Name: Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a purificação microfluídica de células engenheiradas usando dispositivo espiral com foco inercial diferencial. Este método de alta vazão remove eficientemente nanopartículas livres para aplicações em medicina regenerativa.

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Gentil doação de células THP-1 do Dr. Mark Chong e assistência na microfabricação do Dr. Yuejun Kang e Dr. Nishanth V. Menon (Escola de Engenharia Química e Biomédica, Universidade Tecnológica de Nanyang) foram muito reconhecidos. Este projeto foi financiado pelo NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Universidade Tecnológica de Nanyang). H.W.H. foi apoiado pela bolsa de pós-doutorado da Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine).

1. Nanopartículas (NPs) Rotulagem de células-tronco mesenquimais e monócitos <ol><li> as células estaminais mesenquimais Cultura (MSCs) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (SFB) e antibióticos para ≥80% de confluência antes da marcação. Do mesmo modo, a cultura de células THP-1 (ATCC) em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com FBS a 10% para uma densidade de ~ 10 6 células / ml. </li><li> NPs de carga de sílica (~ 500 mm) com uma solução de corante calceina (200 ^ M) usando agitação durante a noite. Fabricar AM PLGA-calceína (CAM), utilizando um protocolo descrito anteriormente. 22 <ol><li> Dissolve-se 250 ug CAM e 100 mg de PLGA (50:50) em clorofórmio a 4 ° C. </li><li> Gerar NPs de emulsão única usando um homogeneizador de alta velocidade (13.600 xg, 60 seg) à temperatura ambiente. Evapora-se o clorofórmio em uma capa química (≥3 h) antes da recolha através de centrifugação (3400 xg durante 5 min), lavagem (disti duplasencheram água), a secagem por congelação e armazenamento em -20 ° C. </li></ol></li><li> Incubar CAM-PLGA PN (1 mg) ou nanopartículas de sílica calceina (150 ug) em solução a 0,01% de poli-L-lisina (PLL) à temperatura ambiente durante 15 - 20 min. </li><li> Centrifugar a 3.400 xg durante 5 min para remover o excesso de sobrenadante PLL antes de ressuspensão em 1 ml de NPs de respectivo meio de cultura. </li><li> Incubar os PN com células (MSCs ou THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 células no total) durante aproximadamente 24 horas (0,1 mg mL-1 · concentração rotulagem). </li><li> Dissociar e colheita das MSCs marcadas aderentes utilizando 2 ml de tripsina a 0,25% (5 min, 37 ° C) e diluiu-se com 6 ml de DMEM. Girar as células AT (1000 x g, 4 minutos) e ressuspender a uma concentração de 10 junho 05-10 células / ml para o processamento de microfluidos. Utilização de células THP-1 marcadas (10 junho 05-10 células / ml) directamente para a purificação de microfluidos. </li></ol> 2. Preparação Dispositivo de microfluidos <ol><li> fabricação de dispositivos <ol><li> Fabricar o dispositivo microfluídico espiral (500 mm (w) × 115 mm (h)) com polidimetilsiloxano (PDMS) a partir de um kit comercial utilizando etapas padrão litografia macia. 23 </li><li> Misture 30 g de pré-polímero de base e 3 g agente de cura completamente em um barco de pesagem. De gás-se a mistura num excicador durante 60 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Verter a mistura de PDMS sobre o molde mestre de bolacha de silicone modelado com o design do canal espiral cuidadosamente a uma altura de aproximadamente 5 - 10 mm. </li><li> De gás-se a mistura no vácuo exsicador durante 60 minutos novamente para remover quaisquer bolhas de ar. Repetir o processo até que todas as bolhas são eliminados. </li><li> Curar a mistura PDMS num forno de 80 ° C durante 2 horas até que o PDMS está definido. Assegurar a bolacha não é inclinado durante a cura ter uma altura constante dispositivo. </li><li> Cortar o dispositivo espiral PDMS utilizando um bisturi e retire cuidadosamente a laje de PDMS do molde mestre. </li><li> Trim as bordas do dispositivo com um bisturi para assegurar a superfície lisa para a colagem. </li><li> Perfurar dois buracos (1,5 mm) para as entradas e dois orifícios (1,5 mm) para as saídas no dispositivo de PDMS utilizando um perfurador de biópsia de 1,5 mm. </li><li> Lavar o dispositivo com isopropanol (IPA) para remover todos os detritos e secar o dispositivo num forno de 80 ° C durante 5 min. </li><li> Limpar a superfície inferior do dispositivo de PDMS (com características de canal) usando fita adesiva. </li><li> um lado limpo de uma lâmina de vidro (2 &quot;por 3&quot;) usando fita adesiva. </li><li> Com cuidado, coloque e expor as superfícies limpas do dispositivo PDMS e lâmina de vidro na câmara de um aspirador de plasma e submetê-las a vácuo durante 60 segundos. Em seguida, ligue a corrente de plasma para o máximo e reduzir a pressão da câmara até que a câmara se transforma na cor rosa. <ol><li> Expor as superfícies a plasma de ar durante 60 segundos. O plasma cria espécies reactivas sobre as superfícies expostas dos PDMS e vidros, que permite a ligação apertada quando posta em físicocontato al. Desligue