Name: Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco de glândulas salivares de camundongos usando digestão enzimática e mecânica. Este método permite cultivar salisferas com características de células-tronco para pesquisa em medicina regenerativa.

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1. Preparação Regent <ol><li> Buffer: 1% (w / v) de soro albumina bovina em solução salina balanceada de Hank </li><li> Enzimas reconstituir. Enzima hialuronidase: 40mg / mL, dissolvido em tampão. Colagenase II: 23mg / mL, dissolvido em tampão. Utilizar soluções recentemente enzima preparado fresco para cada isolamento. Quando dissolvido loja, a 4 ° C até o uso para a digestão. </li><li> 50 mM de cloreto de cálcio em água destilada. Filtro de esterilização através de um filtro tamanho 0,2 uM poros. </li><li> Glândulas salivares do rato meio de cultura (MSG): DMEM: F12 com penicilina (100 UI / mL), estreptomicina (100 mg / mL), Glutamax (2 mM), fator de crescimento epidérmico-2 (20 ng / mL), fator de crescimento de fibroblastos -2 (20 ng / mL), N2 suplemento (1%), a insulina (10 mcg / mL) e dexametasona (1 mM). </li></ol> 2. A digestão enzimática do tecido mecânico e <ol><li> Pesar as glândulas salivares dissecadas. </li><li> Pique glândulas em uma polpa homogênea usando uma tesoura esterilizada dissecção curvas em uma pequena placa de Petri. </li><li> Coletar tecido picada em 14 mL tubos, usando 1mL de tampão por tecido submandibular 80mg. Lave os pratos de Petri limpa de tecido usando algumas das buffer. </li><li> Adicionar outro 1 mL de tampão por 80 mg de tecido, seguido de 25 mL de solução de enzima colagenase II, 25 mL de solução de enzima hialuronidase e 250 mL de solução de cloreto de cálcio por 80 mg de tecido. Se trabalhar com grandes quantidades de tecido, as etapas 2,4-2,9 pode ser realizada em frascos de cultura de tecidos T25 por conveniência. </li><li> Incubar em banho-maria agitando-se a 37 ° C por 20 minutos. Remova os tubos e triturar com uma pipeta para misturar completamente enzima através do tecido novo. </li><li> Substituir em banho-maria por mais 20 minutos. </li><li> Coletar tecido por centrifugação a 400 xg, por 8 minutos. Elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender em 2 mL de tampão para cada tecido de 80 mg, e repita enzima ea adição de cloreto de cálcio como acima. Incubar 20 minutos em banho-maria agitando. Remova os tubos e triturar com uma pipeta para misturar enzimas completamente. </li><li> Incubar por 20 minutos finais em tremendo banho de água. Coletar células por centrifugação, tal como acima, elimine o sobrenadante. </li></ol> 3. Etapas de lavagem <ol><li> Ressuspender cada 80 mg de tecido em 2 mL de tampão e pipetar para lavar tecidos livres de enzimas. </li><li> Centrífuga como antes para coletar. Elimine o sobrenadante. </li><li> Repita lavagem usando um tampão por 80 mL de tecido mg. Centrífuga para coletar, elimine o sobrenadante. </li></ol> 4. Filtragem <ol><li> Ressuspender solução tecido em 1 mL de tampão por 80 mg de tecido. </li><li> Adicionar solução para filtro de 100 mm de poro de tamanho colocado mais de 50 tubos Falcon mL. Não aplique mais de 3 mL de solução de tecido picada por coluna, como filtros podem ficar bloqueados. Permitir a vazar. Remover o material filtrado pendurado na parte de baixo do filtro, com uma pipeta, e adicionar ao filtrado. </li><li> Use seringa com agulha de calibre 26 para tomar a partir de 50 mL filtrado tubos e aplicar filtros para 50 mm tamanho dos poros, em 5 tubos mL. Permitem filtrar, auxiliando soltando tampas, se necessário. </li><li> Tubos de centrífuga como antes para coletar. Elimine o sobrenadante. </li></ol> 5. Revestimento e Médio <ol><li> Combine todos os pellets em um volume. Contagem usando contador de células automatizado ou hemocitómetro. </li><li> Células da placa com uma densidade de 0,4 x 10 6 células por poço, de 12 bem-placa, ou 2,67 x 10 6 células por frasco de cultura de tecidos T25. Adicionar um meio MSG mL em cada poço ou 6 ml para cada frasco T25. </li><li> Incubar a 37 ° C. Esferas devem ser claramente visível de dia 2. </li></ol> 6. Resultados representativos: Depois de 2-3 dias em cultura, pequenos agregados de células (salispheres) será evidente nas culturas. Salispheres continuará a crescer em tamanho ao longo de um período de 10 dias em cultura. Representante fase de imagens de microscopia de contraste de salispheres são mostrados na Figura 1. Células em proliferação expressando as proteínas de células-tronco associada marcador pode ser isolado de tais esferas, otimamente entre os dias de isolamento pós 3-5, e são capazes de diferenciação em funcionais, saliva células acinares produzindo. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Salisphere formação in vitro. Após a digestão mecânica e enzimática utilizando o protocolo atual, esferas de tamanho crescente pode ser encontrado nas culturas flutuante. Os painéis são representativos fase de imagens de microscopia de contraste de esferas de dias 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra de escala = 50 mm.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de cultura de tecidos descrito aqui representa um protocolo reprodutível para o isolamento de células-tronco contêm salispheres das glândulas salivares de ratos. Estudos utilizando células isoladas desta forma têm destacado a capacidade regenerativa das células da glândula salivar-tronco 9. Transplante de uma centena de células + c-Kit derivado do salispheres induzida a recuperação funcional das glândulas salivares de ratos irradiados. Estes dados são estimulantes e fornecer um ponto de partida para a investigação de células-tronco para terapia baseada xerostomia. Muitos caminhos ainda precisam ser exploradas no entanto, incluindo a plena perfil de expressão do marcador de proteína das células-tronco, a capacidade das glândulas submandibulares de resgatar a função das glândulas salivares parótidas irradiadas e vice-versa, ea caracterização da suposta in vivo nicho de células-tronco de as células. Em última análise, a tradução deste protocolo para amostras de tecido humano eo potencial subseqüente para o tratamento da xerostomia em pacientes humanos utilizando células isoladas é a aplicação mais empolgante do método descrito.

