Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado
1 de abril de 2011
Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.
O objetivo geral deste procedimento é monitorar alterações na concentração de cálcio mitocondrial em células vivas. Isso é realizado primeiramente transfectando as células com a proteína indicadora de cálcio ratiométrica peram, direcionada à matriz mitocondrial, um ou dois dias após a transfeção. O microscópio de fluorescência e o software são configurados para imageamento de células vivas.
São então adquiridas imagens de células expressando o indicador ratiométrico após a adição de um agonista mobilizador de cálcio. O passo final do procedimento é a análise quantitativa das imagens adquiridas. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram alterações dinâmicas na concentração mitocondrial de cálcio por meio de microscopia de fluorescência de células vivas expressando uma proteína indicadora ratiométrica de cálcio.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a medição dos níveis de cálcio utilizando indicadores sintéticos de cálcio, é que o peram métrico é codificado geneticamente e, portanto, pode ser direcionado às mitocôndrias ou a qualquer outro organelo de interesse. Olá, sou o Dr. Ascar, pós-doutorando no laboratório da Dra. Benning, e hoje demonstrarei o procedimento. Para iniciar o protocolo, plaque as células HeLa na noite anterior à transfeção em lamínulas de vidro estéreis colocadas em uma placa de cultura padrão de seis poços, numa densidade que resulte em aproximadamente 70% de confluência no dia seguinte, no momento da transfeção. No dia seguinte, prepare os complexos de DNA com Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante, utilizando quatro microgramas do vetor de expressão mitocondrial do peram métrico e 10 microlitros de Lipofectamina 2000 diluídos em 0,5 mililitros de Opti-MEM para cada poço a ser transfectado.
Em seguida, substitua o meio de cultura D-M-E-M-F-B-S HELOC em cada poço por 1,5 mililitros do mesmo meio sem antibióticos. Adicione a solução LIPECTOMY à solução de DNA e misture suavemente após a formação dos complexos. Adicione a solução de DNA Lipectomy gota a gota em cada poço a ser transfectado, misturando com movimentos suaves de vaivém na placa, e incube por quatro horas em um incubador de cultura celular a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, após o período de incubação.
Substitua o meio por D-M-E-M-F-B-S contendo antibióticos. Deixe as células expressarem a métrica peram por um a dois dias antes da imagem usando pinça. Coloque suavemente uma lamínula com células HELOC em uma câmara de imagem apropriada com solução de imagem.
Monte a câmara de imagemação no estágio de um microscópio invertido. Em seguida, utilize uma objetiva de imersão em óleo de 40x ou maior e um comprimento de onda de 380 nanômetros. Para encontrar uma área de interesse contendo uma ou mais células expressando peram métrico de razão, 380 nanômetros é usado aqui para identificar as células como métricas de razão.
Peram é menos resistente ao fotodesbotamento neste comprimento de onda. Após identificar uma área de interesse, configure o software para excitação dupla em 495 e 380 nanômetros. Em seguida, adquira imagens sequencialmente, excitando alternadamente em 495 e 380 nanômetros.
Adquira imagens dos níveis basais de cálcio por pelo menos 30 segundos antes da aplicação do agonista. Em seguida, aplique o agonista mobilizador de cálcio por meio de um aparelho de perfusão, anotando o momento da adição; os tempos de exposição ao agonista e os intervalos de aquisição devem ser otimizados para prevenir o desbotamento pela luz, ao mesmo tempo em que permitem uma resolução temporal suficiente. Após a conclusão do experimento, as imagens podem ser analisadas offline.
Para iniciar a análise, selecione uma região de interesse dentro de uma área vazia do campo para subtrair a fluorescência de fundo, se necessário. Em seguida, exporte as medidas da razão 4 95 3 80 da região de interesse para o Excel ou outro software gráfico similar. Este painel de imagens mostra a localização subcelular do peram métrico de razão e das mitocôndrias.
À esquerda, há uma imagem de células vivas de células HeLa expressando peramétrico de razão. No centro, está a coloração fluorescente das mitocôndrias com o corante seletivo MitoTracker Red CMXRos. Finalmente, à direita, a imagem mesclada mostrada aqui é uma série de imagens de razão em pseudocores de 495 e 380 nanômetros de quatro células HeLa expressando peramétrico de razão nas mitocôndrias, tratadas com 10 micromolar de ATP, e a quantificação das alterações nos níveis mitocondriais de cálcio dessas quatro células anteriores é mostrada aqui nesta imagem de uma célula HeLa expressando peramétrico de razão nas mitocôndrias.
A heterogeneidade da resposta ao cálcio em mitocôndrias individuais, bem como a fragmentação acentuada das mitocôndrias, é evidente após 60 minutos de tratamento com 0,5 micromolar de estorporina. Algumas mitocôndrias apresentam aumentos oscilatórios de cálcio, indicados pela seta branca, enquanto outras não mostram alterações significativas nos níveis de cálcio, indicadas por uma seta amarela. Este gráfico revela a alteração nos níveis globais de cálcio mitocondrial em uma única célula HELO após a indução da apoptose por 120 minutos com 0,5 micromolar de estorporina.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir alterações dinâmicas nos níveis de cálcio mitocondrial em resposta a diversos tli usando a proteína mediadora de cálcio R geometric peram, que é direcionada seletivamente à matriz mitocondrial.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para a medição em tempo real de fluxos de cálcio mitocondrial utilizando um indicador de cálcio codificado geneticamente, o pericâmio ratiométrico-mt. Esta técnica permite o monitoramento dinâmico dos níveis de cálcio em células vivas, fornecendo insights sobre a função mitocondrial.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imagem de Fluorescência
Contexto
- Os níveis de cálcio mitocondrial são cruciais para o metabolismo celular e a sinalização.
