Name: Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de patogênese líquida em Caenorhabditis elegans para estudar interações hospedeiro-patógeno e descoberta de medicamentos usando P. aeruginosa. Este método de alta produtividade permite avaliar fatores de virulência e moléculas pequenas de forma eficiente.

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Este estudo foi suportado pela prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (CPRIT) prêmio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e pelo nacional institutos de saúde K22 AI110552 atribuído a NVK. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Cuidado: P. aeruginosa e E. faecalis são patógenos de biossegurança nível 2, e devidas precauções de segurança devem ser tomadas para prevenir a infecção acidental e para minimizar a contaminação das superfícies. Todas as mídias e materiais que entram em contato com patógenos devem ser esterilizados e/ou descartadas. Orientações adicionais estão disponíveis a partir da publicação do CDC biossegurança em microbiológicas e laboratórios biomédicos (BMBL), 5ª edição.
1. preparação e manutenção de p. aeruginosa
<ol><li>Raia de p. aeruginosa de um estoque congelado em uma placa de ágar LB (lisogenia caldo). Incubar a 16 a 24 h a 37 ° C Nota: Realize experimentos de p. aeruginosa dentro um BSL-2 de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Use precauções de segurança adequadas para minimizar a chance de infecção patogénica ou contaminação.</li>
	<li>Transferir essa placa para 4 ° C. Esta placa pode ser mantida a 4 ° C e utilizada para inocular culturas por até uma semana. Depois de uma semana, descontaminar e descartar a placa e fazer um novo prato de raia LB. Nota: A virulência de p. aeruginosa diminui após um armazenamento prolongado.</li>
	<li>Dois dias antes da criação de placas de ensaio, inocule 3-5 mL de caldo LB esterilizado com uma única colônia de p. aeruginosa da placa feita em 1.1. Incube a 37 ° C por 12 a 16 h. Nota: Não incube mais de 16 h. Em culturas de líquido ricas, p. aeruginosa PA14 começa a lyse.</li>
	<li>Preparar placas estéreis de 10 cm com mídia matar lenta (3G de NaCl, peptona de 3,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) e 868 mL de KH2PO4 (1 M)) e ágar de 18 g/L). Nota: Prepare pratos antes do tempo. Eles podem ser armazenados por até 3 semanas em um recipiente hermético a 4 ° C.</li>
	<li>As sementes cada 10cm matar lenta placa (SK) com 350 μL de p. aeruginosa de cultura LB fresca durante a noite. Usando um difusor bacteriana estéril, equitativamente distribuídos por bactérias superfície da mídia e deixe-a secar em uma BSL-2 de segurança biológica.</li>
	<li>Incube as placas a 37 ° C por 24 h.</li>
</ol>2. preparação de bactérias de RNAi
<ol><li>Raia para fora ou desejada de pino-transferência cepas de bactérias contendo RNAi em placas de ágar LB contendo antibióticos apropriados (carbenicilina a 100 µ g/mL) e tetraciclina em 15 µ g/mL para Ahringer e Vidal bibliotecas de um estoque congelado. Nota: Quando se trabalha com bactérias não-patogênicas, use qualquer um A BSL-2 / B câmara de segurança biológica ou um fluxo laminar de BSL-1 capa para garantir a esterilidade das culturas e para minimizar a possibilidade de contaminação da biblioteca.</li>
	<li>Incubar as placas por 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Armazene as placas a 4 ° C por até duas semanas.<ol>
<li>Depois de duas semanas, descartar as placas e substituí-los com pratos feitos recentemente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste várias cepas de RNAi em paralelo, individualmente, inocular uma única colônia de cada clone em 4 mL de LB carbenicilina-completados em um único bem de uma placa de 24-bem profundo ou em um tubo de ensaio estéril. Nota: A tetraciclina tem sido relatada para reduzir a eficiência de RNAi. Não usá-lo nessa mídia.</li>
	<li>Coloque placas poço 24-poço profundo em uma incubadora tremendo otimizada para placas do multiwell e incubar a 37 ° C, durante 16 h agitando a 950 rpm. Nota: É difícil obter uniforme crescimento bacteriano em placas do multiwell usando uma incubadora tremendo convencional. A incubadora tremendo precisa ser capaz de abalar no mínimo de 750 rpm para que as culturas a crescer corretamente. Na ausência de um abanador especializado, é possível crescer cada cultura num tubo individual. Culturas podem ser transferidas para a placa de 24 para centrifugação depois, se desejado.</li>