a alimentação de plasma e liberar a pressão do limpador de plasma para recuperar o dispositivo e vidro slide. </li></ol></li><li> Unir o dispositivo de PDMS e lâmina de vidro em conjunto, pressionando as superfícies expostas ao plasma firmemente e assegurar que não há bolhas estão presos entre as duas superfícies. </li><li> Aquecer o dispositivo ligado usando uma chapa quente fixada em 80 ° C durante 2 h para reforçar a ligação. </li></ol></li><li> Operação dispositivo <ol><li> Cortar duas peças de tubagem (1,52 mm de diâmetro externo) de ~ 15 - 20 cm para as seringas de entrada e anexar uma ponta de seringa (calibre 23) sobre uma extremidade de cada tubo. </li><li> Cortar duas peças de tubagem (1,52 mm de diâmetro externo) de ~ 5 - 10 cm para as tomadas e para prender os orifícios de saída do dispositivo de PDMS. </li><li> Antes da amostra de funcionamento, o dispositivo manualmente privilegiada com uma seringa contendo 70% de etanol, até que flui para fora do tubo de saída. Permitir que a sente de etanol durante 30 segundos a 1 min para esterilizar o dispositivo. </li><li> Carregar 30 ml de filtrou(0,2 uM de poro) tampão de bainha (fosfato-salino tamponado (PBS) com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)) para a seringa de 60 ml e fixar a seringa numa bomba de seringa. Definir a bomba para as configurações corretas (tamanho Seringa: 60 ml, Volume: 60.000 ul). Nota: A adição de BSA para PBS é minimizar ligação à célula-célula e a ligação não específica entre as células e o dispositivo de PDMS. </li><li> Carga 3 ml de células marcadas para a seringa de 3 ml e fixar a seringa numa bomba de seringa separada. Definir a bomba para as configurações corretas (tamanho Seringa: 3 ml, Volume: 3,000 L). </li><li> Verifique se não há bolhas de ar presas nas seringas para assegurar um fluxo estável. Remover quaisquer bolhas de ar por ejecção de suavemente algumas gotas de líquido para fora do bocal. </li><li> Ligue as pontas de seringa de entrada e tubulação para as seringas, e inseri-los nas respectivas entradas do dispositivo (bainha e de entrada da amostra). Certifique-se que não há bolhas ao longo da tubulação. </li><li> Montar os dispositivos em um invertidoEd microscópio de contraste de fase para imagens em tempo real durante o processo de separação de células. </li><li> Garantir um pequeno copo de resíduos e dois tubos de 15 ml perto do dispositivo no palco microscópio usando adesivos. </li><li> Coloque os tubos de saída para o copo de resíduos. </li><li> Definir a razão de escoamento para a amostra para tampão de bainha a 1:10 e comece a ambas as bombas de seringa para iniciar o processo de triagem (Exemplo: 120 ul / min durante seringa amostra e 1200 ul / min durante seringa bainha; velocidade de fluxo do canal ~ 0,38 m / seg ). </li><li> Executar o dispositivo durante 1,5 min para a taxa de fluxo para estabilizar. Isso pode ser confirmado pela presença de células inercial focadas próximo da parede interior do canal sob o brilhante-campo com contraste de fase com uma câmera de alta velocidade (~ 5.000 - 10.000 quadros por segundo (fps), tempo de exposição: 10-50 ms). </li><li> Posicione os tubos de saída em diferentes tubos para recolher os eluentes da tomada celular e saída de resíduos. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+technology+for+tracking+cells%27+status+%26+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Ther%22%5BJournal%5D)">Aptamer technology for tracking cells' status & function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).</li>
<li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosensors+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li>
<li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li>
<li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles%3A+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li>
<li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicity%3A+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li>
<li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1%2FTh2+immunity+and+strain+background%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li>
<li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li>
<li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+metamaterials%3A+Microfabricated+arrays+to+steer%2C+refract%2C+and+focus+streams+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li>
<li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng.+Med.+Biol.+Mag%22%5BJournal%5D)">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li>
<li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengin%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li>
<li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826(2013).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259(2013).</li>
<li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li>
<li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference-free+Micro%2Fnanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li>
<li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