<table><tbody><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Armazenar a &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Colagenase II</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Armazenar a 4 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Preparar um estoque de 10 &amp;#x03BC;g / mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazenar a &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C em alíquotas de uso único.</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Preparar estoque de 25 &amp;#x03BC;g / mL em PBS. Armazenar a &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C em alíquotas de uso único.</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Conforme instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Preparar estoque de 2 mg / mL em água da torneira. Ajustar a água para pH 2-3 usando ácido acético glacial antes de dissolver.</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Filtros estéreis para células com porosidade de 100 &amp;mu;M</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de poliestireno com tampas de filtro (porosidade de 50 &amp;mu;M)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células-tronco do rato das glândulas salivares

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Madura glândulas salivares de origem humana e do rato compreendem um mínimo de cinco tipos de células, cada qual facilita a produção e excreção de saliva na cavidade oral. Células acinares serosas e as mucosas são as proteínas e fábricas que produzem muco da glândula, respectivamente, e representam a origem da produção de saliva. Uma vez sintetizados, os vários enzimática e outros componentes proteicas de saliva são secretados por uma série de células epiteliais ductais rolamentos do tipo morfologia, até que a eventual expulsão da saliva através de um duto grande para a cavidade da boca. A composição da saliva também é modificado pelas células ductais durante este processo. Na manifestação de doenças como a síndrome de Sjögren, e em algumas situações clínicas, tais como o tratamento de radioterapia para câncer de cabeça e pescoço, a produção de saliva pelas glândulas é drasticamente reduzido 1,2. A xerostomia resultante, uma sensação subjetiva de boca seca, afeta não só a capacidade do paciente de engolir e falar, mas também incentiva o desenvolvimento de cárie dentária e pode ser socialmente debilitante para o sofredor. A restauração da produção de saliva nas condições acima mencionadas clínica, portanto, representa uma necessidade não atendida clínica, e, como tal, vários estudos têm demonstrado a capacidade de regeneração das glândulas salivares 3-5. Mais para o isolamento de células-tronco como as populações de células de vários tecidos dentro do mouse e corpos humanos 6-8, temos mostrado usando o método descrito que as células-tronco isoladas das glândulas salivares do mouse pode ser usado para resgatar a produção de saliva na salivares irradiadas glândulas 9,10. Esta descoberta abre o caminho para o desenvolvimento de células-tronco terapias baseadas no tratamento de condições xerostomic em seres humanos, e também para a exploração da glândula salivar como um microambiente contendo células multipotentes com capacidades de auto-renovação.

