segundo período de incubação, centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade por oito minutos após a centrifugação, descarte o supinato e ressuspenda cuidadosamente o pellet em dois mililitros de tampão por 80 miligramas de tecido inicial. Em seguida, adicione mais 250 microlitros de solução de cloreto de cálcio, 25 microlitros de solução de hialuronidase e 25 microlitros de colagenase. Duas soluções enzimáticas por 80 miligramas de tecido.

E retorne o tubo ao banho-maria agitado de 37 graus Celsius por 20 minutos. Retirar os tecidos do banho-maria e repetir como incubações anteriores após a incubação. Centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade por oito minutos.

Mais uma vez e depois descartar o supinado. O tecido está agora pronto para ser lavado em preparação para filtragem após a centrifugação anterior. Pipete dois mililitros de tampão no tubo e triture o rasgo.

Suspender o palt de pellets após a suspensão do resus. Centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade por oito minutos. Em seguida, descarte a pipeta supinada.

Um mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido no tubo e novamente triturado. Para ressuspender o pellet. Repita a centrifugação.

Pise a 400 vezes a gravidade por oito minutos. Durante a centrifugação, prepare-se para a etapa de filtração colocando um filtro de tamanho de poro de 100 mícrons sobre um tubo de centrífuga de 50 mililitros após a centrifugação, descarte o supinato e pipete um último mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido no tubo. Usando uma ponta P 1000 com os cortadores de extremidade antes de pipetar para cima e para baixo para garantir que o pellet seja completamente ressuspenso.

Em seguida, transfira o homogeneizado para o filtro de tamanho de poro de 100 mícrons e deixe-o penetrar através do filtro para o tubo de centrifugação de 50 mililitros. É importante não aplicar mais de três mililitros de homogeneizado, pois o filtro pode ficar bloqueado. Se este volume for excedido, utilizar uma pipeta P 1000 para remover qualquer tecido que tenha se acumulado na parte inferior do filtro e transferir esse tecido para o tubo de centrifugação de 50 mililitros que contém o filtrado.

Usando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26, aspire o homogenato do tubo de centrífuga de 50 mililitros e aplique-o na tampa do filtro de tamanho de poro de 50 mícrons instalada sobre o tubo de cinco mililitros. Deixe o homogeneizado penetrar através do filtro. Se a filtragem for lenta, afrouxe a tampa do filtro muito apertada.

Uma vedação pode impedir a filtragem quando todo o homogeneizado passou pelo filtro para o tubo. Centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade por oito minutos. Após a centrifugação, as células peletizadas estão prontas para serem revestidas em placa.

As células das glândulas salivares começam suspendendo-as em um mililitro de meio MSG por 80 miligramas de tecido. Conte as células de acordo com os protocolos padrão. Aqui, um contador de células automatizado é usado para determinar o número de células.

Calcule o volume de suspensão celular necessário para 0,4 vezes 10 elevado a seis células e, a partir disso, o número de poços que podem ser semeados. Adicione um mililitro de meio MSG por poço a uma placa de cultura de 12 poços. Certifique-se de que a suspensão celular esteja bem misturada e adicione o volume necessário de suspensão celular por 0,4 vezes 10 às seis células de cada um dos poços.

Transfira as placas para uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após dois dias de incubação, examine as culturas quanto à presença de esferas SLOs e à falta de ás em nossas células. Este é um exemplo de tecido de glândula salivar de camundongo processado conforme descrito e visualizado por microscopia de contraste de fase de zero a 10 dias em cultura, os pequenos agregados de células são esferas SLOs, que crescem em tamanho ao longo desse período de tempo.

Aqui é mostrada a imunocoloração de uma cultura de esfera SLOs representativa de três a cinco dias para o marcador de células-tronco. Kit de proteína C. Conforme analisado por citometria de fluxo, a expressão do kit sea confirma a presença de células-tronco putativas nas culturas de SLOs de três a cinco dias de idade As esferas de SLOs também podem ser diferenciadas para formar estruturas semelhantes a sin e ductos com morfologia semelhante à da glândula salivar nativa.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar glândulas salivares, células-tronco de glândulas salivares murinas.