Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

O objetivo geral deste procedimento é manipular células e grânulos dentro de dispositivos microfluídicos usando eletroforese D ou DEP usando placas de circuito impresso ou PCBs. Isso é feito primeiro projetando e preparando os eletrodos de PCB e os canais microfluídicos. A segunda etapa do procedimento é preparar o conjunto microfluídico do PCB e as soluções de esferas e células.

A terceira etapa do procedimento é preencher os canais com meios de baixa condutividade e, em seguida, carregar os grânulos e as células. A etapa final do procedimento é conectar o conjunto do PCB com o amplificador de potência e o gerador de funções e, em seguida, iniciar o DEP. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a separação e manipulação de células e esferas em dispositivos microfluídicos por meio do uso de DEP.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os princípios da DEP devem ser compreendidos pelo usuário para desenvolver um eletrodo eficaz que funcione com dispositivo microfluídico para a célula desejada ou manipulação de contas. Por outro lado, o uso de PCBs como eletrodos torna a atuação de células e esferas em dispositivos microfluídicos acessíveis a uma variedade de disciplinas científicas. O primeiro passo deste procedimento é projetar a placa de circuito impresso ou eletrodos de PCB para ter a geometria desejada para gerar um campo elétrico não uniforme.

Quando o projeto estiver concluído, solicite os chips de eletrodo PCB personalizados por meio de uma instalação de fabricação comercial. Depois que o PCB personalizado chegar, abra-o e inspecione-o para esta demonstração. O PCB tem 8,4 centímetros de comprimento e 2,1 centímetros de largura.

Os eletrodos de metal têm cinco milímetros de largura. Neste exemplo, os eletrodos têm duas tiras de metal longas e duas regiões transversais de 4,5 milímetros de comprimento onde os eletrodos são interdigitados. Essas regiões interdigitadas geram um forte campo elétrico não uniforme para criar uma conexão do estimulador ao eletrodo PCB.

Coloque um fio de bitola 16 na extremidade do eletrodo. Use um ferro de solda quente para manter o fio no lugar na área de metal do PCB. Isso aquece o fio.

Segure a solda no fio aquecido e deixe uma pequena quantidade de solda fluir para o fio. Depois que o fio estiver cheio de solda, remova o ferro de solda que prende o fio no lugar enquanto a solda esfria. Repita o processo de soldagem para a outra conexão elétrica no PCB.

O próximo passo é preparar canais microfluídicos com o padrão de ramificação desejado. Usando técnicas padrão de microfabricação, crie um molde mestre para definir os canais usando um wafer de silício e um fotorresistente SU oito. Este molde mestre tem um canal de entrada e três canais de destino.

A largura dos canais é de 100 micrômetros e a altura dos canais é de 27 micrômetros. Uma vez criado o molde mestre, misture o elastômero polimetil LAANE ou PDMS com um agente de cura em uma proporção de peso de espera de 10 para um por cinco minutos. Despeje o PDMS líquido no molde mestre SU oito pré-fabricado e remova as bolhas de ar expondo o PDMS líquido ao vácuo por três minutos.

Repita o processo de vácuo, se necessário, para remover completamente todas as bolhas. Um fluxo de gás nitrogênio pode ser usado para remover bolhas extras, se necessário. Catalise o PDMS em um forno a 70 graus Celsius por duas horas.

Use uma lâmina de barbear para remover o laboratório P-D-M-S-S com os canais microfluídicos do wafer. Tomando cuidado para não quebrar o wafer com o espaço do canal para cima. Use um punção de biópsia para fazer furos para introduzir fluidos e células no dispositivo microfluídico. Aparar.

Qualquer excesso de PDMS. Inspecione o dispositivo microfluídico para garantir que esteja livre de poeira e detritos. Use a fita 3M Scotch Magic para limpar o PDMS.

Exponha os canais PDMS e uma lamínula de cobertura zero de 80 a 130 micrômetros de espessura ao gás de plasma por 1.5 minutos. Remova o laboratório PDMS e a lamínula do limpador de plasma em uma ligação de plasma de placa de Petri, os canais microfluídicos PDMS baseados na lamínula aquecem o conjunto microfluídico da lamínula em uma placa quente ajustada a 100 graus Celsius por um mínimo de 15 minutos. A etapa final na preparação do dispositivo microfluídico é posicionar os canais PDMS e a lamínula acima dos eletrodos do PCB.

