Um ensaio multipoço à base de líquido para triagem de knockdowns de C. elegans

Pegue uma placa de vários poços contendo meio de ágar pré-manchado com bactérias RNAi, com ou sem uma inserção específica do gene direcionada a um gene C. elegans .

Semeie vermes sincronizados no estágio L1 nos poços e incuba-os para permitir a alimentação das bactérias RNAi.

A inserção produz RNA interferente que tem como alvo genes específicos de vermes, gerando um fenótipo de knockdown específico do gene.

Adicione tampão aos poços e ressuspenda suavemente os vermes.

Transfira a suspensão para uma placa de poço profundo e deixe os vermes assentarem por gravidade.

Remova o sobrenadante, retendo algum buffer.

Lave as minhocas com tampão e descarte o sobrenadante, deixando uma pequena quantidade de tampão.

Em seguida, pegue uma placa de ensaio de vários poços contendo bactérias patogênicas.

Dispense um número definido de vermes de controle e knockdown em seus respectivos poços para permitir interações patógeno-hospedeiro. As bactérias patogênicas secretam compostos que induzem a mortalidade por vermes.

Compare a mortalidade por vermes para avaliar o efeito do knockdown específico do gene na sobrevivência do verme.

Adicione um mililitro de S Basal por poço de uma placa de 24 poços contendo 300 vermes por poço. Agite suavemente os vermes agitando a placa e, em seguida, transfira-os para uma placa vazia e estéril de 24 poços profundos.

Deixe os vermes se assentarem gravitacionalmente, cerca de cinco minutos. Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro por poço, Em seguida, adicione 7 mililitros de S Basal a cada poço. Repita a lavagem mais duas vezes e, após a lavagem final, aspire todos, exceto aproximadamente 400 microlitros de sobrenadante.

Depois de pipetar as bactérias em placas de 384 poços para evitar a fome, usando a função de reamostrador do classificador de minhocas, classifique 22 minhocas em cada poço de uma placa de 384 poços. Finalmente, após a classificação, adicione pequenas moléculas ou outros materiais específicos do experimento.