Um protocolo otimizado para o isolamento de células-tronco a partir da glândula salivar do mouse é descrito. O método emprega digestão enzimática e mecânica, e permite o isolamento de salispheres contendo células com características de células-tronco.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Glândulas salivares maduras, tanto de origem humana quanto de camundongo, compreendem no mínimo cinco tipos celulares, cada um dos quais facilita a produção e a excreção de ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o isolamento de células-tronco putativas a partir das glândulas salivares de camundongos infectados pelo vírus da imunodeficiência símia. Isso é realizado inicialmente pela coleta das glândulas salivares submandibulares de camundongos adultos. O segundo passo do procedimento consiste em usar tesouras curvas para processar o tecido em uma polpa homogênea.O terceiro passo do procedimento é digerir ainda mais o tecido utilizando colagenase e enzimas liase mais ativas. Deve-se ter cuidado para não superdigerir o tecido. Como uma suspensão celular completa não produz muitas esferas, aglomerados de duas a três células são ideais.O passo final do procedimento é a filtração do homogenato através de filtros de 100 mícrons e 50 mícrons. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o cultivo e o isolamento de células-tronco da glândula SIV por meio do uso combinado de digestão mecânica e enzimática de glândulas SIV inteiras. As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da xerostomia, também conhecida como boca seca, que pode resultar do tratamento com radioterapia.Células-tronco da glândula salivar podem ser usadas para tratar a xerostomia em pacientes que sofrem de cânceres de cabeça e pescoço. Antes de iniciar este procedimento, prepare os tampones, o camundongo, o cultivo da glândula salivar, os meios e as soluções enzimáticas. De acordo com o protocolo escrito em anexo, todos os passos de dissecação e cultivo de tecidos devem ser realizados em uma câmara de cultura tecidual estéril.Após isolar e dissecar as glândulas salivares do camundongo, pese o tecido glandular em uma balança e registre o peso. Use uma espátula para transferir as glândulas salivares para um pequeno recipiente de Petri e, com tesoura de dissecação curva, pique-as até obter uma polpa homogênea. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta P 1000 para obter uma abertura mais larga.Use isto para pipetar um mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido no recipiente de Petri e transfira o homogeneizado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Adicione mais um mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido no recipiente de Petri. Para coletar quaisquer pequenos fragmentos remanescentes de tecido, adicione esta solução ao tubo de centrífuga.Em seguida, adicione rapidamente 250 microlitros de solução de cloreto de cálcio, 25 microlitros de solução de hialuronidase e 25 microlitros de solução de colagenase. Duas enzimas por 80 miligramas de tecido. Coloque o tubo contendo o tecido e a mistura enzimática em um banho-maria agitado a 37 graus Celsius e incube por 20 minutos.Após a incubação, remova os tubos. Utilize uma ponteira de P1000 com a extremidade removida, como antes, para misturar completamente o tecido e a solução enzimática aproximadamente 10 vezes. Retorne o tubo ao banho-maria a 37 graus Celsius por mais 20 minutos.Após o segundo período de incubação, centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade durante oito minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda cuidadosamente o pellet em dois mililitros de tampão por 80 miligramas de tecido inicial. Em seguida, adicione mais 250 microlitros de solução de cloreto de cálcio, 25 microlitros de solução de hialuronidase e 25 microlitros de colagenase. Duas soluções enzimáticas por 80 miligramas de tecido.E devolva o tubo ao banho-maria agitado a 37 graus Celsius por 20 minutos. Remova os tecidos do banho-maria e repita as incubações anteriores após a incubação. Centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade por oito minutos.Mais uma vez e depois descarte o sobrenadante. O tecido agora está pronto para ser lavado em