Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

Este método pode responder a perguntas na interação patógeno do hospedeiro e na descoberta de medicamentos, como a importância de vários fatores de virulência e a capacidade de pequenas moléculas de melhorar com a gênese. A principal vantagem desta técnica é que ela ocorre em formato líquido com pequenos volumes. Para começar, enquanto trabalha dentro de um gabinete de biossegurança BSL 2, listre P.aeruginosa de um estoque congelado em uma placa de ágar LB.

Incube a placa a 37 graus C por 16 a 24 horas e, em seguida, armazene a placa a quatro graus Celsius por até uma semana. Dois dias antes de montar as placas de ensaio, use uma única colônia da placa para inocular de três a cinco mililitros de caldo LB estéril. Incube a cultura a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas.

Após preparar o meio slow kill ou SK de acordo com o protocolo de texto, com 350 mililitros de p. Aeruginosa da cultura fresca de LB durante a noite, semear cada placa SK de 10 centímetros. Use um espalhador bacteriano estéril para espalhar uniformemente as bactérias e deixe as placas secarem no gabinete de biossegurança.

Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. Para testar várias cepas bacterianas de RNAi em paralelo em um único poço de uma placa de 24 poços de profundidade, inocule uma única colônia de cada clone de RNAi previamente preparado contendo bactérias em quatro mililitros de carbenicilina suplementada LB. Coloque as placas em uma incubadora agitada otimizada para placas de vários poços a 37 graus Celsius e 950 rpm por 16 horas e, em seguida, colete as bactérias por centrifugação a 2.000 g por 5 minutos. Transvasar o sobrenadante invertendo a placa e agitando-a vigorosamente.

Usando 100 microlitros de S Basal, ressuspenda as bactérias de RNAi. Pipetar as bactérias ressuspensas para um número adequado de alvéolos de uma placa NGM de vários poços suplementada com IPTG e carbenicilina e deixar a placa secar. Depois de preparar os vermes L1 de acordo com o protocolo de texto, prepare as placas para experimentos básicos pipetando aproximadamente 5.000 vermes por placa de 10 centímetros, semeados com RNAi ou superalimento OP50.

Para configurar uma triagem de RNAi, pipete aproximadamente 300 vermes por poço em uma placa de 24 poços semeada com RNAi. Se a cepa usada for estéril em temperatura, incube os vermes a 15 graus Celsius por aproximadamente 16 horas e depois transfira-os para 25 graus Celsius por 44 horas para completar o desenvolvimento e evitar a embriogênese. Para realizar um ensaio de morte líquida, use um raspador de células para remover a P.aeruginosa de uma placa SK e ressuspender a bactéria em aproximadamente 5 mililitros de S.Basal.

Com um espectrofotómetro, medir a DO 600 da suspensão bacteriana. Prepare 24 mililitros de estoque diluído de P.Aeruginosa em S.Basal a um OD 600 igual a 09, em seguida, adicione 21 mililitros de meio SK líquido e, usando uma pipeta multicanal, transfira 45 microlitros de bactérias e meios para cada poço de uma placa de 384 poços. Lave os vermes de sua fonte em um tubo cônico de 50 mililitros e deixe-os assentar sob a força gravitacional.

Aspire o sobrenadante a 5 mililitros, depois use um total de 50 mililitros de S.Basal para ressuspender os vermes e repita a lavagem mais duas vezes. Usando um classificador de minhocas, classifique aproximadamente 22 minhocas em cada poço de uma placa de 384 poços, de acordo com o protocolo de texto, depois use um filme permeável a gás para selar a placa e incubá-la a 25 graus Celsius por 24 a 48 horas. No momento desejado, use uma lavadora de microplacas e S.Basal para lavar a placa de 384 poços um total de 5 vezes.

Um dos erros mais fáceis de cometer é aspirar a placa de 384 poços antes que os vermes se assentem completamente. É preciso prática para ver com precisão se os vermes se estabeleceram completamente. Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante até 20 microlitros.

Em seguida, adicione 50 microlitros de coloração de ácido nucleico 98 micromolar por poço, para uma concentração final de 0,7 micromolar. Incube a placa em temperatura ambiente por 12 a 16 horas. Após o período de incubação desejado, use a lavadora de microplacas para lavar as placas no mínimo três vezes.

Para uma aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para obter imagens da luz transmitida e da fluorescência. Adicione um mililitro de S Basal por poço de uma placa de 24 poços contendo 300 vermes por poço. Agite suavemente os vermes agitando a placa e, em seguida, transfira-os para uma placa vazia e estéril de 24 poços profundos.

Deixe os vermes se assentarem gravitacionalmente, cerca de cinco minutos. Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro por poço, Em seguida, adicione 7 mililitros de S Basal a cada poço. Repita a lavagem mais duas vezes e, após a lavagem final, aspire todos, exceto aproximadamente 400 microlitros de sobrenadante.

Depois de pipetar as bactérias em placas de 384 poços para evitar a fome, usando a função de reamostrador do classificador de minhocas, classifique 22 minhocas em cada poço de uma placa de 384 poços. Finalmente, após a classificação, adicione pequenas moléculas ou outros materiais específicos do experimento. Conforme ilustrado neste gráfico, quando as etapas descritas neste vídeo são seguidas, uma morte dependente do tempo de C.elegans será observada apenas na presença de P. aeruginosa.

Em contraste, na ausência de suplementos nutricionais bacterianos essenciais, pouca ou nenhuma morte será observada. Como mostrado aqui, a incubação em duas etapas de P. aeruginosa a 37 graus Celsius e depois a 25 graus Celsius, que é crítica para ensaios convencionais de morte lenta e foi originalmente implementada em matança líquida, é dispensável neste ensaio. O protocolo tolera uma ampla gama de concentrações bacterianas iniciais, desde um OD 600 igual a 0025, e ainda exibe morte dependente do tempo e da concentração, embora o tempo mude.

Além disso, apenas quatro poços são frequentemente suficientes para obter dados estatisticamente significativos. Um exemplo da utilidade do processamento é mostrado aqui quando a relação sinal-ruído é alta, como neste exemplo, a análise é simples e discriminar entre condições positivas e negativas é trivial. Nesses casos, mesmo acertos fracos podem ser prontamente identificados.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de 60 a 75 minutos de tempo prático por placa de 384 poços, sem incluir a classificação. Ao tentar este procedimento, é fundamental lembrar de adicionar todos os componentes à sua mídia ou a virulência será comprometida. Este ensaio simplifica a aplicação da triagem baseada no fenótipo de todo o organismo para a descoberta de medicamentos na pesquisa de patógenos hospedeiros.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar ensaios de patogênese de C elegans em base líquida. Este procedimento pode ser modificado substituindo por outros patógenos, como E.Faecalis por P.Aeruginosa, facilitando a busca por tratamentos para outras infecções bacterianas. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias infecciosas como P.Aeruginosa ou E.Faecalis pode ser perigoso.

Precauções apropriadas, como treinamento adequado, bom equipamento de proteção individual e técnica adequada, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.