	<li>Colete as bactérias por centrifugação por 5 minutos a 2.000 x g.</li>
	<li>Decante o sobrenadante por inverter a placa e agitação vigorosa. Resuspenda as bactérias de RNAi em 100 µ l de S Basal (5,85 g de NaCl, 1 g K2HPO4, 6g KH2PO4 dissolvido em 1 L de água ultrapura e esterilizados em autoclave).</li>
	<li>Pipetar ressuspensão de bactérias para um número adequado de poços de uma placa NGM do multiwell (nematódeo crescimento Media, 3 g de NaCl, peptona 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) e 868 mL de KH2PO4 (1 M)) e ágar de 18 g por litro de água) suplementado com IPTG (concentração final de 1 mM) e carbenicilina (concentração final de 100 μg/mL).<ol>
<li>Use 3,5 mL de mídia NGM por alvéolo de placa de 6, 1 mL por bem de uma placa de 24 ou 150 µ l por poço da placa de 96 poços.</li>
		<li>Use 100 μL/poço de bactérias para a placa de 6; 50 μL/poço para 24-bem; ou 20 μL/poço para placa de 96 poços. Deixe-a secar. Nota: Secagem normalmente é executada em uma capa de fluxo estéril para promover a secagem rápida e uniforme. Secagem uniforme é muito importante. Evite o ressecamento, como rachaduras em agar promovem a construção de galerias de vermes. Isto leva a worm perdas e potencial de entupimento dos sistemas de tratamento de líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use as placas preparadas imediatamente ou armazená-los em 4 ° C por até duas semanas para uso posterior. Nota: Para impedir a secagem de placas, podem ser selados com filme plástico parafina ou colocados em um recipiente hermeticamente fechado com toalhas de papel húmido.</li>
</ol>3. manutenção e preparação de c. elegans
Nota: Antes de iniciar os experimentos, gere uma população sincronizada de vermes hermafroditas gravid, adultos como segue.
<ol><li>Lave adultos gravid (i.e., com múltiplos embriões visíveis dentro a gônada) de 4-6 chapas de NGM de 10 cm em um tubo cônico de 15 mL, adicionando-se 4 mL de S Basal a placa, agitando suavemente e em seguida despejando um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Granule vermes através de centrifugação a 1.000 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota de verme.</li>
	<li>Adicionar 3,5 mL de solução de lixívia worm (concentração final de 0.5M de NaOH, 1% de hipoclorito de sódio, em água estéril) para a pelota de worm e misture por inversão durante 1 minuto.</li>
	<li>Brevemente o vórtice e centrifugar a 1.000 x g por 30 segundos.</li>
	<li>Aspirar ou decante o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota de verme.</li>
	<li>Adicione 3,5 mL de solução de lixívia fresca worm para a pelota de verme.</li>
	<li>Misture vigorosamente vermes em solução de água sanitária. Periodicamente (aproximadamente a cada dez segundos) Inspecione visualmente vermes sob um microscópio de dissecação. Cuidado com as cutículas worm quebrar, liberando ovos. Uma vez que a maioria dos vermes adultos foram dissolvidos (~ 95%), dilua água sanitária para 15 mL com S Basal para parar a digestão. Nota: As cascas de ovos são mais resistentes a lixívia que tecidos adultos, mas eles podem ser dissolvidos durante uma exposição prolongada. Para evitar a dissolução do ovo, não exponha os ovos para verme solução de água sanitária por mais de 7 minutos. Se as cascas de ovos são excessivamente danificadas, os embriões morrem.</li>
	<li>Pelota de embriões a 1.000 x g durante 30 segundos e aspirar ou decante o sobrenadante sem remover o sedimento de embriões.</li>
	<li>Resuspenda vermes em S basal até um volume final de 15 mL, diluir a solução de lixívia restantes.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem (3.9-3.10) três vezes mais para um total de 4 lavagens consecutivas.</li>
	<li>Após a quarta lavagem, aspirar o sobrenadante e adicionar até 5 ou 6 mL de estéril S Basal no tubo cônico de 15 mL. O objetivo é Resuspenda embriões para uma concentração de ~ 50 vermes por µ l. Nota: A quantidade de S Basal depende do tamanho da pelota ovo; Quanto maior a pelota, o mais Basal S é necessário.</li>
	<li>Incubar o tubo cônico durante a noite em um rotador mesa à temperatura ambiente ou 48 h a 15 ° C. As larvas eclodem, mas desenvolvimento larval vai prender na fase L1 (L1 diapausa) devido a privação de nutrientes.</li>
