Name: Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Aprenda a monitorar dinamicamente os níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose usando o indicador geneticamente codificado ratiometric pericam-mt em células vivas. Este método permite análise quantitativa em tempo real.

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Gostaríamos de agradecer a Atsushi Miyawaki para fornecer-nos com a construção de expressão raciométrica-pericam-mt. Este trabalho foi financiado por bolsa GM081685 do National Institutes of Health (DB).

1. Pericam-mt Transfection e Preparação Cell. <ol><li> Células HeLa placa na noite anterior transfecção em lamínulas estéreis colocados em uma placa de cultura padrão de 6 poços. </li><li> Prepare DNA / 2000 Lipofectamine complexos, como sugerido pelo fabricante (Invitrogen). Nós usamos 4 mg de raciométrica-pericam-mt vetor de expressão e de 10 mL de 2000 Lipofectamine diluído em 0,5 mL de Opti-MEM para cada poço. As células devem ser confluentes ~ 70% antes de transfecção. </li><li> Substituir HeLa cultura da mídia (modificado Dulbecco águias médio, 10% de SFB, penicilina / estreptomicina) em cada poço com 1,5 mL do mesmo meio sem antibióticos. </li><li> Adicionar os complexos DNA / Lipofectamine a cada poço a ser transfectadas. Misture delicadamente com balanço e incubar por quatro horas em uma cela cultura incubadora a 37 o C, 5% CO 2. </li><li> Substituir antibióticos de mídia livre com meios de cultura com antibióticos. Permitem que as células para expressar pericam raciométrica por 1-2 dias antes da imagem. </li></ol> 2. Setup microscópio e Aquisição de Imagem <ol><li> Coloque uma lamela com células HeLa em uma câmara de imagem apropriado com solução de imagem: 107mm NaCl, KCl 7.2mm, 1.2mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11,5 mm de glicose, 0,1% de albumina bovina sérica e HEPES 20mM 7.2. Nosso laboratório utiliza a câmara de célula Attofluor da Invitrogen. Monte a câmara de imagem em um estágio do microscópio invertido. </li><li> Encontrar uma área de interesse contendo uma ou mais células que expressam pericam raciométrica usando um 40x (ou superior) objetiva de imersão em óleo. Descobrimos que pericam proporcional está menos resistentes à fotodegradação a 380 nm e, assim, usar esse comprimento de onda para identificar células adequado. Para as imagens obtidas na Figura 1, a Nikon objetivo Superfluor 40X com uma abertura numérica 1,3 foi utilizado. Objetivos maior ampliação também seria apropriado (60-100x). Filtros de excitação utilizadas foram Chroma Tecnologia filtros D380/30x (380 + / - 30 nm) e D495/10 (495 + / - 5 nm), refletores foi 505DCXR (505nm longpass), e emissão de filtro foi HQ535/50m (535 + / - 25nm). Nosso microscópio usado para adquirir as imagens na Figura 1 consiste de um microscópio invertido Nikon TE2000 equipado com um Roper Scientific Coolsnap HQ resfriado câmera CCD, Ludl MAC6000 rápida roda de filtros e changer, e um MetaFluor aquisição de dados e software de análise. Este protocolo pode ser adaptado a qualquer microscópio de campo amplo padrão com os filtros adequados e software capaz de capturar e processar imagens raciométrica. </li><li> Configurar o software para a excitação dupla usando o 495 e 380 nm filtros. Cálcio ligação a pericam raciométrica aumenta a absorvância a 495 nm, assim, a relação deve ser configurado para ser 495 nm/380 nm. Raciométrica pericam tem um pico de cálcio livre de excitação em 415 nm 4. Neste protocolo, sugerimos usar um filtro de 380 nm só porque ele é onipresente na maioria dos laboratórios de imagem de cálcio. Se um filtro de 410 nm está disponível, é preferível o filtro nm 380. </li><li> Adquirir imagens sequencialmente por