A tecnologia de purificação de célula DFF aqui descrita permite a separação rápida e contínua de células marcadas de um modo de elevado rendimento. Esta abordagem é ideal para a separação do volume da amostra ou grande processamento de amostras alta concentração de células, e é melhor do que a filtração à base de membrana convencional, que é propenso ao entupimento após uso prolongado. Da mesma forma, a separação magnética baseados em afinidade requer passos adicionais de rotulagem de células que são trabalhosos e caros...

Engenharia células, carregado por agente micro / nanopartículas (NPs) é um método livre de integração, e versátil simples, genômica para melhorar a capacidade bioimaging e aumentar / complementar suas propriedades terapêuticas nativas em medicina regenerativa. 1-3 modificações celulares são alcançados por rotular o membrana plasmática ou citoplasma com um excesso de concentração de NPs carregado por agente para saturar os locais de ligação. No entanto, uma grande desvantagem deste método é a de quantidades significativas de partículas não ligadas que permanece em solução depois de processos de rotulagem de células, que podem potencialmente confundir identificação precisa das células de engenharia de partículas ou complicam resultados terapêuticos 4,5. Além disso, a exposição aos PN contendo transformador agentes (fatores de crescimento, corticosteróides, etc.) em excessivamente alta concentração pode causar citotoxicidade ea exposição mal direcionada pode induzir consequências indesejadas sobre as células não-alvo. Mesmo os transportadores em partículas que compreendem of materiais &quot;biocompatíveis&quot; [por exemplo, poli (ácido co-glicólico), PLGA] pode incitar respostas celulares imunes potentes, em determinadas condições, assim. 6 Este é especialmente perigosa em indivíduos com imunidade diminuída (por exemplo, artrite reumatóide), susceptível de atrasos depuração sistémica de nanopartículas. 7 Assim, a remoção eficiente de partículas livres, antes da introdução das células de engenharia de partículas é de grande importância para minimizar o perfil de toxicidade e reduzir a exposição a partículas carregadas mal dirigido por agente in vivo. centrifugação em gradiente convencional é muitas vezes usado para separar as células manipuladas de partículas livres, mas é trabalhoso e operado em modo de lote. Além disso, tensões de cisalhamento experimentado pelas células durante a centrifugação de alta velocidade e os elementos constituintes do meio de gradiente de densidade pode comprometer a integridade celular e / ou o comportamento das células influência. 8 microfluídica é uma alternativa atraente, com sevtecnologias de separação rais, incluindo deslocamento lateral determinista (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 e acoustophoresis 12 desenvolvido para a separação de partículas pequenas e aplicações de troca de tampão. No entanto, estes métodos sofrem de baixa taxa de transferência (1-10 ul · min - 1) e são propensos a problemas de entupimento. separações activa, tais como os métodos baseados em dieletroforese também requerem diferenças em fenótipos celulares dieletroforética intrínsecas ou passos adicionais de rotulagem de células para conseguir a separação. Uma abordagem mais promissora envolve microfluídica inercial - a migração lateral de partículas ou células através agiliza a concentrar-se em posições distintas devido a forças de sustentação dominantes (F L) com alto número de Reynolds (Re) 13 Devido às suas condições de alto fluxo e resolução de tamanho superior. , tem sido frequentemente explorados para aplicações de câmbio baseada em tamanho separação de células 14,15 e tampão. 16-18 However, desempenho troca de tampão continua pobre com uma solução contaminante ~10-30% como as células separadas geralmente permanecem perto da fronteira entre soluções originais e novas tampão. 16-18 Mais importante ainda, a distribuição do tamanho das células-alvo deve ser semelhante para alcançar inercial uma focagem precisa e a separação a partir da solução tampão original, que constitui um problema especialmente no processamento de tipos heterogéneos de tamanho de células, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs). 