Name: Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial e o inchaço induzido por cálcio em mitocôndrias isoladas de células SH-SY5Y. Este método simples permite investigar disfunção mitocondrial e metabolismo energético celular.

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Este estudo foi suportado por concessões do subsídio do cientista proeminente de Shandong (JQ201421) e bolsa da NSFC (81371226).

1. isolamento de mitocôndrias
Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 - 4 ° C e mantidos no gelo.
<ol><li>Semente cerca de 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO2 durante a noite. Nota: pelo menos 1-2 x 107 SH-SY5Y de células são necessárias para cada ensaio de isolamento.</li>
	<li>Retire o meio e lave as células com cerca de 1 mL de PBS frio de gelo em um prato de cultura de célula de 10cm 3 vezes.</li>
	<li>Adicionar novo 1 mL de PBS frio gelo em placa de cultura de células de 10 cm e raspar as células aderentes em um novo tubo de 1,5 mL. Centrifugar 800 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Durante a centrifugação, prepare-se 5 mL de tampão de isolamento mitocondrial (250 mM sacarose, 10 mM HEPES (ácido de 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina etanesulfónico), 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM EDTA) suplementado com 50 μL de estoque de inibidores de protease solução (concentração de x 100; 1 comprimido de EDTA livre dissolvido em 500 µ l do ddH2O).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial. Incube o tubo de 1,5 mL no gelo por 30 min.</li>
	<li>Lise as células suspensas com um homogeneizador de vidro (traços de 15-25) acima e para baixo manualmente no gelo. Nota: Certifique-se de que não há nenhuma bolha quando as células são homogeneizadas. Contar as células intactas e núcleos exposto pode por microscópio visualmente e confirmar que > 90% célula ruptura já ocorreu.</li>
	<li>Transferi o homogeneizado em um tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para remover os detritos (núcleos e células intactas remanescentes).</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar 14.000 x g por 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado que contém mitocôndrias com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial.</li>
	<li>Centrifugue a solução por 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar as mitocôndrias.</li>
	<li>A pelota de mitocôndrias resultante deve ser mantida no gelo e resuspended em 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20mm HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5mm e 2 a rotenona μM, pH 7,4 de acordo com o volume de sedimento antes de qualquer rabo) Ay.</li>
	<li>Use 5 μL de solução mitocondrial para medir a concentração de proteína mitocondrial por padrão ensaio BCA, OD562 de medição usando um leitor de placa13.</li>
</ol>2. determinação da mitocondrial Ca2 + capacidade de retenção
<ol><li>Preparar a mídia de KCl e adicionar o Ca2 +-ligação corante fluorescente verde a uma concentração final de 0,5 μM antes do experimento.</li>
	<li>Transferir 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl contendo 0,5 μM Ca2 +-ligação corante fluorescente verde em cada placa de 6 bem.</li>
	<li>Incubar as mitocôndrias e o Ca2 +-ligação corante fluorescente verde na placa 6-poços em temperatura ambiente protegida da luz ambiente para 1 min. Adicione 4 alíquotas μL de uma solução de CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 de 20 mM 20 mM HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5 mM, pH 7,4) para cada placa de 6 bem usando o automático dispensa configuração apresentar 200 nmol Ca2 +/ mg proteína mitocondrial.</li>
	<li>Usar um espectrômetro de fluorescência para monitorar as alterações de fluorescência cada 3 s por 2 min, com um comprimento de onda de excitação de 506 nm e um comprimento de onda de emissão de 531 nm. A placa é equipada com tremendo a 600 rpm por 3 s entre leituras controlada por software (Figura 1).</li>
	<li>Adicionar a alíquota adicional 4 μL da solução de CaCl2 de 20 mM a cada poço e monitorar as mudanças de fluorescência cada 3 s por 2 min. Repita este passo até que a fluorescência aumenta com o tempo. Nota: As mitocôndrias são desafiadas com o adicionado Ca2 + indicado por fluorescência o aumento de gravação. Quando o mPTP abre, a fluorescência aumenta com o tempo.</li>
	<li>Interprete a quantidade total de Ca2 + adicionado até o mPTP abre como a capacidade de Ca2 + de retenção.</li>
</ol>3. determinação de Ca 2 +-induzido por inchaço mitocondrial
<ol><li>Prepare a mídia de KCl antes do experimento.<ol>
<li>Transferi 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl para cada placa de 6 bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 10 μL de solução aquosa de CaCl2 (500 nmol/mg de proteína mitocondrial) de 20 mM em proteína mitocondrial para acionar o inchaço mitocondrial.</li>
	<li>Gravar a diminuição da absorbância em 540 nm cada 3 s em um leitor de microplacas controlado por software para 10 min (Figura 2). As alterações de fluorescência são causadas por um afluxo de solutos através da membrana mitocondrial interna. Nota: A diminuição da absorbância em 540 nm corresponde à mitocôndria inchadas. Se o leitor não observar uma diminuição na absorção, um longo intervalo de leitura ou tempo de leitura pode ser adotado.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
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<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
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<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. sol supervisionou os experimentos. Li Wei realizados os experimentos. Zhang Chen e X. sol escreveu o jornal.