alternativamente emocionante em 495 e 380 nm. Adquirir imagens dos níveis de cálcio de base por pelo menos 30 s antes da aplicação do agonista através de um aparelho de perfusão. Marcar o tempo de adição para cada agonista. Tempos de exposição e os intervalos de aquisição deve ser otimizado para evitar fotobranqueamento enquanto ainda permitindo exemplo resolution.For suficiente temporal, para a dinâmica de semi-rápidas de cálcio monitorados em resposta à estimulação agonista, imagens foram adquiridas a cada dois segundos nas Figuras 1B e taxas C. Muito mais rápido aquisição Também é possível 6. Longo prazo de imagens após a administração estaurosporina foi adquirido com um intervalo mais longo (30s) entre as aquisições (Figura 1 D e E). </li></ol> 3. Processamento de Imagem e Análise <ol><li> Uma vez que a experiência é completa, imagens obtidas podem ser analisadas offline. Definir as regiões de interesse (ROI) em que você deseja monitorar mudanças nos níveis de cálcio. Use um ROI selecionada dentro de uma área vazia do campo para subtrair fundo, se necessário. Note-se que as mitocôndrias são bastante móveis e dinâmicos, e eventos extrapolando em uma única mitocôndria durante longos períodos nem sempre é possível. Assim, considerando a alta motilidade dessa organela em alguns tipos de células, a seleção de ROI devem ser cuidadosamente monitorizados. Além disso, como evidenciado na Figura 1, a resposta mitocôndrias heterogeneamente a vários estímulos. Portanto, é importante para analisar os dados offline e monitorar RO1 colocação em uma base quadro-a-quadro. A descrição detalhada de medição de cálcio mitocondrial em alta motilidade mitocôndrias tem sido descrito em outros lugares 7. </li><li> Medições obtidas a partir do ROI pode ser importado para o Excel ou graphingsoftware similar. Os dados podem ser apresentados como um traço que representa as alterações nos níveis de cálcio mitocondrial em uma única célula ou mitocôndria única, ou uma média de fluorescence sinais de ROI diversas. Temos também utilizado esta técnica para medir os níveis de cálcio média mitocondrial em uma população de linfócitos em apoptose induzida pelo Fas ligante 8. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) localização subcelular de raciométrica-pericam-mt. Esta primeira imagem mostra células HeLa viver expressando raciométrica-pericam-mt. A segunda imagem mostra a coloração fluorescente com mitocôndria seletivo corante CMXRos MitoTracker Vermelho. A fluorescência amarelo na imagem fundiu demonstra co-localização de raciométrica-pericam-mt e fluorescência MitoTracker. (B) Uma série de pseudo-relação (495:380 nm) imagens de 4 células HeLa expressar mt-raciométrica pericam tratados com 10 mM ATP . (C) Quantificação das mudanças dos níveis de cálcio mitocondrial na região de interesse (ROI) indicada em (B) tratados com 10 mM ATP. Series (D) de pseudo-relação (495:380 nm) imagens de uma célula HeLa expressar mt -raciométrica pericam tratados com 0,5 mM estaurosporina. Heterogeneidade na resposta de cálcio na mitocôndria indivíduo é evidente, bem como a fragmentação significativa das mitocôndrias por 60 minutos. Alguns têm mitocôndrias aumenta oscilatório em cálcio (cabeça de seta branca), enquanto outros não demonstram alterações significativas no nível de cálcio (cabeça de seta amarela). (E) Quantificação dos aumentos globais nos níveis de cálcio mitocondrial em uma célula HeLa única após a indução de apoptose com 0,5 mM estaurosporina.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2%2B+concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li>
<li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li>