19 Temos desenvolvido anteriormente uma nova técnica célula microfluídica inercial de classificação denominado Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para isolar células tumorais circulantes (CTCs) 20 e bactérias 21 do sangue total usando a 2 de entrada, dispositivo de microcanal espiral 2-outlet. Neste protocolo de vídeo, iremos descrever o processo de rotulagem de células THP-1 (linha celular de leucemia aguda monocítica humana) monocíticas suspensão (~ 15? M) e MSC (10-30 um) com calceina-lNPs oaded, seguido de fabricação e operação do microdispositivo espiral DFF para a recuperação eficiente de células marcadas e remoção de NPs de não ligados. 22 Esta estratégia de purificação de um só passo permite uma recuperação contínua de suspensão rotulado e as células aderentes em suspensão numa solução tampão fresco sem centrifugação. Além disso, ele pode processar até 10 milhões de células · ml -1, uma densidade de células susceptíveis de aplicações de medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td><forte>Linhas celulares & Mídia</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais (MSCs)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)</td><td>Soro Fetal Bovino Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Células de monócitos THP-1 (THP-1)</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mídia</td><td>Lonza</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagentes e Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,01% poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml</td><td>BD</td><td>302113</td><td>Seringa de 3 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>Seringa de 60 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td>Seringa de 60 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Calceína, AM (CAM)</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>#P/7507/17</td><td>HPLC Grau 2,5 L</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516Q/12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio simples</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-550D</td><td>75 x 25 x 1 mm3</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Fita adesiva Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>3M</td><td></td><td>21200702044</td><td>18 mm x 25 m</td></tr><tr><td>Silica NPs (&sim; 200 &mu; m)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>748161</td><td>Tamanho do poro 4 nm</td></tr><tr><td>Ponta da seringa</td><td>JEC</td><td>Technology 7018302</td><td>23 G 0,013 x 0,25</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Spectra-Teknik</td><td>06419-01</td><td>0,02 x 0,06" 100</td></tr><tr><td>Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td>Perfurador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biópsia</td><td>Harris Uni-Core</td><td>69036-15</td><td>1.50 mm</td></tr><tr><td>Dessecador</td> Câmera de Alta Velocidade <td>Scienceware</td><td>111/4 IN OD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Phantom&nbsp;</td><td>V9.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase invertido&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Chemyx</td><td>CX Fusion 200</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluídico troca de tampão para micro / nanopartículas celular engenharia sem interferências

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

células de engenharia com micro ativo-ingrediente-carregado / nanopartículas (NPs) está se tornando um método cada vez mais popular para melhorar as propriedades terapêuticas nativos, permitem imagiologia bio e controlar fenótipo celular. Um problema crítico é ainda tratado de forma inadequada ao número significativo de partículas que permanecem não ligados após a marcação de células que não podem ser facilmente removidas por centrifugação convencional. Isto leva a um aumento do ruído de fundo de imagem bio e pode conferir efeitos de transformação em células não alvo vizinhos. Neste protocolo, apresentamos uma estratégia inercial baseada em microfluidics tampão de câmbio denominado como Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para separar eficientemente células marcadas de NPs livres de uma forma de alto rendimento. O microdispositivo espiral desenvolvido facilita a recolha contínua (&gt; recuperação de células de 90%) das células purificadas (THP-1 e MSCs) suspensas em solução tampão nova, ao conseguir% depleção de corante fluorescente não ligado ou NPs tingem-carregado (sil&gt; 95ica ou PLGA). Este único passo, estratégia de purificação de células à base de tamanho permite que o rendimento de processamento de alta celular (10 6 células / min) e é altamente útil para a purificação de células de grande volume de células micro / nanopartículas projetada para alcançar uma aplicação clínica livre de interferências.