preparação para a filtração após a centrifugação anterior. Pipete dois mililitros de tampão no tubo e triture.Suspenda o pellet após a ressuspensão. Centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade durante oito minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante com pipeta.Um mililitro de tampão por 80 miligramas de tecido no tubo e, novamente, triture. Para ressuspender o pellet. Repita a centrifugação.Centrifugue a 400 vezes a gravidade durante oito minutos. Durante a centrifugação, prepare-se para a etapa de filtração colocando um filtro de 100 micrômetros de tamanho de poro sobre um tubo cônico de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e pipete um mililitro final de tampão por 80 miligramas de tecido para dentro do tubo. Utilize uma ponteira P1000 com a ponta cortada previamente para pipetar para cima e para baixo, garantindo que o precipitado seja completamente ressuspenso.Em seguida, transfira o homogenato para o filtro de tamanho de poro de 100 micrômetros e permita que ele escorra através do filtro até o tubo de centrífuga de 50 mililitros. É importante não aplicar mais de três mililitros de homogenato, pois o filtro pode entupir. Se esse volume for excedido, use uma pipeta P1000 para remover qualquer tecido que tenha se acumulado na parte inferior do filtro e transfira esse tecido para o tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo o filtrado.Usando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26, aspire o homogenato do tubo de centrífuga de 50 mililitros e aplique-o sobre a tampa com filtro de poro de 50 micrômetros posicionada sobre o tubo de cinco mililitros. Deixe o homogenato passar pelo filtro. Se a filtração for lenta, afrouxe a tampa do filtro, pois pode estar muito apertada.Uma vedação pode evitar a filtração quando toda a homogeneização tiver passado pelo filtro para o tubo. Centrifugue a amostra a 400 vezes a gravidade durante oito minutos. Após a centrifugação, as células em pellet estão prontas para serem semeadas em placa.As células das glândulas salivares começam sendo suspensas novamente em um mililitro de meio MSG por 80 miligramas de tecido. Conte as células de acordo com protocolos padrão. Aqui, um contador automático de células é utilizado para determinar o número de células.Calcule o volume de suspensão celular necessário para 0,4 vezes 10 elevado a seis células e, a partir disso, o número de poços que podem ser semeados. Adicione um mililitro de meio MSG por poço a uma placa de cultura de 12 poços. Certifique-se de que a suspensão celular esteja bem misturada e adicione o volume necessário da suspensão celular para 0,4 vezes 10 elevado a seis células a cada um dos poços.Transfira as placas para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após dois dias de incubação, examine as culturas quanto à presença de esferas de SLOs e à ausência de células ace. Este é um exemplo de tecido da glândula salivar de camundongo processado conforme descrito e visualizado por microscopia de contraste de fase do dia zero ao dia 10 em cultura; os pequenos agregados celulares são esferas de SLOs, que aumentam de tamanho ao longo desse período.É mostrada aqui a imunomarcação de uma cultura representativa de esferoides de OLS com três a cinco dias para o marcador de células-tronco. Kit da proteína C. Analisada por citometria de fluxo, a expressão do kit sea confirma a presença de células-tronco putativas nas culturas de OLS. Esferoides de OLS com três a cinco dias de idade também podem ser diferenciados para formar estruturas semelhantes a acinos e ductos, com morfologia semelhante à da glândula salivar nativa.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar glândulas salivares e células-tronco de glândulas salivares murinas.

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Biologia

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Aprenda a isolar células-tronco de glândulas salivares de camundongos usando digestão enzimática e mecânica. Este método permite cultivar salisferas com características de células-tronco para pesquisa em medicina regenerativa.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

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