	<li>Examine os embriões sob um microscópio dissecação para verificar que a maioria deles têm eclodido e preso na fase do desenvolvimento de L1.</li>
	<li>Determine a contagem de verme tomando 20 µ l de prep worm e diluir com 80 µ l de S Basal. Pipete 10 µ l de solução diluída de worm diretamente na placa NGM vazia. Repita 2 vezes mais.<ol>
<li>Contar as larvas em cada local e determinar o número médio. Divida essa média por 2 para obter uma contagem aproximada de vermes por µ l em preparação o worm. Preparações do worm podem ser usadas para placas de propagação ou para experiências. Nota: Depois de 4-5 dias, larvas fome começará a morrer; Descarte o prep neste ponto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a propagação da estirpe, pipeta, um número adequado de vermes de L1 (5.000-6.000) nas chapas NGM 10cm 3-4 manchado com concentrado OP50 Escherichia coli – "superalimento" (e. coli OP50 manchado na concentração de X 25 (ou seja, 1 L de OP50 durante a noite cultura cultivada em LB produz 40 mL de 25 X OP50 superalimento); 2 mL da suspensão bacteriana concentrada são manchadas em cada placa NGM de 10 cm).</li>
	<li>Para preparar pratos para experimentos, faça o seguinte (para configuração de uso 3.17.1 "Protocolo básico", para as etapas de uso de "Tela de RNAi configurar" 3.17.2 - 3.17.4 conforme apropriado):<ol>
<li>Pipeta ~ 5.000 prato de vermes/10 cm semeado com RNAi ou OP50 superalimento.</li>
		<li>Pipeta ~ 500 vermes/poço em uma placa de 6 semeado com RNAi.</li>
		<li>Pipeta ~ 300 vermes/poço em uma placa de 24 semeado com RNAi.</li>
		<li>Pipetar 100 ~ vermes/poço em uma placa de 96 poços semeado com RNAi. Nota: Para obter instruções sobre como RNAi foi semeada por favor consulte os passos 2,7-2,9 na preparação de RNAi bactérias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se uma cepa fértil de vermes está sendo usada, incube vermes a 25 ° C ~ 44-48 h uso esses vermes tão rapidamente quanto possível após a população ter atingido a idade apropriada. Isso minimiza o impacto dos ovos para incubação dentro os vermes durante o ensaio.</li>
	<li>Se a tensão a ser utilizado é esterilizado a temperatura (por exemplo, fer-15(b26); FEM-1(hc17) ou glp-4(bn2)), incubar vermes a 15 ° C para ~ 16 h e depois transferir a 25 ° C, para 44 h completar o desenvolvimento e prevenir a embriogênese.</li>
</ol>4. líquido matando ensaio Setup (protocolo básico)
Nota: Este é um protocolo para uma estirpe bacteriana e uma fonte de vermes.
<ol><li>Com uma espátula de célula, remover a p. aeruginosa de uma placa de SK e Resuspenda em ~ 5ml de S Basal. Intensificar-se, se necessário. Medir a densidade óptica da suspensão bacteriana usando um espectrofotômetro (OD600)</li>
	<li>Prepare 24 mL de caldo diluído de p. aeruginosa em S Basal no OD600 ≈ 0,09% (concentração final X 3). Ver 4.6.2 para conteúdo final por alvéolo e dimensionar o volume de diluição bacteriana em conformidade.</li>
	<li>Adicione 21 mL de meio líquido matar lenta (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L suplementado com CaCl2 e MgSO4 para uma concentração final de 1 mM). Usando uma pipeta multicanal, transferi 45 µ l de bactérias e de mídia para cada poço de uma placa de 384.</li>
	<li>Lave vermes de sua origem (ou seja, passo 3.17.1) em um tubo cónico de 50 mL e deixe vermes repousar sob a força gravitacional. Aspire o sobrenadante para 5 mL. Resuspenda em um total de 50 mL S basal.</li>
	<li>Repita a etapa 4.4 duas vezes.</li>
	<li>Usando um classificador de worm, classificar aproximadamente 22 vermes em cada poço da placa de 384 poços. Nota: A configuração gotas cada worm no ~1.1 µ l de líquido. 22 vermes ascenderá a 25 µ l, trazendo o volume total do ensaio a 70 µ l/poço.<ol>
<li>A composição final de cada poço é composto de 70 µ l µ l. 45 deste volume é adicionado como meio bacteriano (0,03 bactérias de600 OD em 24 µ l S Basal e 21 µ l SK suplementado com CaCl2 e MgSO4). Os outros 25 µ l é adicionado com os 22 vermes.</li>