Após a marcação das células com bio-imagem NPs carregado agente durante a noite, as células marcadas (que contém partículas livres) são colhidos e purificados por DFF espiral microdispositivo para remover NPs livres num processo de etapa (Figura 1A). O 2-entrada, microcanal espiral 2-outlet foi concebido pelo software de engenharia e microfabricados usando SU-8 fotorresiste. A bolacha de silício modelado é depois utilizado como um molde para moldagem por PDMS réplica usa...

Este protocolo descreve o uso de uma estratégia de troca de tampão à base de microfluidos inercial para purificar as células manipuladas micro / nanopartículas com depleção eficaz de partículas não ligadas.

Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma tecnologia de purificação microfluídica conveniente, eficiente e de alto rendimento, para separar nanopartículas livres de células, após a engenharia celular com as nanopartículas. A principal vantagem desta tecnologia é permitir a remoção rápida e eficiente de nanopartículas não ligadas após o procedimento de manipulação celular. Após o procedimento celular, reunimos toda a nossa suspensão. Essa tecnologia de purificação celular microfluídica alcança uma separação eficiente baseada em tamanho, devido aos efeitos diferenciais de focagem inercial de células e nanopartículas em um dispositivo microfluídico espiral.Ele pode processar até 10 milhões de células por concentração mil, o que é muito útil para a medicina regenerativa, bem como para o processamento de células por volume de retenção. Esta tecnologia é altamente desejada no campo da engenharia celular, que frequentemente utiliza nanopartículas para marcar células, com finalidades de imagem ou controle funcional. A demonstração do procedimento será realizada por Hui Min Tay, assistente de pesquisa do meu laboratório, bem como pelo Doutor David Yeo, pesquisador pós-doutorando do laboratório da Professora Xi.Cultive células-tronco mesenquimais até mais de 80% de confluência em uma placa de seis poços antes de marcar as células com os nanopartículas. Da mesma forma, cultive as células THP-1 até uma densidade de um milhão de células por mililitro. Em seguida, dissolva um miligrama de nanopartículas de sílica em um mililitro de solução de corante de cálcio de duzentos micromolares.E agite as partículas durante a noite. Além disso, prepare nanopartículas de PLGA com cálcio AM utilizando os métodos descritos na referência mostrada aqui. Misture um miligrama das nanopartículas de PLGA com cálcio AM ou 150 microgramas das nanopartículas de sílica com cálcio em uma solução de 0,1% de poli-l-lisina em água, pipetando a solução para cima e para baixo durante um minuto.Em seguida, deixe incubado à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Em seguida, centrifugue as nanopartículas. Remova o sobrenatante em excesso de poli-l-lisina e re-suspenda as nanopartículas em um mililitro do meio de cultura apropriado para o tipo celular a ser marcado.Adicione 1 miligrama dos nanopartículas marcadas a um mililitro de meio para cada um milhão de células em cultura. Pipete a mistura de células, nanopartículas e meio cuidadosamente durante um minuto. Em seguida, incube a mistura por aproximadamente 24 horas.Uma vez marcadas, dissocie e colete as células-tronco, e re-suspenda-as em uma concentração entre 100.000 e 1.000.000 células por mililitro para o processamento microfluídico. Utilize células THP-1 marcadas na mesma concentração. Para fabricar o dispositivo microfluídico em espiral, prepare primeiro um molde-matriz de silicone usando técnicas padrão de microfabricação.Em seguida, misture bem 30 gramas do pré-polímero base de PDMS e três gramas de agente de cura em um barquinho de pesagem. Desgaseifique a mistura sob vácuo durante 60 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. Despeje cuidadosamente a mistura de PDMS sobre o molde-mestre, padronizado com o design do canal espiral, até uma altura de cinco a 10 milímetros.Em seguida, desgaseifique a mistura por 60 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. Repita este processo até que todas as bolhas sejam eliminadas. A seguir, coloque a pastilha em uma estufa, e certifique-se de que a pastilha não fique inclinada durante a cura, para garantir uma altura constante do dispositivo.Polimerize o PDMS a 80 graus Celsius por duas horas. Após esfriar, recorte o dispositivo em espiral de PDMS usando um bisturi e retire cuidadosamente a placa de PDMS do molde mestre. Em seguida, use um bisturi para aparar as bordas do dispositivo, garantindo uma superfície lisa para a ligação.Em