Levedura Método Embedding Colony
22 de março de 2011
Um método para a incorporação de colônias de leveduras permitindo o corte de microscopia óptica e eletrônica. Este protocolo permite a determinação da distribuição de células esporuladas e células pseudohyphal dentro colônias fornecendo uma nova ferramenta para a compreensão da organização de tipos de células dentro de uma comunidade de fungos.
O objetivo geral deste procedimento é incorporar colônias de leveduras. Isso é feito removendo primeiro uma colônia e o ágar subjacente de uma placa de ágar, colocando-a em várias gotas de ágar derretido e cobrindo-a rapidamente com mais ágar derretido. Em seguida, o excesso de AER é aparado da colônia para torná-la pequena o suficiente para caber em um molde.
A colônia embebida no AER é então fixada, corada, desidratada e, finalmente, infiltrada com resina de esporão. O bloco é então colocado em um molde com resina de esporas adicionais incubada até endurecer e depois seccionada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a distribuição dos tipos de células dentro de uma colônia de leveduras por meio de microscopia de luz ou eletrônica.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia eletrônica de varredura, é que ela permite que a estrutura interna da colônia seja determinada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento microbiano, como a distribuição de tipos de células dentro das colônias. Este método forneceu informações sobre a estrutura das colônias de CAC de croce, mas é provável que também possa ser aplicado a outros microrganismos.
A demonstração visual desse método é crítica, uma vez que o manuseio e a incorporação de colônias podem ser difíceis de aprender com um protocolo escrito. A ideia desse método foi inspirada em alguns dados genéticos que publicamos em 2002 que sugeriam que os esporos não eram distribuídos uniformemente nas colônias. Adaptamos um método de seccionamento de colônias que foi desenvolvido por engelberg no laboratório de barbatanas.
Então vamos começar. Comece incubando a levedura Wild S visi em placas helicoidais a 30 graus até que aproximadamente 300 colônias estejam presentes. Usando uma espátula estreita, remova colônias de um a dois milímetros de diâmetro, uma de cada vez, da placa.
Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, coloque várias gotas de ágar 2% a 42 graus Celsius em uma lâmina de microscópio e imediatamente coloque a colônia em ágar com a face voltada para cima antes que o AER solidifique. Coloque mais algumas gotas de ágar na colônia e deixe o ágar solidificar, garantindo que toda a colônia, incluindo o topo da colônia, seja envolta em ágar. Em todas as etapas subsequentes do protocolo com uma lâmina de barbear.
Apare o AER ao redor da colônia e coloque o bloco AER contendo a colônia. Em um frasco de 3,5 mililitros com tampa de rosca de silicato bo contendo 2% de aldeído paraforme e 2% de glutaraldeído, as colônias fixadoras devem ser processadas, uma de cada vez para evitar a secagem, mas até 10 colônias podem ser colocadas no mesmo frasco. Deixe as colônias por sete dias a quatro graus Celsius.
Após uma semana, remova o fixador e lave as colônias agrícolas duas vezes, usando aproximadamente 1,5 mililitros de sódio 0,15 molar. Cate em pH 7,2 e incube no gelo após cada lavagem por 15 minutos sem agitação. Após esta lavagem mais duas vezes.
Usando 1,5 mililitros de um tampão X OS, composto de 100 milimolares de fosfato monopotássico, 10 milimolares de cloreto de magnésio a pH 6,0, incubando em gelo por cinco minutos após cada lavagem. Em seguida, usando o mesmo frasco, execute o tratamento e as lavagens de ósmio listados aqui e na parte escrita deste protocolo. Então, novamente, usando o mesmo frasco, execute as desidratações graduais listadas aqui e no protocolo escrito que o acompanha na manhã seguinte.
Prepare o reagente de esporas conforme mostrado aqui e no protocolo escrito que o acompanha. Lave imediatamente os blocos agrícolas cinco vezes por 10 minutos cada com 1,5 mililitros de etanol a 100% da temperatura ambiente. Após a última lavagem com etanol, remova apenas etanol suficiente para que o bloco agrícola permaneça coberto.
Usando pipeta de pastagem, coloque aproximadamente 0,5 mililitros de reagente de esporas no frasco e gire em uma roda em baixa velocidade por 15 minutos. À temperatura ambiente após a rotação, deixe o frasco repousar durante 30 minutos. Em seguida, remova a solução completamente.
Em seguida, adicione 1,5 mililitros de reagente de esporas para cobrir o bloco agrícola. Novamente, gire o frasco para injetáveis em uma roda por 15 minutos em temperatura ambiente e deixe repousar por 30 minutos. Repita esta lavagem.
Passo mais três vezes. Após os 30 minutos finais, remova o reagente de esporões e adicione um novo reagente de esporões para cobrir os blocos. Deixe os blocos agrícolas repousarem em temperatura ambiente por quatro horas.
Substitua o reagente de esporões e gire durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o reagente de esporão e deixe os frascos girando até o dia seguinte. Na manhã seguinte, coloque o reagente de esporas em moldes de silicone numerados para cobrir apenas a parte inferior dos moldes.