Comece colocando aproximadamente 10 microlitros de óleo mineral no PCB. Para garantir um contato firme entre o PCB e a lamínula, coloque o conjunto do canal microfluídico da lamínula na placa de circuito impresso lubrificada com a lamínula. Em contato com o óleo, pressione suavemente o conjunto microfluídico da lamínula para baixo para garantir um bom contato e minimizar as bolhas de ar que podem prejudicar a visualização da célula e do grânulo.

Outro passo importante é preparar a mistura de meios de baixa condutividade, 8,5% de sacarose e 0,3% de peso de glicose em volume em água deionizada. O dispositivo microfluídico agora está pronto para uso usando uma pipeta, encha cada canal microfluídico com 15 a 20 microlitros do meio de baixa condutividade, se necessário. Use aspiração a vácuo para remover quaisquer bolhas nos canais.

O próximo passo é introduzir as partículas de teste no dispositivo microfluídico. Esta demonstração usa uma suspensão de 550 grânulos de poliestireno por microlitro de meio de baixa condutividade, pois os grânulos podem se assentar com o tempo, suspender os grânulos com agitação. Em seguida, usando uma pipeta, introduza 200 microlitros da suspensão de esferas de poliestireno no canal.

O próximo passo é preparar os eletrodos, conectar a saída de um gerador de funções à entrada de um amplificador de potência CA. Em seguida, conecte a saída do amplificador aos fios do eletrodo. Cubra todos os fios e superfícies elétricas da configuração com fita isolante para proteger os usuários de uma possível exposição a choques.

Defina o gerador de funções para produzir uma saída de onda senoidal de um a 1.5 megahertz. Inicie a DEP para começar a classificar as células e contas nesta configuração. O canal de entrada está à direita e os três canais de destino se separam na junção trifurcada.

Os eletrodos de PCB correspondem às listras pretas sem fluxo laminar e sem DEP. Os grânulos são essencialmente estacionários no início da DEP, mas sem fluxo. Os grânulos migram em direção aos eletrodos de PCB e para longe do espaço entre os eletrodos quando o fluxo laminar está ativado.

Mas o DEP está desligado, os grânulos que fluem pelos canais de entrada são divididos entre os três canais de destino. Quando a DEP é iniciada e o fluxo laminar está ativado, os grânulos são acionados para fluir apenas no canal central. Nos vídeos seguintes, o dispositivo microfluídico foi girado acima dos eletrodos do PCB, resultando em uma mudança na orientação dos canais.

Com relação aos eletrodos PCB. O canal de entrada, que antes era perpendicular aos eletrodos de PCB, agora está quase paralelo aos eletrodos com o fluxo laminar ativado. Mas o DEP das contas entra em todos os três canais de destino igualmente.

Quando a DEP é iniciada, as esferas se aproximam do ponto de trifurcação e a força da DEP puxa as esferas para o canal lateral acima do eletrodo. Este próximo conjunto de figuras em vídeo mostra uma mistura de adenocarcinoma de cólon humano ou células HT 29 e esferas fluorescentes no dispositivo microfluídico. Nesta imagem DIC, a seta aberta identifica a direção do fluxo laminar e os canais são delineados com linhas tracejadas.

Os eletrodos de metal reflexivos podem ser vistos como a faixa de fundo claro, a microscopia DIC é usada para obter imagens das contas enquanto brilham. Intensidade da escala. As imagens são usadas para tornar as células mais visíveis.

Esta figura é a mesma imagem que a outra figura, exceto que é mostrada como uma imagem de intensidade de escala de brilho, portanto, deve visualizar as células e as contas. Os eletrodos de metal refletivos aparecem como listras amarelas e verdes nesta figura. Com a DEP, os grânulos saem do canal direito, conforme mostrado na imagem DIC, enquanto as células HT 29 saem do canal central e esquerdo, conforme mostrado na imagem da escala de brilho antes de iniciar o DEP, Uma solução mista de células e grânulos flui de um canal de entrada para os três canais-alvo separados.

Após a indução da DEP, os grânulos e as células são acionados seletivamente em canais separados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como começar a implementar a eletroforese de discagem para a manipulação de células e esferas em dispositivos microfluídicos.