<li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binds+to+inositol+%281%2C4%2C5%29+trisphosphate+receptors%2C+amplifying+calcium-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li>
<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH%3A+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui apresentamos um método muito simples para a medição de cálcio mitocondrial utilizando-alvo mitocondrial pericam raciométrica. Conforme mostrado na Figura 1A, usando o padrão Widefield óptica sem deconvolução é possível visualizar facilmente mitocôndrias nas células HeLa individuais com relação sinal-ruído aceitável. Isso ocorre porque as células HeLa, como a maioria das células em cultura, achatar significativamente quando aderente evitando a necessidade de microscopia confocal ou outros equipamentos especializados. Temos encontraram resultados semelhantes em células Jurkat adere a poli-lisina lamínulas revestido 8. Em contraste com metodologias usando corantes, também é possível de forma não invasiva monitorar os níveis de cálcio mitocondrial durante horas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificado como pericam raciométrica (Figura 1E). Isto é especialmente importante quando se analisa o cálcio mitocondrial durante a morte celular. Além disso, também é possível visualizar a cisão / fragmentação da mitocôndria durante o processo de apoptose. Como mostrado nas Figuras 1D e E, o tratamento estaurosporina causa um aumento lento em cálcio em subpopulações seleto de mitocôndrias, que picos em 20 minutos. Níveis de cálcio descer novamente concomitante com a fragmentação mitocondrial antes de subir novamente 2 horas após o tratamento. Isto é consistente com as ondas lentas em cálcio citosólico induzido pelo tratamento estaurosporina medida usando Fura-2 9. Assim, as informações cinética importantes podem ser obtidos que não é possível com métodos que empregam medições estáticas. Embora tenhamos apresentado índices e concentrações de cálcio não na Figura 1, é possível calibrar o sensor in situ para calcular os níveis de cálcio absoluta 4, 10. Uma ressalva importante a considerar é que pericam raciométrica é sensível ao pH 4, 10. Como ambos os níveis de pH citosólico e mitocondrial podem mudar dramaticamente durante a apoptose 11, esta é uma consideração importante. Titulação de pH em pericam mitocôndrias isoladas expressar demonstrar que o aumento da [H +] de emissão aumentos de pericam quando animado em 495 nm, com pouco efeito sobre a emissão estimulada pela excitação a 410 nm, uma propriedade que tem sido explorada para medir simultaneamente tanto cálcio mitocondrial e pH 12. Assim, seletivamente monitoramento de emissões com 410 nm de excitação fornece um meio de não-ratiometrically cálcio mitocondrial acompanhar com preocupação reduzida para pH. Finalmente, o protocolo aqui apresentado requer apenas o acesso a um microscópio de epifluorescência com filtros padrão amplamente disponível, tornando essa técnica acessível para a maioria dos laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Microscópio invertido de imagem de fluorescência de campo amplo</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>Qualquer microscópio invertido de campo amplo equipado com filtros de excitação de 380 nm/495 nm e filtros de longpass e emissão apropriados pode ser facilmente adaptado para utilizar este protocolo.</td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Câmara celular Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>Qualquer câmara de imagem para microscópio invertido que permita perfusão seria suficiente.</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>A maioria dos reagentes/protocolos de transfeção seria apropriada para estes estudos</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