		<li>Se o classificador usado aqui (veja a Tabela de materiais) está indisponível, vermes podem ser diluídos a uma concentração final de 1 worm / µ l em S Basal e pipetado 25 µ l/poço com uma pipeta multicanal. No entanto, os resultados podem apresentar maior variabilidade. Alternativamente, é possível usar um distribuidor de líquido peristáltico, conforme descrito por Leung e colegas19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de vermes foram classificadas na placa de 384, selar a placa com uma película permeável ao gás e incubar as placas a 25 ° C por 24-48 h.</li>
	<li>No momento desejado, use uma lavadora de microplacas para lavar a placa com S Basal de 384 um total de 5 vezes.<ol>
<li>Após a segunda lavagem, aspirar a maioria dos meios de comunicação, deixando ~ 20 µ l. vigorosamente sacode placas usando uma microplaca reaccional durante pelo menos 30 segundos para soltar todos os restos do fundo dos poços).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a lavagem final, aspirado sobrenadante até 20 µ l. Adicionar 50 µ l de 0,98 µM de ácidos nucleicos mancha (ver Tabela de materiais) / bem do prato 384-bem, para uma concentração final de 0,7 µM.</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente por 12-16 h. Esta tintura só vai manchar vermes mortos. Após o período de incubação desejado, lavar pratos usando a lavadora de microplacas para remover qualquer excesso mancham (um mínimo de 3 lavagens).</li>
	<li>Para aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para imagem tanto luz transmitida e fluorescência (531 nm de excitação e emissão 593).<ol>
<li>Use um objectivo de baixa ampliação para permitir que uma imagem de todo bem a ser capturada.</li>
		<li>Como alternativa, use o fluxo vermimetry. Esta técnica usa um citômetro de fluxo de objeto grande, como um verme fluorímetro, medir o tamanho e a fluorescência de todo organismo (i.e., c. elegans) de uma forma que é fortemente semelhante a citometria de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um software de análise automatizada de imagem (como CellProfiler, um estúdio de análise de imagem gratuito baseado no MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>) para calcular as áreas de worm fluorescente e total por alvéolo de forma imparcial. Nota: O quociente entre esses números representa a morte de fração para cada poço. Se um bem tinha 7 manchado vermes fora de 20 total, então a morte de fração compreende 0,35 ou 35%.<ol>
<li>Antes da primeira utilização, o pipeline de processamento de imagens automatizado deve ser validado, marcando manual. Isto é feito comparando resultados do pipeline automatizado para escores obtidos visualmente inspecionando imagens e gravação de fracções de vermes mortos para cada um deles. O processo de validação garante que os parâmetros para o processamento de imagens automatizado são precisos e representam os dados corretamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. adaptação para estirpes múltiplas triagem c. elegans ou Knockdowns (RNAi tela Setup)
Nota: Esta é uma tela de RNAi descrita para uma configuração de placa 24.
<ol><li>Adicionar 1 mL de S Basal por bem de uma placa de 24 (consulte a etapa 3.17.3). Suavemente agitar vermes agitando a placa e, em seguida, transferir vermes para um vazio, estéril 24 profundo-placa. Permitir que vermes resolver gravitacionalmente (~ 5 minutos).</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, deixando cerca de 1 mL. Adicione 7 mL de S Basal a cada poço.</li>
	<li>Repita as etapas 5.1-5.2 um mínimo de 2 vezes mais. Após a lavagem final, Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente 400 µ l.</li>
	<li>Usando a função Resampler do classificador de worm, classificar 22 vermes da suspensão do worm 24-placa em cada poço de uma placa de 384 (cada poço de uma placa 24 rendimentos 8-12 poços de uma placa de 384).<ol>
<li>Para evitar a fome, pipetar bactérias para placas boas 384 (uma tensão que serve apenas como alimento, tais como OP50, ou uma cepa patogênica) antes da classificação. Nota: Patógenos podem ser adicionados pelos seguintes etapas 2.3-2.5 ou 6.4-6.5 e fonte de alimento bactérias podem ser diluídas e adicionadas, seguindo o mesmo esquema de p. aeruginosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de vermes foram classificadas na placa de 384, adicione pequenas moléculas ou outros materiais específicos do experimento.</li>
</ol>6. adaptação de E. faecalis
Nota: Apenas as diferenças do ensaio de p. aeruginosa são descritas.