Em seguida, coloque os blocos agrícolas nos moldes e incube a 60 graus Celsius por quatro horas. Após quatro horas, complete os moldes com mais esporas, reagente e incube a 60 graus Celsius durante a noite. Remova os blocos do molde para seccionamento.
Um exemplo de uma micrografia leve de uma seção através do centro de uma colônia de colônia de leveduras Wild S Visia é mostrado aqui. Esta levedura é uma cepa do tipo selvagem isolada de exsudatos de árvores. A colônia foi incubada por seis dias em meio YNA antes do seccionamento.
Nesta imagem, as leveduras asai, pseudo-hiphy e ovóide são facilmente distinguíveis e a região da colônia que invade o ágar subjacente também é aparente. Setas abertas indicam representativas asai preenchidas setas indicam células vegetativas ovóides representativas preenchidas seta indicam cadeias de células alongadas e si. Esta imagem é um exemplo de uma micrografia eletrônica de uma seção fina de uma cepa de laboratório de levedura SH 1 0 2 0 e W 3 0 3.
A colônia foi incubada por seis dias em meio YNA antes do seccionamento. A imagem mostra uma região da colônia contendo uma alta frequência de células esporuladas. Uma seta indica a estrutura de bicamada da parede do esporos.
Na parte A, mostramos uma seção de uma colônia de quatro dias com uma grade composta por 15 retângulos sobrepostos à imagem na parte B.A frequência de células relacionadas a esporos em cada retângulo é enxertada com as 15 barras correspondentes aos 15 retângulos mostrados na parte A.Os dados são a média e o erro padrão de quatro colônias independentes de quatro dias Na parte C, As médias e erros padrão para quatro colônias independentes de oito dias são mostradas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em duas semanas, com um dia inteiro e vários dias de uma a três horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar as soluções imediatamente para que os blocos não sequem Seguindo este procedimento.
Outros métodos, como a microscopia imunoeletrônica, poderiam ser usados para determinar a distribuição de células que expressam proteínas específicas após seu desenvolvimento. Essa técnica nos permitiu observar não apenas a padronização das células esporuladas, mas também a padronização das células pseudo-hifais nas colônias de CCI de croce. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como incorporar colônias de leveduras para seccionamento.
Não se esqueça de que muitos dos reagentes de microscopia usados neste protocolo podem ser extremamente perigosos. Lembre-se de usar um exaustor, usar roupas de proteção e descartar os reagentes adequadamente. Ok, é isso.
Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para incorporar colônias de levedura, permitindo a seção para microscopia óptica e eletrônica. O protocolo facilita a análise de células esporuladas e pseudohifais dentro das colônias, contribuindo para a compreensão da organização do tipo celular em comunidades fúngicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Celular
- Biologia Fúngica
Fundamentos
- As colônias de levedura exibem diversos tipos celulares.
- Compreender a distribuição celular é crucial para o estudo de comunidades fúngicas.
- Métodos tradicionais podem não fornecer insights detalhados sobre a organização celular.
- Este método oferece uma nova abordagem para visualização.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para incorporar colônias de levedura.
- Permitir a análise detalhada da distribuição do tipo celular.
- Aprimorar a compreensão da organização da comunidade fúngica.
Métodos Utilizados
- Remoção das colônias de levedura de placas de ágar.
- Incorporação das colônias em ágar derretido.
- Corte do excesso de ágar para caber nos moldes.
- Fixação, coloração, desidratação e infiltração com resina.
Principais Resultados
- Incorporação bem-sucedida de colônias de levedura para microscopia.
- Visualização de células esporuladas e pseudohifais.
- Análise detalhada da distribuição de tipos celulares dentro das colônias.
- Novos insights sobre a organização de comunidades fúngicas.
Conclusões
- O método de incorporação é eficaz para análise microscópica.
- Fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da estrutura das colônias de levedura.
- Pesquisas futuras podem se basear neste método para explorar interações fúngicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization of cell types within microbial communities supports target validation in antimicrobial and antifungal discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing phenotypic heterogeneity that may influence drug response and resistance development. It provides predictive confidence for early-stage screening by linking colony architecture to functional subpopulations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing sporulated and pseudohyphal cell distribution within colonies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of cell type patterning linked to functional states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving spatial relationships of cell types.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent sectioning and imaging of colony interior structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through visualization of invading colony regions that model microbial penetration into host tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification by enabling structural phenotyping that informs compound screening decisions.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via direct imaging of asymmetric cell distribution.
- Screening: Describes assay readiness through production of thick and thin sections compatible with light and electron microscopy.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as frequency mapping of sporulated cells across colony regions for comparative analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking invasive colony fronts to tissue penetration models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for structural analysis across multiple fungal strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of colony preparation for multi-user microscopy pipelines.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural biomarkers of virulence or persistence.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, microscopy, and microbial handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtomes, light and electron microscopes, and resin infiltration systems.
- Cross-team standardization requirements for fixation, staining, and sectioning protocols across microbiology and imaging groups.
- Adaptation considerations across model systems such as biofilm-forming bacteria or other yeast species with varying colony morphology.
- Practical limitations supported by source material including colony size constraints (1-2 mm diameter) and multi-day processing time requiring sterile technique to prevent contamination.