mudanças dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Mudanças dinâmicas na concentração de cálcio intracelular em resposta a vários estímulos regula muitos processos celulares como a proliferação, diferenciação e apoptose 1. Durante a apoptose acúmulo de cálcio, na mitocôndria promove a liberação de fatores pró-apoptóticos da mitocôndria para o citosol 2. É, portanto, de interesse para medir diretamente cálcio mitocondrial em células vivas in situ durante a apoptose. Alta resolução de imagem fluorescente de células carregadas de excitação dupla raciométrica e não raciométrica corantes indicador sintético de cálcio tem sido provado ser uma ferramenta confiável e versátil para estudar vários aspectos da sinalização do cálcio intracelular. Medir os fluxos de cálcio citosólico utilizando estas técnicas é relativamente simples. No entanto, medindo os níveis de cálcio nas células intactas intramitocondrial utilizando indicadores de cálcio sintéticos como Rhod-2 e Rhod-FF é mais desafiador. Indicadores sintéticos direcionados para as mitocôndrias têm embotado respostas repetitivas a um aumento no cálcio mitocondrial, e interromper a morfologia mitocondrial 3. Além disso, indicadores sintéticos tendem a vazar para fora da mitocôndria durante várias horas o que os torna inadequados para experimentos de longa duração. Assim, os indicadores de cálcio geneticamente codificado com base em proteína fluorescente verde (GFP) 4 ou 5 aequorin direcionados para as mitocôndrias têm muito facilitada medição da dinâmica do cálcio mitocondrial. Aqui, descrevemos um método simples para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial em resposta a estímulos diferentes. O método é baseado em microscopia de fluorescência de &#39;raciométrica-pericam &quot;, que é seletivamente direcionados para as mitocôndrias. Pericam raciométrica é um indicador de cálcio baseado em uma fusão de circularmente permutados proteína fluorescente amarela e calmodulina 4. A ligação do cálcio para pericam raciométrica provoca uma mudança de seu pico de excitação de 415 nm a 494 nm, enquanto que o espectro de emissão, que picos em torno de 515 nm, permanece inalterado. Raciométrica pericam liga um íon de cálcio com uma única constante de dissociação in vitro de ~ 1,7 mM 4. Estas propriedades do pericam raciométrica permitem a quantificação de mudanças rápidas e de longo prazo na concentração de cálcio mitocondrial. Além disso, descrevemos a adaptação desta metodologia a um padrão de imagem do microscópio de campo amplo de cálcio com comumente disponíveis conjuntos de filtros. Usando dois agonistas distintos, o agonista purinérgico ATP e indução de apoptose estaurosporina de drogas, demonstram que este método é apropriado para monitorar mudanças na concentração de cálcio mitocondrial com uma resolução temporal de segundos a horas. Além disso, também demonstram que pericam raciométrica também é útil para medir a fissão mitocondrial / fragmentação durante a apoptose. Assim, pericam raciométrica é particularmente adequado para a medição contínua de longo prazo da dinâmica do cálcio mitocondrial durante a apoptose.

Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Alterações dinâmicas na concentração de cálcio intracelular em resposta a diversos estímulos regulam muitos processos celulares, tais como a proliferação, ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar alterações na concentração de cálcio mitocondrial em células vivas. Isso é realizado primeiramente transfectando as células com a proteína indicadora de cálcio ratiométrica peram, direcionada à matriz mitocondrial, um ou dois dias após a transfeção. O microscópio de fluorescência e o software são configurados para imageamento de células vivas.São então adquiridas imagens de células expressando o indicador ratiométrico após a adição de um agonista mobilizador de cálcio. O passo final do procedimento é a análise quantitativa das imagens adquiridas. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram alterações dinâmicas na concentração mitocondrial de cálcio por meio de microscopia de fluorescência de células vivas expressando uma proteína indicadora ratiométrica de cálcio.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a medição dos níveis de cálcio utilizando indicadores sintéticos de cálcio, é que o peram métrico é codificado geneticamente e, portanto, pode ser direcionado às mitocôndrias ou a qualquer outro organelo de interesse. Olá, sou o Dr. Ascar, pós-doutorando no laboratório da Dra. Benning, e hoje demonstrarei o procedimento. Para iniciar o protocolo, plaque as células HeLa na noite anterior à transfeção em lamínulas de vidro estéreis colocadas em uma placa de cultura padrão de seis poços, numa densidade que resulte em aproximadamente 70% de confluência no dia seguinte, no momento da transfeção. No dia seguinte, prepare os complexos de DNA com Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante, utilizando quatro microgramas do vetor de expressão mitocondrial do peram métrico e 10 microlitros de Lipofectamina 2000 diluídos em 0,5 mililitros de Opti-MEM para cada poço a ser transfectado.Em seguida, substitua o meio de cultura D-M-E-M-F-B-S HELOC em cada poço por 1,5 mililitros do mesmo meio sem antibióticos. Adicione a solução LIPECTOMY à solução de DNA e misture suavemente após a formação dos complexos. Adicione a solução de DNA Lipectomy gota a gota em cada poço a ser transfectado, misturando com movimentos suaves de vaivém na placa, e incube por quatro horas em um incubador de cultura celular a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, após o período de incubação.Substitua o meio por D-M-E-M-F-B-S contendo antibióticos. Deixe as células expressarem a métrica peram por um a dois dias antes da imagem usando pinça. Coloque suavemente uma lamínula com células HELOC em uma câmara de imagem apropriada com solução de imagem.Monte a câmara de imagemação no estágio de um microscópio invertido. Em seguida, utilize uma objetiva de imersão em óleo de 40x ou maior e um comprimento de onda de 380 nanômetros. Para encontrar uma área de interesse contendo uma ou mais células expressando peram métrico de razão, 380 nanômetros é usado aqui para identificar as células como métricas de razão.Peram é menos resistente ao fotodesbotamento neste comprimento de onda. Após identificar uma área de interesse, configure o software para excitação dupla em 495 e 380 nanômetros. Em seguida, adquira imagens sequencialmente, excitando alternadamente em 495 e 380 nanômetros.Adquira imagens dos níveis basais de cálcio por pelo menos 30 segundos antes da aplicação do agonista. Em seguida, aplique o agonista mobilizador de cálcio por meio de um aparelho de perfusão, anotando o momento da adição; os tempos de exposição ao agonista e os intervalos de aquisição devem ser otimizados para prevenir o desbotamento pela luz, ao mesmo tempo em que permitem uma resolução temporal suficiente. Após a conclusão do experimento, as imagens podem ser analisadas offline.Para iniciar a análise, selecione uma região de interesse dentro de uma área vazia do campo para subtrair a fluorescência de fundo, se necessário. Em seguida, exporte as medidas da razão 4 95 3 80 da região de interesse para o Excel ou outro software gráfico similar. Este painel de imagens mostra a localização subcelular do peram métrico de razão e das mitocôndrias.À esquerda, há uma imagem de células vivas de células HeLa expressando peramétrico de razão. No centro, está a coloração fluorescente das mitocôndrias com o corante seletivo MitoTracker Red CMXRos. Finalmente, à direita, a imagem mesclada mostrada aqui é uma série de imagens de razão em pseudocores de 495 e 380 nanômetros de quatro células HeLa expressando peramétrico de razão nas mitocôndrias, tratadas com 10 micromolar de ATP, e a quantificação das alterações nos níveis mitocondriais de cálcio dessas quatro células anteriores é mostrada aqui nesta imagem de uma célula HeLa expressando peramétrico de razão nas mitocôndrias.A heterogeneidade da resposta ao cálcio em mitocôndrias individuais, bem como a fragmentação acentuada das mitocôndrias, é evidente após 60 minutos de tratamento com 0,5 micromolar de estorporina. Algumas mitocôndrias apresentam aumentos oscilatórios de cálcio, indicados pela seta branca, enquanto outras não mostram alterações significativas nos níveis de cálcio, indicadas por uma seta amarela. Este gráfico revela a alteração nos níveis globais de cálcio mitocondrial em uma única célula HELO após a indução da apoptose por 120 minutos com 0,5 micromolar de estorporina.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir alterações dinâmicas nos níveis de cálcio mitocondrial em resposta a diversos tli usando a proteína mediadora de cálcio R geometric peram, que é direcionada seletivamente à matriz mitocondrial.

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Ensaio de influxo de cálcio para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

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A homeostase do cálcio do retículo endoplasmático é interrompida em diversas patologias.  Um repórter de proteína de monitoramento de cálcio ER secretado (SERCaMP) pode ser usado para detectar interrupções no armazenamento de cálcio ER.   Este protocolo descreve o uso de um SERCaMP de Gaussia luciferase para examinar a homeostase do cálcio do RE in vitro e in vivo.

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para a aplicação de rodamina 123 para identificar o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e estudar CLIC4 induzida por nocaute HN4 celular apoptose em vitro. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, registou-se a mudança em tempo real do MMP.

Deteção do potencial de membrana mitocôndria para estudar CLIC4 HN4 induzida em Knockdown celular apoptose em Vitro

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca2 + afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca2 + importação ensaio usando o Ca2 + sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca2 + Rhod-2h.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

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