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.
Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular intacta ao mi...

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca2 + pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP1. Quando a concentração de citosólico Ca2 + vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca2 + rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca2 + também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana2. Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca2 + pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP3. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-trigged inchaço mitocondrial.
CA2 + capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca2 + retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de4,de doenças neurodegenerativas até5. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca2 + de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca2 + por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial6. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca2 +-ligação corante fluorescente verde, uma Ca2 +-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado7. CA2 +-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca2 + concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)8. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca2 + eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca2 + adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca2 + foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca2 + 9. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.
Após o acúmulo de Ca2 + , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca2 + para o meio e começaram a inchar. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca2 +-desencadeada mitocondrial inchaço10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz12, onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.
Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.

<table><tbody><tr><td>Linha celular SH-SY5Y</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>Número ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Verde de cálcio-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Corante fluorescente verde de ligação Ca2+ inibidores</td></tr><tr><td>completos de protease</td> Replicador <td>de vidro 4693116001</td><td></td><td>Roche Molecular Biochemicals</td></tr><tr><td></td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>malato de glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan instrumentos de flash</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractilosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco com alto teor de glicose s meio Eagle modificado</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L de glicose, L-glutamina, sem piruvato de sódio</td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitocondrial ca2 + retenção capacidade do ensaio e ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca2 + buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca2 + concentração. Capacidade de retenção do CA2 + pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca2 + pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca2 + são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca2 +-relacionado funções mitocondriais.

Resultados de representante de Ca2 + capacidade de retenção: Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca2 + (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca2 +-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca2 +-induzida mPTP abertura, foram adicionados em ...