<ol><li>Prepare uma fonte fresca de E. faecalis , listando as bactérias de um estoque congelado em uma placa de ágar BHI (infusão de cérebro coração) e incubar durante 16 a 24 h a 37 ° C. Nota: Realize experimentos de E. faecalis dentro um BSL-2 de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Use precauções de segurança adequadas para minimizar a chance de infecção patogénica ou contaminação.</li>
	<li>As placas podem ser armazenadas a 4 ° C por até uma semana. Após este período, substitua com um prato fresco.</li>
	<li>Na noite anterior classificação vermes, inocular 3-5 mL estéril BHI com uma única colônia de E. faecalis. Incube 12-16 h a 37 ° C, com agitação.</li>
	<li>Adicione bactérias nos poços quanto a p. aeruginosa (3 x bactérias S Basal, OD600≈0.09). Nota: Para o E. faecalis, a composição final do bem é: E. faecalis (OD ≈0.03 de600), BHI = 10% v/v, com o volume restante composto S basal. Lembre-se que 25 µ l de S basal será entregue com vermes. Nota: E. faecalis produz espessas biofilmes que absorvem o corante fluorescente, causando imagens borradas. Lavagem extensa pode ser insuficiente para remover o biofilme. Neste caso, os vermes podem ser transferidos para um prato vazio usando uma pipeta multicanal. Para facilitar a transferência, Tween 20 podem ser adicionados a S Basal para uma concentração final de 0,1% (v/v) Tween 20 em S Basal. Isso ajuda a retirar os vermes do biofilme.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse a divulgar.

Este ensaio (ou ensaios semelhantes onde outros agentes patogénicos são substituídos por p. aeruginosa ou E. faecalis) são útil para uma variedade de finalidades, incluindo a descoberta de medicamentos. Também é útil para abordar questões biológicas fundamentais, tais como a identificação de fatores de virulência, a elucidação das vias de defesa do hospedeiro e determinando as máquinas reguladoras envolvidas na interação patógeno-hospedeiro.
Embora o ensaio de matança líquida...

A identificação e o desenvolvimento de antibióticos de amplo espectro, eficazes, agora quase um século atrás, levaram a um momento decisivo na saúde pública onde havia uma crença generalizada que infecciosa doença seria um flagelo do passado. Dentro de poucas décadas, esse otimismo começou a diminuir, como patógeno após patógeno desenvolver mecanismos de resistência que limitado a esses tratamentos uma vez milagrosos. Há algum tempo, a corrida armamentista entre os esforços de descoberta de drogas e os patógenos parecia equilibrada. No entanto, o abuso de antimicrobianos recentemente culminou no surgimento de cepas de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pandrogas resistentes 2,3,4.
P. aeruginosa é um oportunista, gram negativos, vários hosts patógeno que é uma ameaça grave para os pacientes com queimaduras graves, aqueles que estão imunocomprometidos, ou tem fibrose cística. É também cada vez mais identificado como um agente causador de infecções nosocomiais graves, particularmente devido a sua aquisição em curso de resistência aos antimicrobianos. Para começar, para enfrentar esta ameaça, nós usamos o bem-documentado c. elegans-p. aeruginosa infecção sistema5. Nosso laboratório tem aproveitado este sistema para desenvolver uma plataforma baseada em líquido, alta produtividade, alto teor de rastreio para identificar novos compostos que limitam a capacidade do patógeno para matar o anfitrião6. Curiosamente, estes compostos parecem pertencer pelo menos três categorias gerais, incluindo antimicrobianos7 e virulência inibidores8. Outros ensaios de descoberta de drogas de alto teor em c. elegans foram relatados para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, entre outros9,10,11,12,13,14,15,16. Esses tipos de ensaios têm várias vantagens bem reconhecidas, como falsos positivos sucessos que podem ser tóxicos para o host e o patógeno, aumento da probabilidade de biodisponibilidade em comparação com uma tela de química e a capacidade de identificar sucessos além de limitar simplesmente limitar o crescimento microbiano, como anti-virulents, imunes estimulatórios moléculas ou compostos que caso contrário inclinar o equilíbrio da interação patógeno-hospedeiro em favor do antigo. Além disso, os compostos descobertos nessas telas são frequentemente eficazes em hospedeiros mamíferos.