seguida, utilize um punch de biópsia de 1,5 milímetro para criar dois orifícios para as entradas e dois orifícios para as saídas. Lave o dispositivo com isopropanol para remover qualquer resíduo. E seque o dispositivo em uma estufa a 80 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, utilize fita crepe para limpar a superfície inferior do dispositivo de PDMS e um lado de uma lâmina de vidro. Coloque cuidadosamente a lâmina de vidro e o dispositivo de PDMS em uma câmara de plasma, com as superfícies limpas expostas. Ligue a potência do plasma no máximo, reduza a pressão da câmara até que ela adquira uma coloração rosa e exponha os componentes por 60 segundos.Em seguida, remova a lâmina e o dispositivo de PDMS da câmara. E una-os pressionando firmemente as superfícies expostas ao plasma uma contra a outra. Certifique-se de que nenhuma bolha fique aprisionada entre as duas superfícies.Aqueça o dispositivo selado em uma placa aquecedora ajustada a 80 graus Celsius por duas horas para reforçar a ligação. Corte dois pedaços de tubo com comprimento de 15 a 20 centímetros para as entradas e fixe uma agulha de calibre 23 em uma extremidade de cada tubo. Em seguida, corte dois pedaços do mesmo tubo com comprimento de cinco a 10 centímetros para as saídas e conecte-os aos orifícios de saída do dispositivo.Antes de executar a amostra, prepare manualmente o dispositivo com uma seringa contendo etanol a 70% até que ele escoe pelo tubo de saída. Deixe o etanol permanecer no dispositivo por pelo menos 30 segundos para esterilizá-lo. Em seguida, carregue 30 mililitros de PBS filtrado com BSA a 1% em uma seringa de 60 mililitros.Além disso, carregue três mililitros de células marcadas em uma seringa de três mililitros e verifique se não há bolhas de ar aprisionadas em nenhuma das seringas. Remova quaisquer bolhas de ar ejetando suavemente algumas gotas do líquido pela ponta. Conecte as pontas de entrada das seringas e as tubulações às seringas e fixe as seringas nas bombas de seringa.Insira os tubos nas entradas respectivas do dispositivo e certifique-se de que não haja bolhas ao longo da tubulação. Com a fluidica agora configurada, acople o dispositivo a um microscópio invertido de contraste de fase para obtenção de imagens em tempo real durante o processo de separação celular. Posicione um pequeno béquer de resíduos e dois tubos de 15 mililitros próximos ao dispositivo sobre a platina do microscópio.Coloque as tubulações de saída de ambas as saídas do dispositivo no béquer de resíduos. Agora, ajuste a proporção de fluxo entre a amostra e o tampão de envolvimento para um para 10, definindo a taxa de fluxo da seringa da amostra em 120 microlitros por minuto e a da seringa de envolvimento em 1.200 microlitros por minuto. Execute o dispositivo por um minuto e meio para permitir que a taxa de fluxo se estabilize.Utilize uma câmera de alta velocidade para confirmar a presença de células focadas inercialmente próximas à parede interna do canal em campo claro com contraste de fase. Uma vez atingido o fluxo em estado estacionário e o dispositivo estiver funcionando corretamente, posicione os tubos de saída em diferentes frascos para coletar eluentes separados da saída celular e da saída de resíduos. Este dispositivo é capaz de separar corretamente uma suspensão marcada de células monócitas THP-1 de nanopartículas de sílica fluorescentes.Altas eficiências de separação foram obtidas, conforme confirmado por imagens de alta velocidade e análise de citometria de fluxo. A estratégia de purificação em um único passo permite a recuperação contínua de uma suspensão marcada e células aderentes que são suspensas em solução fresca de tampão, sem necessidade de centrifugação. O dispositivo é capaz de separação com alta eficiência utilizando nanopartículas de sílica e PLGA e pode separar até 10 milhões de células por mililitro com a mesma alta eficiência.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar células com nanopartículas e como purificar as células marcadas removendo as partículas não ligadas em excesso utilizando nosso dispositivo microfluídico especializado.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Dieletroforese (DEP) é um método eficaz para manipular células. Placas de circuito impresso (PCB) pode fornecer eletrodos de baixo custo, reutilizáveis ​​e eficaz para o contato livre de manipulação de células dentro de dispositivos microfluídicos. Ao combinar PDMS baseado canais microfluídicos com lamelas em PCBs, demonstramos a manipulação de contas e celular e separação dentro multicanal dispositivos microfluídicos.

