Name: Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial e o inchaço induzido por cálcio em mitocôndrias isoladas de células SH-SY5Y. Este método simples permite investigar disfunção mitocondrial e metabolismo energético celular.

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Este estudo foi suportado por concessões do subsídio do cientista proeminente de Shandong (JQ201421) e bolsa da NSFC (81371226).

1. isolamento de mitocôndrias
Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 - 4 ° C e mantidos no gelo.
<ol><li>Semente cerca de 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO2 durante a noite. Nota: pelo menos 1-2 x 107 SH-SY5Y de células são necessárias para cada ensaio de isolamento.</li>
	<li>Retire o meio e lave as células com cerca de 1 mL de PBS frio de gelo em um prato de cultura de célula de 10cm 3 vezes.</li>
	<li>Adicionar novo 1 mL de PBS frio gelo em placa de cultura de células de 10 cm e raspar as células aderentes em um novo tubo de 1,5 mL. Centrifugar 800 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Durante a centrifugação, prepare-se 5 mL de tampão de isolamento mitocondrial (250 mM sacarose, 10 mM HEPES (ácido de 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina etanesulfónico), 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM EDTA) suplementado com 50 μL de estoque de inibidores de protease solução (concentração de x 100; 1 comprimido de EDTA livre dissolvido em 500 µ l do ddH2O).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial. Incube o tubo de 1,5 mL no gelo por 30 min.</li>
	<li>Lise as células suspensas com um homogeneizador de vidro (traços de 15-25) acima e para baixo manualmente no gelo. Nota: Certifique-se de que não há nenhuma bolha quando as células são homogeneizadas. Contar as células intactas e núcleos exposto pode por microscópio visualmente e confirmar que > 90% célula ruptura já ocorreu.</li>
	<li>Transferi o homogeneizado em um tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para remover os detritos (núcleos e células intactas remanescentes).</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar 14.000 x g por 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado que contém mitocôndrias com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial.</li>
	<li>Centrifugue a solução por 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar as mitocôndrias.</li>
	<li>A pelota de mitocôndrias resultante deve ser mantida no gelo e resuspended em 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20mm HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5mm e 2 a rotenona μM, pH 7,4 de acordo com o volume de sedimento antes de qualquer rabo) Ay.</li>
	<li>Use 5 μL de solução mitocondrial para medir a concentração de proteína mitocondrial por padrão ensaio BCA, OD562 de medição usando um leitor de placa13.</li>
</ol>2. determinação da mitocondrial Ca2 + capacidade de retenção
<ol><li>Preparar a mídia de KCl e adicionar o Ca2 +-ligação corante fluorescente verde a uma concentração final de 0,5 μM antes do experimento.</li>
	<li>Transferir 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl contendo 0,5 μM Ca2 +-ligação corante fluorescente verde em cada placa de 6 bem.</li>
	<li>Incubar as mitocôndrias e o Ca2 +-ligação corante fluorescente verde na placa 6-poços em temperatura ambiente protegida da luz ambiente para 1 min. Adicione 4 alíquotas μL de uma solução de CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 de 20 mM 20 mM HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5 mM, pH 7,4) para cada placa de 6 bem usando o automático dispensa configuração apresentar 200 nmol Ca2 +/ mg proteína mitocondrial.</li>
	<li>Usar um espectrômetro de fluorescência para monitorar as alterações de fluorescência cada 3 s por 2 min, com um comprimento de onda de excitação de 506 nm e um comprimento de onda de emissão de 531 nm. A placa é equipada com tremendo a 600 rpm por 3 s entre leituras controlada por software (Figura 1).</li>
	<li>Adicionar a alíquota adicional 4 μL da solução de CaCl2 de 20 mM a cada poço e monitorar as mudanças de fluorescência cada 3 s por 2 min. Repita este passo até que a fluorescência aumenta com o tempo. Nota: As mitocôndrias são desafiadas com o adicionado Ca2 + indicado por fluorescência o aumento de gravação. Quando o mPTP abre, a fluorescência aumenta com o tempo.</li>
	<li>Interprete a quantidade total de Ca2 + adicionado até o mPTP abre como a capacidade de Ca2 + de retenção.</li>
</ol>3. determinação de Ca 2 +-induzido por inchaço mitocondrial
<ol><li>Prepare a mídia de KCl antes do experimento.<ol>
<li>Transferi 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl para cada placa de 6 bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 10 μL de solução aquosa de CaCl2 (500 nmol/mg de proteína mitocondrial) de 20 mM em proteína mitocondrial para acionar o inchaço mitocondrial.</li>
	<li>Gravar a diminuição da absorbância em 540 nm cada 3 s em um leitor de microplacas controlado por software para 10 min (Figura 2). As alterações de fluorescência são causadas por um afluxo de solutos através da membrana mitocondrial interna. Nota: A diminuição da absorbância em 540 nm corresponde à mitocôndria inchadas. Se o leitor não observar uma diminuição na absorção, um longo intervalo de leitura ou tempo de leitura pode ser adotado.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
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<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
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<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. sol supervisionou os experimentos. Li Wei realizados os experimentos. Zhang Chen e X. sol escreveu o jornal.