É interessante notar que pelo menos dois outros ensaios17,18 estão disponíveis para realizar em telas de alta produtividade em c. elegans em líquido. No entanto, cada um destes ensaios é uma modificação que permite o ensaio de colonização intestinal protótipo, conhecido como lento-matança, a realizar-se em líquido, aumentando o throughput e permitindo compostos mais prontamente ser projectado. Caracterização cuidadosa demonstrou conclusivamente que os mecanismos de virulência bacteriana são diferentes entre estes ensaios e nossa tela baseada em líquido7. Desde que ambos os tipos de virulência são observados nos sistemas dos mamíferos, é importante considerar quais determinantes de virulência são mais relevante para os interesses do experimentador antes da seleção do ensaio.
Aqui demonstramos uma versão otimizada do líquido-baseado ensaio c. elegans-P. aeruginosa . Também relatamos a adaptação do nosso método de ensaio de líquido-baseado para acomodar o patógeno bacteriano Gram-positiva Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis é identificado cada vez mais como uma ameaça séria nosocomial com um armamento crescente de resistência antimicrobiana vias1. Embora um método anterior de seleção da elevado-produção de E. faecalis existe14, exige preinfection com o patógeno, o que complica o processo e aumenta a probabilidade de contaminação de equipamentos como o FlowSort COPAS. Nosso protocolo elimina a necessidade de pre-infecção, melhorando o perfil de segurança. Finalmente, nós relatamos um meio pelo qual um destes ensaios podem ser combinado com alimentação RNAi, permitindo que o usuário Pesquisar por fatores do hospedeiro que desempenham um papel no estabelecimento de, ou resistência à infecção.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Citômetro de fluxo de objeto grande/classificador de vermes</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>Dispensador</td> de lavadora BioTek <td></td><td></td></tr><tr><td>EL406</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Bloco RB de poço profundo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>Greiner de placa de 384 poços</td><td> Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Meios de Crescimento de Nematóides (NGM)</td><td></td><td></td><td>Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 2,5 gramas de Peptona, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de placas</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de Slow Killing (SK) de água mili-QQuantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de Peptona, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampão de fosfato, e 973 mL de água mili-Q</td></tr><tr>Meio de <td></td><td></td><td>matança lenta (SK)</td><td>Quantidade por litro:&nbsp; 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q</td></tr><tr><td>Caldo de lisogenia (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Caldo de infusão (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr>Solução <td></td><td></td> de alvejante<td>para minhocas</td><td>Quantidade por 100 mL: 10 mL de solução de NaOH 5 M, 20 mL de solução de hipoclorito de sódio a 5% e 70 mL de água estéril</td></tr><tr><td>S Quantidade basal</td><td></td><td></td><td>por litro: 5,85 gramas de NaCl, 6 gramas de KH2PO4, 1 grama K2HPO4, e 1 litro de ágar água milli-Q</td></tr><tr><td></td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Quantidade de tampão</td><td></td><td></td> fosfato <td>por litro: 132 mL de K2HPO4 (1M) e 868 mL de KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hipoclorito de sódio a 5%</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>Solução de NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Laranja Mancha de Ácido Nucleico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Cepas Bacterianas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superalimento (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi Bactérias que expressam (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Cepas <</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>glp-4(bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::Repórter GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

O número de novas drogas identificado pelo tradicional, telas em vitro tem diminuído, reduzindo o sucesso desta abordagem na busca de novas armas combater a resistência a múltiplas drogas. Isto levou à conclusão de que pesquisadores não só a necessidade de encontrar novas drogas, mas também precisam desenvolver novas formas de encontrá-los. Entre o candidato mais promissor métodos são todo-organismo, in vivo , os ensaios que uso elevado-throughput, fenotípicas leituras e hospeda que variam entre Caenorhabditis elegans Danio rerio. Esses hosts têm várias vantagens poderosas, incluindo grandes reduções no falsos positivos hits, como compostos que são tóxicos para o anfitrião e/ou biounavailable são tipicamente caiu na tela inicial, antes de seguir caro acima.
Aqui nós mostramos como nosso ensaio tem sido usado para interrogar a variação do anfitrião na bem documentada c. elegans— patossistema líquido da matança dePseudomonas aeruginosa . Também demonstramos várias extensões desta técnica bem trabalhado para fora. Por exemplo, somos capazes de realizar elevado-throughput genéticas telas usando RNAi em 24 - ou 96 poços placa formatos de fatores do hospedeiro consulta nessa interação patógeno-hospedeiro. Usando este ensaio, telas de genoma inteiro podem ser concluídas em poucos meses, que drasticamente podem simplificar a tarefa de identificar alvos de drogas, potencialmente sem a necessidade de abordagens de purificação bioquímica laborioso.