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Este vídeo demonstra um sistema microfluídico para um imunoensaio baseado em nanopartículas magnéticas. O sistema de detecção utiliza um dispositivo microfluídico que incorpora uma armadilha magnética em seus canais. Imunocomplexos pré-formados, compostos por nanopartículas magnéticas revestidas com antígeno ligadas a anticorpos primários e secundários conjugados com peroxidase, são introduzidos nos canais. Os imunocomplexos são capturados na armadilha magnética porosa após a aplicação de um...

Um imunoensaio baseado em nanopartículas magnéticas usando um dispositivo microfluídico

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Este protocolo descreve uma arquitetura de sistema para realizar separações automatizadas de partículas de pequeno volume (0,15–1,5 ml) usando um dispositivo microfluídico e discute métodos para otimizar o desempenho e a operação do dispositivo acustofluídico.

Uma plataforma microfluídica para processamento de precisão de pequeno volume de amostra e respectiva utilização para Tamanho partículas biológicas separadas com um microdispositivos Acústico

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Propomos uma técnica simples de automontagem de nanopartículas coloidais de sílica para criar uma junção nanofluídica entre dois microcanais em polidimetilsiloxano (PDMS). Usando esta técnica, uma membrana de grânulo nanoporosa com um tamanho de poro de até ~ 45 nm foi construída dentro de um microcanal e aplicada à pré-concentração eletrocinética de amostras de DNA.

Criação de Sub-50 nm nanofluidic Junções em PDMS Microfluidic Chip via processo de automontagem de coloidal Particles

O protocolo para uma plataforma nova polarização da concentração de iões (ICP) que pode parar a propagação da zona de ICP, independentemente das condições de funcionamento é descrito. Esta capacidade única da plataforma encontra-se na utilização de fusão depleção de iões e de enriquecimento, que são duas polaridades do fenómeno ICP.

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

O presente protocolo descreve uma plataforma microfluidica pneumática que pode ser usada para uma concentração eficiente de micropartículas.

Plataforma microfluídica pneumática para concentração de micropartículas

A microfluídica é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de testes de diagnóstico. No entanto, equipamentos e materiais caros, bem como técnicas de fabricação e manuseio trabalhosas, são frequentemente necessários. Aqui, detalhamos o protocolo de fabricação de um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios magnéticos baseados em micro e nanopartículas em um ambiente de baixo custo e simples de usar.

Microfresagem de Controle Numérico Computacional de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com uma Restrição Escalonada para Imunoensaios Magnéticos Baseados em Nanoppartículas

Este protocolo descreve um processo simples que utiliza micromoldes plásticos convenientes para operações simples de microgravação para fabricar microcanais em papel celulose nanofibrilada, atingindo uma largura mínima de 200 μm.

Microgravação: Um Processo Conveniente para Fabricação de Microcanais em Microfluídica à Base de Papel de Nanocelulose

O protocolo descreve uma plataforma microfluídica avançada para medir quantitativamente a dinâmica da secreção de citocinas de células mononucleares individuais do sangue periférico humano. A plataforma mede até três citocinas em paralelo (IL-6, TNFα e IL-1β) para cada célula individual estimulada com lipopolissacarídeo como exemplo.

Abordagem microfluídica para resolver a secreção simultânea e sequencial de citocinas de células polifuncionais individuais 

Aprenda a purificação microfluídica de células engenheiradas usando dispositivo espiral com foco inercial diferencial. Este método de alta vazão remove eficientemente nanopartículas livres para aplicações em medicina regenerativa.

Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências

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