Mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca^{2 +} e Ca^{2 +}- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

O objetivo geral deste experimento é determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial no inchaço mitocondrial induzido por cálcio. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da disfunção mitocondrial, como o metabolismo energético anormal. A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito simples e eficaz.

Para começar, semeie cerca de três milhões de células SH-SY5Y por placa de cultura de células de 10 centímetros. Remova o meio e lave as células com cerca de um mililitro de PBS gelado em uma placa de cultura de células de 10 centímetros três vezes. Adicione um mililitro de PBS gelado na placa de cultura de células de 10 centímetros e raspe as células aderentes em um novo tubo de 1,5 mililitro.

Centrifugue a 800 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Durante a centrifugação, prepare cinco mililitros de tampão de isolamento mitocondrial, suplementado com 50 microlitros de solução estoque de inibidor de protease. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial.

Incube o tubo de 1,5 mililitro no gelo por 30 minutos. Em seguida, lise as células suspensas com um homogeneizador de vidro, para cima e para baixo manualmente no gelo. Transferir o homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitros.

Em seguida, centrifugue a 1.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros antes de voltar a centrifugar como antes. Depois de transferir o sobrenadante para um novo tubo, centrifugar a 14 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento contendo as mitocôndrias com um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial. Em seguida, centrifugue a solução durante 15 minutos a 14 000 vezes G e quatro graus Celsius para precipitar as mitocôndrias. O pellet de mitocôndrias resultante deve ser mantido em gelo e ressuspenso em 50 a 100 microlitros de meio de cloreto de potássio, de acordo com o volume do pellet antes de qualquer ensaio.

Finalmente, use cinco microlitros de solução mitocondrial para medir a concentração de proteína mitocondrial pelo ensaio BCA padrão, medindo OD562 usando um leitor de placas. Preparar o meio de cloreto de potássio e adicionar o corante fluorescente verde de ligação ao cálcio até uma concentração final de 0,5 micromolar antes da experiência. Para determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial, primeiro transfira um mililitro de mitocôndrias isoladas em meio de cloreto de potássio contendo 0,5 corante fluorescente verde de ligação de cálcio micromolar para cada poço de uma placa de seis poços.

Incube as mitocôndrias e o corante fluorescente verde de ligação ao cálcio na placa de seis poços à temperatura ambiente, protegido da luz ambiente por um minuto. Após a incubação, adicione alíquotas de quatro microlitros na solução de cloreto de cálcio a 20 milimolares a cada poço da placa de seis poços usando a configuração de distribuição automática para introduzir 200 nanomoles de cálcio por miligrama de proteína mitocondrial. Use o espectrômetro fluorescente para monitorar as mudanças de fluorescência a cada três segundos por dois minutos com um comprimento de onda de excitação de 506 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 531 nanômetros.

A placa é equipada com agitação a 600 rpm por três segundos entre as leituras, controlada por software. Adicionar uma alíquota adicional de quatro microlitros de solução de cloreto de cálcio a 20 milimolares a cada alvéolo e, em seguida, monitorizar as alterações de fluorescência de três em três segundos durante dois minutos. Para determinar o inchaço mitocondrial induzido por cálcio, transfira um mililitro de mitocôndrias isoladas em meio de cloreto de potássio para cada poço de uma placa de seis poços.

Em seguida, adicione 10 microlitros de solução aquosa de cloreto de cálcio 20 milimolares à proteína mitocondrial para desencadear o inchaço mitocondrial. Usando um leitor de microplacas controlado por software, registre a diminuição da absorbância a cada três segundos por 10 minutos a 540 nanômetros. Resultados representativos da capacidade de retenção de cálcio mitocondrial de bongkrekic, um inibidor do poro de transição de permeabilidade mitocondrial induzido por cálcio, ou MPTP, abrindo atractilosídeo, um ativador da abertura MPTP induzida por cálcio e um controle em branco, são mostrados aqui.

A capacidade ativada no tratamento bongkrekic é muito maior do que no grupo atractilosídeo, como esperado. Os resultados representativos do inchaço mitocondrial induzido por cálcio de bongkrekic, atractilosídeo e o controle sem tratamento são mostrados aqui. A diminuição da absorbância monitorada em 540 nanômetros indica os inchaços mitocondriais.

Os resultados sugerem que o BKA pode inibir a abertura do MPTP, enquanto o ATR pode facilitar a abertura do MPTP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as soluções no gelo.