Também relatamos aqui uma variação do nosso método que substitui a Gram-positive bactéria Enterococcus faecalis para o patógeno gram-negativa p. aeruginosa. Muito, como é o caso de p. aeruginosa, matar por E. faecalis é dependente do tempo. Ao contrário do anterior c. elegans— ensaios deE. faecalis , nosso ensaio de E. faecalis não precisam preinfection, melhorar seu perfil de segurança e reduzindo as chances de contaminar o equipamento de tratamento de líquido. O ensaio é altamente robusto, apresentando infecção de post ~ 95% taxas de morte 96 h.

Parâmetros importantes para o desempenho
Uma compreensão adequada da biologia subjacente a este ensaio é necessária para a solução de problemas e otimizando o ensaio. Para o efeito, nos referimos primeiro vários papéis chaves elucidar os mecanismos de patogênese de p. aeruginosa-mediada matando em líquido7,20. Desde que as etapas descritas acima são seg...

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Este método pode responder a perguntas na interação patógeno do hospedeiro e na descoberta de medicamentos, como a importância de vários fatores de virulência e a capacidade de pequenas moléculas de melhorar com a gênese. A principal vantagem desta técnica é que ela ocorre em formato líquido com pequenos volumes. Para começar, enquanto trabalha dentro de um gabinete de biossegurança BSL 2, listre P.aeruginosa de um estoque congelado em uma placa de ágar LB.Incube a placa a 37 graus C por 16 a 24 horas e, em seguida, armazene a placa a quatro graus Celsius por até uma semana. Dois dias antes de montar as placas de ensaio, use uma única colônia da placa para inocular de três a cinco mililitros de caldo LB estéril. Incube a cultura a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas.Após preparar o meio slow kill ou SK de acordo com o protocolo de texto, com 350 mililitros de p. Aeruginosa da cultura fresca de LB durante a noite, semear cada placa SK de 10 centímetros. Use um espalhador bacteriano estéril para espalhar uniformemente as bactérias e deixe as placas secarem no gabinete de biossegurança.Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. Para testar várias cepas bacterianas de RNAi em paralelo em um único poço de uma placa de 24 poços de profundidade, inocule uma única colônia de cada clone de RNAi previamente preparado contendo bactérias em quatro mililitros de carbenicilina suplementada LB. Coloque as placas em uma incubadora agitada otimizada para placas de vários poços a 37 graus Celsius e 950 rpm por 16 horas e, em seguida, colete as bactérias por centrifugação a 2.000 g por 5 minutos. Transvasar o sobrenadante invertendo a placa e agitando-a vigorosamente.Usando 100 microlitros de S Basal, ressuspenda as bactérias de RNAi. Pipetar as bactérias ressuspensas para um número adequado de alvéolos de uma placa NGM de vários poços suplementada com IPTG e carbenicilina e deixar a placa secar. Depois de preparar os vermes L1 de acordo com o protocolo de texto, prepare as placas para experimentos básicos pipetando aproximadamente 5.000 vermes por placa de 10 centímetros, semeados com RNAi ou superalimento OP50.Para configurar uma triagem de RNAi, pipete aproximadamente 300 vermes por poço em uma placa de 24 poços semeada com RNAi. Se a cepa usada for estéril em temperatura, incube os vermes a 15 graus Celsius por aproximadamente 16 horas e depois transfira-os para 25 graus Celsius por 44 horas para completar o desenvolvimento e evitar a embriogênese. Para realizar um ensaio de morte líquida, use um raspador de células para remover a P.aeruginosa de uma placa SK e ressuspender a bactéria em aproximadamente 5 mililitros de S.Basal.Com um espectrofotómetro, medir a DO 600 da suspensão bacteriana. Prepare 24 mililitros de estoque diluído de P.Aeruginosa em S.Basal a um OD 600 igual a 09, em seguida, adicione 21 mililitros de meio SK líquido e, usando uma pipeta multicanal, transfira 45 microlitros de bactérias e meios para cada poço de uma placa de 384 poços. Lave os vermes de sua fonte em um tubo cônico de 50 mililitros e deixe-os assentar sob a força gravitacional.Aspire o sobrenadante a 5 mililitros, depois use um total de 50 mililitros de S.Basal para ressuspender os vermes e repita a lavagem mais duas vezes. Usando um classificador de minhocas, classifique aproximadamente 22 minhocas em cada poço de uma placa de 384 poços, de acordo com o protocolo de texto, depois use um filme permeável a gás para selar a placa e incubá-la a 25 graus Celsius por 24 a 48 horas. No momento desejado, use uma lavadora de microplacas e S.Basal para lavar a placa de 384 poços um total de 5 vezes.Um dos erros mais fáceis de cometer é aspirar a placa de 384 poços antes que os vermes se assentem completamente. É preciso prática para ver com precisão se os vermes se estabeleceram completamente. Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante até 20 microlitros.Em seguida, adicione 50 microlitros de coloração de ácido nucleico 98 micromolar por poço, para uma concentração final de 0,7 micromolar. Incube a placa em temperatura ambiente por 12 a 16 horas. Após o período de incubação desejado, use a lavadora de microplacas para lavar as placas no mínimo três vezes.Para uma aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para obter imagens da luz transmitida e da fluorescência. Adicione um mililitro de S Basal por poço de uma placa de 24 poços contendo 300 vermes por poço. Agite suavemente os vermes agitando a placa e, em seguida, transfira-os para uma placa vazia e estéril de 24 poços profundos.Deixe os vermes se assentarem gravitacionalmente, cerca de cinco minutos. Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro por poço, Em seguida, adicione 7 mililitros de S Basal a cada poço. Repita a lavagem mais duas vezes e, após a lavagem final, aspire todos, exceto aproximadamente 400 microlitros de sobrenadante.Depois de pipetar as bactérias em placas de 384 poços para evitar a fome, usando a função de reamostrador do classificador de minhocas, classifique 22 minhocas em cada poço de uma placa de 384 poços. Finalmente, após a classificação, adicione pequenas moléculas ou outros materiais específicos do experimento. Conforme ilustrado neste gráfico, quando as etapas descritas neste vídeo são seguidas, uma morte dependente do tempo de C.elegans será observada apenas na presença de P. aeruginosa.Em contraste, na ausência de suplementos nutricionais bacterianos essenciais, pouca ou nenhuma morte será observada. Como mostrado aqui, a incubação em duas etapas de P. aeruginosa a 37 graus Celsius e depois a 25 graus Celsius, que é crítica para ensaios convencionais de morte lenta e foi originalmente implementada em matança líquida, é dispensável neste ensaio. O protocolo tolera uma ampla gama de concentrações bacterianas iniciais, desde um OD 600 igual a 0025, e ainda exibe morte dependente do tempo e da concentração, embora o tempo mude.Além disso, apenas quatro poços são frequentemente suficientes para obter dados estatisticamente significativos. Um exemplo da utilidade do processamento é mostrado aqui quando a relação sinal-ruído é alta, como neste exemplo, a análise é simples e discriminar entre condições positivas e negativas é trivial. Nesses casos, mesmo acertos fracos podem ser prontamente identificados.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de 60 a 75 minutos de tempo prático por placa de 384 poços, sem incluir a classificação. Ao tentar este procedimento, é fundamental lembrar de adicionar todos os componentes à sua mídia ou a virulência será comprometida. Este ensaio simplifica a aplicação da triagem baseada no fenótipo de todo o organismo para a descoberta de medicamentos na pesquisa de patógenos hospedeiros.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar ensaios de patogênese de C elegans em base líquida. Este procedimento pode ser modificado substituindo por outros patógenos, como E.Faecalis por P.Aeruginosa, facilitando a busca por tratamentos para outras infecções bacterianas. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias infecciosas como P.Aeruginosa ou E.Faecalis pode ser perigoso.Precauções apropriadas, como treinamento adequado, bom equipamento de proteção individual e técnica adequada, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

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Aqui, fornecemos instruções sobre como utilizar efetivamente o SegElegans, um sistema de aprendizado profundo que desenvolvemos para a segmentação automatizada de worms individuais em imagens de microscopia de campo amplo, para uso subsequente em software de análise de imagens, como o ImageJ. Fornecemos maneiras de usar o sistema online e offline.

Análise automatizada de imagens de fluorescência de C. elegans usando SegElegans

Aprenda a realizar ensaios de patogênese líquida em Caenorhabditis elegans para estudar interações hospedeiro-patógeno e descoberta de medicamentos usando P. aeruginosa. Este método de alta produtividade permite avaliar fatores de virulência e moléculas pequenas de forma eficiente.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

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