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.
Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular intacta ao mi...

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca2 + pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP1. Quando a concentração de citosólico Ca2 + vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca2 + rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca2 + também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana2. Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca2 + pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP3. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-trigged inchaço mitocondrial.
CA2 + capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca2 + retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de4,de doenças neurodegenerativas até5. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca2 + de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca2 + por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial6. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca2 +-ligação corante fluorescente verde, uma Ca2 +-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado7. CA2 +-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca2 + concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)8. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca2 + eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca2 + adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca2 + foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca2 + 9. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.
Após o acúmulo de Ca2 + , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca2 + para o meio e começaram a inchar. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca2 +-desencadeada mitocondrial inchaço10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz12, onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.
Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.

<table><tbody><tr><td>Linha celular SH-SY5Y</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>Número ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Verde de cálcio-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Corante fluorescente verde de ligação Ca2+ inibidores</td></tr><tr><td>completos de protease</td> Replicador <td>de vidro 4693116001</td><td></td><td>Roche Molecular Biochemicals</td></tr><tr><td></td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>malato de glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan instrumentos de flash</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractilosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco com alto teor de glicose s meio Eagle modificado</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L de glicose, L-glutamina, sem piruvato de sódio</td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitocondrial ca2 + retenção capacidade do ensaio e ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca2 + buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca2 + concentração. Capacidade de retenção do CA2 + pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca2 + pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca2 + são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca2 +-relacionado funções mitocondriais.

Resultados de representante de Ca2 + capacidade de retenção: Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca2 + (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca2 +-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca2 +-induzida mPTP abertura, foram adicionados em ...

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial no inchaço mitocondrial induzido por cálcio. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da disfunção mitocondrial, como o metabolismo energético anormal. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito simples e eficaz.Para começar, semeie cerca de três milhões de células SH-SY5Y por placa de cultura celular de 10 centímetros. Remova o meio e lave as células com cerca de um mililitro de PBS frio a 4 °C em uma placa de cultura celular de 10 centímetros, três vezes. Adicione um mililitro de PBS frio a 4 °C na placa de cultura celular de 10 centímetros e raspe as células aderentes para um novo tubo de 1,5 mililitro.Centrifugue a 800 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Durante a centrifugação, prepare cinco mililitros de tampão de isolamento mitocondrial, suplementado com 50 microlitros de solução estoque de inibidor de protease. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet com um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial.Incube o tubo de 1,5 mililitro no gelo durante 30 minutos. Em seguida, lise as células suspensas com um homogeneizador de vid

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Este vídeo descreve um ensaio baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas. O ensaio analisa o sinal de fluorescência de um corante fluorescente sensível ao cálcio para estudar a cinética da captação de cálcio mitocondrial e da sobrecarga de cálcio.

Ensaio de captação de cálcio mitocondrial: um método baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio em mitocôndrias isoladas

Este vídeo descreve um ensaio baseado em imagens de microscopia confocal para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas. O ensaio usa o corante fluorescente sensível ao cálcio Rhod-2/AM para medir o cálcio mitocondrial em células cultivadas permeabilizadas.

Ensaio de influxo de cálcio para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas

Este vídeo demonstra o procedimento para avaliar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial monitorando as mudanças em tempo real na fluorescência à medida que as mitocôndrias captam cálcio. Este ensaio é útil para estudar a função mitocondrial e processos relacionados ao cálcio, incluindo apoptose e doenças neurodegenerativas.

Determinação da capacidade de retenção de cálcio de mitocôndrias isoladas

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca2 + afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca2 + importação ensaio usando o Ca2 + sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca2 + Rhod-2h.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.

Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aprenda a determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial e o inchaço induzido por cálcio em mitocôndrias isoladas de células SH-SY5Y. Este método simples permite investigar disfunção mitocondrial e metabolismo energético celular.

Mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

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