Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

O objetivo geral deste procedimento é monitorar as mudanças na concentração de cálcio mitocondrial em células vivas. Isso é feito primeiro pela transecção de células com a proporção de proteína indicadora de cálcio peram, que é direcionada para a matriz mitocondrial, um ou dois dias após a transfecção. O microscópio de fluorescência e o software são configurados para imagens de células vivas.

Imagens de células que expressam peram métricas de proporção são então adquiridas após a adição de um agonista mobilizador de cálcio. A etapa final do procedimento é a análise quantitativa das imagens adquiridas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças dinâmicas na concentração de cálcio mitocondrial por meio de microscopia de fluorescência de células vivas expressando uma proteína indicadora de cálcio métrica de proporção.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a medição dos níveis de cálcio usando indicadores sintéticos de cálcio, é que a proporção métrica peram é geneticamente codificada e, portanto, pode ser direcionada para mitocôndrias ou qualquer outro órgão de interesse. Olá, sou o Dr.Ascar, um pós-doutorado no laboratório do Dr.Benning, e estarei demonstrando o procedimento hoje Para iniciar as células heliológicas da placa de protocolo na noite anterior, transfecção em lamínulas de vidro estéreis colocadas em uma placa de cultura padrão de seis poços em uma densidade que será aproximadamente 70% con fluente para transfecção no dia seguinte. No dia seguinte, prepare complexos de DNA Lipectomia 2000 de acordo com as instruções do fabricante com quatro microgramas de vetor de expressão mitocondrial peram métrica e 10 microlitros de lipectomia 2000 diluídos em 0,5 mililitros de ideal para cada poço a ser transfectado.

Em seguida, substitua o meio de cultura D-M-E-M-F-B-S HELOC em cada poço por 1,5 mililitros do mesmo meio sem antibióticos. Adicione a solução de LIPECTOMIA à solução de DNA e misture suavemente após a formação dos complexos. Adicione a solução de DNA Lipectomia gota a gota a cada poço a ser transfectado misturado balançando suavemente a placa e incube por quatro horas em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono após a incubação.

Substitua o meio por D-M-E-M-F-B-S contendo antibióticos. Permita que as células expressem o peram métrico por um a dois dias antes da imagem usando fórceps. Coloque suavemente uma lamínula com células HELOC em uma câmara de imagem apropriada com solução de imagem.

Monte a câmara de imagem em um microscópio invertido stage. Em seguida, use uma objetiva de imersão em óleo de 40 x ou mais e um comprimento de onda de 380 nanômetros. Para encontrar uma área de interesse contendo uma ou mais células expressando métrica de razão peram 380 nanômetros é usado aqui para identificar as células como métrica de razão.

Peram é menos resistente ao fotobranqueamento neste comprimento de onda. Uma vez identificada uma área de interesse, configure o software para excitação dupla em 495 e 380 nanômetros. Em seguida, adquira imagens sequencialmente, alternadamente excitando em 495 e 380 nanômetros.

Adquira imagens dos níveis basais de cálcio por pelo menos 30 segundos antes da aplicação do agonista. Em seguida, aplique o agonista mobilizador de cálcio por meio de um aparelho de profusão, observando que o tempo de adição para cada agonista os tempos de exposição e os intervalos de aquisição devem ser otimizados para evitar o fotobranqueamento e ainda permitir resolução temporal suficiente. Quando o experimento for concluído, as imagens poderão ser analisadas offline.

Para iniciar a análise, selecione uma região de interesse dentro de uma área vazia do campo para subtrair a fluorescência de fundo, se necessário. Em seguida, exporte as medidas de proporção 4 95 3 80 da região de interesse para o Excel ou software gráfico semelhante. Este painel de imagens mostra a localização subcelular da razão métrica peram e mitocôndrias.

À esquerda está uma imagem de célula viva de células helicoidôneas expressando a razão métrica peram. No meio está a coloração fluorescente das mitocôndrias e o corante seletivo do rastreador do MIT vermelho CMX Ross. E, finalmente, à direita, a imagem mesclada mostrada aqui é uma série de imagens pseudocoloridas de proporção 4 95, 3 80 nanômetros de quatro células helo expressando peram métrica de proporção nas mitocôndrias tratadas com 10 micromolares A TP, e a quantificação das mudanças nos níveis de cálcio mitocondrial dessas quatro células anteriores é mostrada aqui nesta imagem de uma célula hela expressando peram métrica de proporção nas mitocôndrias.

A heterogeneidade da resposta do cálcio nas mitocôndrias individuais, bem como a fragmentação significativa das mitocôndrias, é evidente por 60 minutos de tratamento com esporina stor 0,5 micromolar. Algumas mitocôndrias têm aumentos oscilatórios no cálcio mostrados com a seta branca, enquanto outras não mostram alterações significativas no nível de cálcio mostrados com uma seta amarela. Este gráfico revela a mudança nos níveis globais de cálcio mitocondrial em uma única célula heliogênica após a indução de apoptose por 120 minutos com 0,5 micromolar stor sporin.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir as mudanças dinâmicas nos níveis de cálcio mitocondrial em resposta a vários tli usando a proteína geométrica R medicada com cálcio, que é direcionada seletivamente para a matriz mitocondrial.