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial no inchaço mitocondrial induzido por cálcio. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da disfunção mitocondrial, como o metabolismo energético anormal. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito simples e eficaz.Para começar, semeie cerca de três milhões de células SH-SY5Y por placa de cultura celular de 10 centímetros. Remova o meio e lave as células com cerca de um mililitro de PBS frio a 4 °C em uma placa de cultura celular de 10 centímetros, três vezes. Adicione um mililitro de PBS frio a 4 °C na placa de cultura celular de 10 centímetros e raspe as células aderentes para um novo tubo de 1,5 mililitro.Centrifugue a 800 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Durante a centrifugação, prepare cinco mililitros de tampão de isolamento mitocondrial, suplementado com 50 microlitros de solução estoque de inibidor de protease. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet com um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial.Incube o tubo de 1,5 mililitro no gelo durante 30 minutos. Em seguida, lise as células suspensas com um homogeneizador de vidro, movendo manualmente para cima e para baixo no gelo. Transfira o homogenato para um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, centrifugue a 1.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro antes de centrifugar novamente como anteriormente. Após a transferência do sobrenadante para um novo tubo, centrifugue a 14.000 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Remova o sobrenatante e re-suspenda o pellet contendo mitocôndrias com um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial. Em seguida, centrifugue a solução por 15 minutos a 14.000 × g e 4 °C para precipitar as mitocôndrias. O pellet de mitocôndrias resultante deve ser mantido em gelo e re-suspenso em 50 a 100 microlitros de meio de cloreto de potássio, de acordo com o volume do pellet, antes de qualquer ensaio.Por fim, utilize cinco microlitros da solução mitocondrial para medir a concentração de proteína mitocondrial por ensaio BCA padrão, medindo a OD562 usando um leitor de placas. Prepare o meio de cloreto de potássio e adicione o corante verde fluorescente ligante de cálcio até uma concentração final de 0,5 micromolar antes do experimento. Para determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial, transfira primeiro um mililitro de mitocôndrias isoladas em meio de cloreto de potássio contendo 0,5 micromolar do corante verde fluorescente ligante de cálcio para cada poço de uma placa de seis poços.Incube as mitocôndrias e o corante verde fluorescente ligante de cálcio na placa de seis poços à temperatura ambiente, protegidas da luz ambiente, por um minuto. Após a incubação, adicione alíquotas de quatro microlitros da solução de cloreto de cálcio 20 milimolar a cada poço da placa de seis poços utilizando a configuração de dispensação automática para introduzir 200 nanomoles de cálcio por miligrama de proteína mitocondrial. Utilize o espectrômetro de fluorescência para monitorar as alterações de fluorescência a cada três segundos durante dois minutos, com um comprimento de onda de excitação de 506 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 531 nanômetros.A placa é equipada com agitação a 600 rpm por três segundos entre as leituras, controlada por software. Adicione uma alíquota adicional de quatro microlitros de solução de cloreto de cálcio 20 milimolar a cada poço, depois monitore as alterações de fluorescência a cada três segundos durante dois minutos. Para determinar o inchaço mitocondrial induzido por cálcio, transfira um mililitro de mitocôndrias isoladas em meio de cloreto de potássio para cada poço de uma placa de seis poços.Em seguida, adicione 10 microlitros de solução aquosa de cloreto de cálcio 20 milimolar à proteína mitocondrial para induzir o inchaço mitocondrial. Utilizando um leitor de microplacas controlado por software, registre a diminuição da absorbância a cada três segundos durante 10 minutos em 540 nanômetros. Os resultados representativos da capacidade de retenção de cálcio mitocondrial da bongkrekina, um inibidor da abertura da poro de transição de permeabilidade mitocondrial induzida por cálcio, ou MPTP, do atractilosídeo, um ativador da abertura da MPTP induzida por cálcio, e de um controle em branco são mostrados aqui.A capacidade no tratamento com bongrekic é muito maior do que no grupo com atractilosídeo, como esperado. Aqui são apresentados resultados representativos do inchaço mitocondrial induzido por cálcio com bongrekic, atractilosídeo e o controle sem tratamento. A diminuição da absorbância monitorada a 540 nanômetros indica os inchamentos mitocondriais.Os resultados sugerem que o BKA pode inibir a abertura do MPTP, enquanto o ATR pode facilitar a abertura do MPTP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter todas as soluções em gelo.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

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Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Este vídeo descreve um ensaio baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas. O ensaio analisa o sinal de fluorescência de um corante fluorescente sensível ao cálcio para estudar a cinética da captação de cálcio mitocondrial e da sobrecarga de cálcio.

Ensaio de captação de cálcio mitocondrial: um método baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio em mitocôndrias isoladas

Este vídeo descreve um ensaio baseado em imagens de microscopia confocal para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas. O ensaio usa o corante fluorescente sensível ao cálcio Rhod-2/AM para medir o cálcio mitocondrial em células cultivadas permeabilizadas.

Ensaio de influxo de cálcio para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas

Este vídeo demonstra o procedimento para avaliar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial monitorando as mudanças em tempo real na fluorescência à medida que as mitocôndrias captam cálcio. Este ensaio é útil para estudar a função mitocondrial e processos relacionados ao cálcio, incluindo apoptose e doenças neurodegenerativas.

Determinação da capacidade de retenção de cálcio de mitocôndrias isoladas

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca2 + afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca2 + importação ensaio usando o Ca2 + sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca2 + Rhod-2h.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.

Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aprenda a determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial e o inchaço induzido por cálcio em mitocôndrias isoladas de células SH-SY5Y. Este método simples permite investigar disfunção mitocondrial e metabolismo energético celular.

Mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

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