- Os métodos tradicionais para medir os níveis de cálcio geralmente dependem de indicadores sintéticos.
- Os indicadores codificados geneticamente oferecem vantagens em especificidade e direcionamento.
- Este estudo utiliza o pericam-mt ratiométrico para melhorar a imagem da dinâmica de cálcio mitocondrial.
Objetivo do Estudo
- Monitorar alterações na concentração de cálcio mitocondrial em células vivas.
- Demonstrar o uso de um indicador genético de cálcio direcionado às mitocôndrias.
- Fornecer um protocolo detalhado para o registro e análise de fluxos de cálcio mitocondrial.
Métodos Utilizados
- Transfeção de células com pericâm-mt ratiométrico.
- Imageamento de células vivas utilizando microscopia de fluorescência.
- Excitação sequencial em comprimentos de onda duplos para medição de cálcio.
- Análise quantitativa de imagens de fluorescência para avaliar a dinâmica do cálcio.
Resultados Principais
- As alterações dinâmicas nos níveis de cálcio mitocondrial foram medidas com sucesso.
- Foi observada heterogeneidade nas respostas de cálcio entre mitocôndrias individuais.
- Fragmentação significativa das mitocôndrias foi observada sob certos tratamentos.
- Os resultados demonstraram a eficácia do pericam-mt ratiométrico para imagem em tempo real.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar a dinâmica do cálcio mitocondrial.
- Indicadores geneticamente codificados, como o pericampo ratiométrico-mt, aprimoram as capacidades de imagem.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversas condições experimentais para investigar a função mitocondrial.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O monitoramento da dinâmica do cálcio mitocondrial fornece informações mecanicistas essenciais sobre as vias de apoptose, permitindo a validação de alvos nos mecanismos de morte celular. Essa abordagem com sensores geneticamente codificados aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao quantificar os fluxos de cálcio específicos de organelas com resolução temporal. O método facilita a redução precoce de riscos em hipóteses terapêuticas envolvendo disfunção mitocondrial em modelos de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar o cálcio mitocondrial como regulador de vias apoptóticas para testes de hipóteses direcionadas.
- Valor Operacional: Fornece leituras específicas de organelas que reduzem a ambiguidade em estudos mecanicistas da morte celular.
- Valor Preditivo: Apoia a validação funcional de alvos envolvidos na apoptose mediada por cálcio por meio de medidas de fluxo em tempo real.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos ratiométricos que permitem análise de resposta à dose de compostos que afetam o cálcio mitocondrial.
- Valor Operacional: Compatível com microscopia padrão de campo amplo, permitindo integração em plataformas de imagem existentes sem necessidade de equipamentos especializados.
- Valor de Escalabilidade: Permite o rastreamento longitudinal da dinâmica de cálcio e da morfologia mitocondrial em células vivas ao longo de horas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona alterações no cálcio mitocondrial com desfechos apoptóticos, reforçando a relevância de biomarcadores em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Demonstra utilidade tanto com ATP (agonista fisiológico) quanto com estaurosporina (indutor de apoptose), ampliando a aplicabilidade em diferentes condições experimentais.
- Continuidade Translacional: Facilita a transição da descoberta de mecanismos para a validação pré-clínica, fornecendo leituras dinâmicas e fisiologicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a desvinculação mecanicista e a avaliação pré-clínica, fornecendo dados dinâmicos e quantificáveis sobre a função mitocondrial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias apoptóticas dependentes de cálcio por meio de medições em tempo real do fluxo mitocondrial.
- Triagem: Permite sistemas prontos para ensaios com leituras padronizadas e reprodutíveis de cálcio para campanhas de triagem de compostos.
- Análises: Fornece saídas quantitativas ratiométricas (razão de excitação 495nm/380nm) que permitem comparação estatística da dinâmica de cálcio entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações do cálcio mitocondrial com fenótipos apoptóticos, apoiando a continuidade entre mecanismo e resultado fenotípico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável para o estudo da disfunção mitocondrial em diversas áreas de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de apoptose.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de indicadores geneticamente codificados e direcionados a organelas, que evitam vazamento de corantes e artefatos.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção ao fornecer insights precoces e quantitativos sobre os mecanismos mitocondriais de ação de compostos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis de modulação do cálcio mitocondrial.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular para transfeção e microscopia de células vivas.
- Depende de microscopia de fluorescência com capacidade de dupla excitação (380 nm e 495 nm) e conjuntos padrão de filtros.
- Necessita padronização dos protocolos de aquisição de imagens e análise de regiões de interesse entre equipes.
- As considerações para adaptação incluem a eficiência de direcionamento mitocondrial e possíveis artefatos de superexpressão em diferentes modelos celulares.
- As limitações práticas incluem os riscos de fotodesvanecimento durante imagens de longo prazo e a necessidade de otimização dos intervalos de exposição ao agonista.
