Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma tecnologia de purificação microfluídica conveniente, eficiente e de alto rendimento, para separar nanopartículas livres das células, seguindo a engenharia celular com as nanopartículas. A principal necessidade dessa tecnologia é permitir a remoção rápida e eficiente de nanopartículas não ligadas Após o procedimento de trabalho celular, reunimos todas as nossas ses-fa-ção. Esta tecnologia de purificação de células microfluídicas alcança uma separação eficiente baseada em tamanho devido aos efeitos diferenciais de foco inercial de células e nanopartículas em um microdispositivo espiral.

Ele pode processar até 10 milhões de células por concentração mil, o que é muito útil para a medicina regenerativa, bem como para o processamento de células de volume de trava. Esta tecnologia é altamente desejada para o campo de engenharia celular, que muitas vezes usa nanopartículas para células de trabalho, para fins de imagem ou controle de função. Demonstrando o procedimento estará Hui Min Tay, um assistente de pesquisa do meu laboratório, bem como o Dr. David Yeo, um pesquisador pós-doutor do laboratório do professor Xi.

Cultive células-tronco mesenquimais com mais de 80% de confluência em uma placa de seis poços antes de rotular as células com as nanopartículas. Da mesma forma, cultive células THP-1 com uma densidade de um milhão de células por mililitro. Em seguida, dissolva um miligrama de nanopartículas de sílica com um mililitro de duzentos micromolares

E mexa as partículas durante a noite. Além disso, fabrique nanopartículas de cálcio AM PLGA usando os métodos descritos na referência mostrada aqui. Misture um miligrama das nanopartículas de cálcio AM PLGA ou 150 microgramas das nanopartículas de sílica de cálcio em solução de 01% de poli-l-lisina em água, pipetando a solução para cima e para baixo por um minuto.

E então deixe incubar em temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Em seguida, centrifugue as nanopartículas. Remover o sobrenadante de poli-L-lisina em excesso e ressuspender as nanopartículas num mililitro do meio de cultura adequado para o tipo de célula a marcar.

Adicione 1 miligrama das nanopartículas marcadas a um mililitro de meio para cada milhão de células em cultura. Pipete a mistura de células, nanopartículas e meio completamente por um minuto. Em seguida, incube a mistura por aproximadamente 24 horas.

Uma vez marcadas, dissocie e colha as células-tronco e ressuspenda-as a uma concentração entre 100.000 e 1.000.000 células por mililitro para processamento microfluídico. Use células THP-1 marcadas na mesma concentração. Para fabricar o dispositivo espiral microfluídico, primeiro prepare um molde mestre de wafer de silicone usando técnicas padrão de microfabricação.

Em seguida, misture 30 gramas do pré-polímero PDMS base e três gramas de um agente de cura completamente em um recipiente de pesagem. Desgaseifique a mistura sob vácuo por 60 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. Despeje a mistura PDMS no molde mestre, padronizado com o design do canal em espiral, cuidadosamente a uma altura de cinco a 10 milímetros.

Em seguida, desgaseifique a mistura por 60 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. Repita esse processo até que todas as bolhas sejam eliminadas. Em seguida, coloque o wafer em um forno e certifique-se de que o wafer não esteja inclinado durante a cura, para garantir uma altura constante do dispositivo.

Catalise o PDMS a 80 graus Celsius por duas horas. Depois de esfriar, corte o dispositivo espiral PDMS usando um bisturi e retire cuidadosamente a placa PDMS do molde mestre. Em seguida, use um bisturi para aparar as bordas do dispositivo para garantir uma superfície lisa para a colagem.

Em seguida, use um punção de biópsia de 1,5 milímetro para criar dois orifícios para as entradas e dois orifícios para as saídas. Lave o dispositivo com isopropanol para remover quaisquer detritos. E seque o dispositivo em um forno a 80 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, use fita adesiva para limpar a superfície inferior do dispositivo PDMS e um lado de uma lâmina de vidro. Coloque cuidadosamente a lâmina de vidro e o dispositivo PDMS em uma câmara de plasma com as superfícies limpas expostas. Ligue a potência do plasma ao máximo, diminua a pressão da câmara até que a câmara fique rosa e exponha os componentes por 60 segundos.

Em seguida, remova a corrediça e o dispositivo PDMS da câmara. E una-os pressionando as superfícies expostas ao plasma firmemente juntas. Certifique-se de que nenhuma bolha fique presa entre as duas superfícies.

Aqueça o dispositivo colado em uma placa quente ajustada a 80 graus Celsius por duas horas para fortalecer a ligação. Corte dois pedaços de tubo de 15 a 20 centímetros de comprimento para as entradas e prenda uma agulha de calibre 23 em uma extremidade de cada tubo. Em seguida, corte dois pedaços do mesmo tubo com cinco a 10 centímetros de comprimento para as saídas e prenda-os nos orifícios de saída do dispositivo.

Antes de executar a amostra, prepare manualmente o dispositivo com uma seringa contendo 70% de etanol até que ele flua da tubulação de saída. Deixe o etanol descansar no dispositivo por pelo menos 30 segundos para esterilizá-lo. Em seguida, carregue 30 mililitros de PBS filtrado com 1% BSA em uma seringa de 60 mililitros.

Além disso, coloque três mililitros de células marcadas em uma seringa de três mililitros e verifique se nenhuma bolha de ar está presa em nenhuma das seringas. Remova quaisquer bolhas de ar ejetando suavemente algumas gotas de líquido do bico. Conecte as pontas da seringa de entrada e o tubo às seringas e prenda as seringas às bombas das seringas.

Insira os tubos em suas respectivas entradas do dispositivo e certifique-se de que não haja bolhas ao longo da tubulação. Com os fluidos agora configurados, monte o dispositivo em um microscópio de contraste de fase invertida para obter imagens em tempo real durante o processo de classificação de células. Prenda um pequeno copo de resíduos e dois tubos de 15 mililitros perto do dispositivo no microscópio stage.

Coloque o tubo de saída de ambas as saídas do dispositivo no copo de resíduos. Agora, defina a taxa de fluxo da amostra para o tampão da bainha para um a 10, definindo a taxa de fluxo da seringa de amostra para 120 microlitros por minuto e a seringa da bainha para 1.200 microlitros por minuto. Execute o dispositivo por um minuto e meio para dar à taxa de fluxo uma chance de estabilizar.

Use uma câmera de alta velocidade para confirmar a presença de células focadas inercialmente perto da parede interna do canal sob campo claro com contraste de fase. Assim que o fluxo de estado estacionário for alcançado e o dispositivo estiver funcionando corretamente, posicione os tubos de saída em frascos diferentes para coletar eluentes separados da saída da célula e da saída de resíduos. Este dispositivo é capaz de classificar corretamente uma suspensão marcada de células monocíticas THP-1 a partir de nanopartículas de sílica fluorescente.

Altas eficiências de separação foram obtidas, conforme confirmado por imagens de alta velocidade e análise de citometria de fluxo. A estratégia de purificação de etapa única permite a recuperação contínua de uma suspensão marcada e células aderentes que são suspensas em solução tampão fresca sem a necessidade de centrifugação. O dispositivo é capaz de separação de alta eficiência com nanopartículas de sílica e PLGA e pode separar até 10 milhões de células por mililitro com a mesma alta eficiência.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular células com nanopartículas. E como purificar as células marcadas removendo o excesso de partículas não ligadas usando nosso dispositivo microfluídico especializado.