A rastre�el In Vivo Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar a toxicidade mitocondrial ou os efeitos benéficos de drogas usando o organismo modelo. C elegância. Isso é obtido pela quantificação in vivo dos níveis de TP em cepas transgênicas de elgan do mar que expressam a enzima crucífera do vaga-lume fundida à proteína fluorescente verde.

O gene de fusão confere duas propriedades distintas aos nematóides. A primeira é que, quando recebem o substrato Lúcifer, os nematóides emitem luz na faixa visível em proporção às suas reservas celulares de A TP. E a segunda é que, quando iluminados com o comprimento de onda apropriado, eles exibirão forte fluorescência verde.

A fluorescência é independente dos níveis de nematóides a TP e é proporcional à sua massa ou número. Portanto, pode ser usado para normalizar as medições de bioluminescência. Durante um ensaio típico, uma população de vermes sincronizados com o desenvolvimento é cultivada até o estágio larval L quatro.

Os nematóides são então tratados com os compostos da droga de teste por um período de tempo antes da medição da fluorescência e da bioluminescência. Os resultados mostram potencial toxicidade do medicamento. Quando a bioluminescência é reduzida, um sinal aprimorado indica um acerto para testes adicionais de efeitos benéficos na função mitocondrial.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a triagem de drogas em células cultivadas, é que a triagem está sendo realizada no contexto fisiológico de um organismo multicelular vivo inteiro com cerca de 50% de oftalmologia genética para humanos. E como os humanos, a elegância realmente requer uma fosforilação oxidativa mitocondrial para se desenvolver na idade adulta e suas mitocôndrias também compartilham com as mitocôndrias de mamíferos muitas características em termos de sua estrutura, sua função, sua bioenergética Os parâmetros críticos dentro do protocolo incluem o estágio de desenvolvimento em que as exposições iniciaram o tempo de exposição ao nematóide, para a droga de interesse e semeadura de número semelhante de nematóides para cada um dos poços e, claro, evitar a contaminação no primeiro dia. Em condições estéreis, transfira os nematóides de uma placa de meio de crescimento de nematóides de seis centímetros em dois mililitros de meio completo S para um frasco com 30 gramas por litro de e coli.

OP 50 em meio completo S, em seguida, incubar o frasco com agitação no quarto dia, branquear a cultura de nematóides GR para colher os ovos e sincronizar a população de vermes. Em seguida, incube os ovos durante a noite em um frasco de vidro contendo 15 mililitros de meio completo S com agitação no dia seguinte, dia cinco, os nematóides estarão no mesmo estágio de crescimento. Para determinar o número de vermes eclodidos usando uma ponta limpa a cada vez, transfira três alíquotas de 100 microlitros de nematóides para microtubos separados contendo 900 microlitros de meio, complementados com 0,01% entre 20 pipetas para cima e para baixo algumas vezes para liberar quaisquer vermes aderidos à ponta.

Em seguida, conte os nematóides em quatro gotículas separadas de 10 microlitros de cada um dos tubos de diluição triplicados e calcule o volume da suspensão de nematóides necessária para estabelecer duas culturas de 20 mililitros com 10 nematóides por 10 microlitros, decantar volumes aproximados em dois tubos cônicos de 15 mililitros pré-pesados. Pesar os tubos para determinar o volume real dispensado. Em seguida, para ajustar os volumes alvo, faça um vórtice suavemente e remova o excesso de volume.

Agora, lave os nematóides em um total de 14 mililitros de S fresco, meio completo por tubo e resus suspenda os pellets em cinco mililitros de meio completo S com 30 gramas por litro de equali. OP 50. Transfira os nematóides para frascos de vidro cônicos contendo 15 mililitros de S completos com 30 gramas por litro de equali.

OP 50 para um volume total de 20 mililitros por frasco e registre o tempo de alimentação. Calcule a média do número de nematóides em nove gotículas de 10 microlitros para confirmar que as culturas são diluídas para 10 nematóides por 10 microlitros. Coloque as culturas na incubadora por 42 a 44 horas.

No sétimo dia, puxe as culturas de nematóides para um único frasco com um giro suave contínuo. Em seguida, transfira três, quatro mililitros de alíquotas de nematóides para uma única calha estéril de 60 mililitros. Use uma pipeta de oito canais para Eloqua, 25 microlitros de nematóides suspensos por poço em 96.

Placas de microtitulação bem pretas com fundo plano e transparente. Em seguida, coloque as tampas de volta nos pratos e reserve. Cada vez que duas placas forem semeadas, transfira outras duas alíquotas de 2,5 mililitros de nematóides para o cocho para repor o volume perdido.

Após semear 13 a 14 placas com nematóides, adicionar 74 microlitros de meio S completo a cada poço e transferir as placas para uma câmara úmida e uma incubadora agitada até a administração do medicamento, enquanto as placas estão tremendo. Descongele 2 96 placas de drogas de solda para teste. Em seguida, usando uma pipeta multicanal e trocando as pontas a cada vez.

Transfira um microlitro da primeira coluna da primeira placa de medicamento para as colunas de um a cinco de uma placa de nematóide. Transfira outro microlitro da segunda coluna da placa do medicamento para as colunas oito a 12 da placa do nematóide. Em seguida, adicione um microlitro de veículo às colunas seis e sete da placa do nematóide.

Use as colunas restantes na placa de medicamentos para tratar o restante das placas de nematóides da mesma maneira, certificando-se de incluir também duas placas tratadas com veículos. Em seguida, devolva todas as placas para as câmaras úmidas na incubadora agitada por mais 20 a 22 horas no oitavo dia. Para preparar uma placa de controle de fundo para leituras de fluorescência, combine o conteúdo do poço de uma placa de nematóides tratada com todos os veículos e deixe os nematóides assentarem por dois a três minutos.

Em seguida, colete as bactérias contendo snat e carregue amostras de 100 microlitros em cada poço de uma microplaca preta com fundo transparente. Observe a placa ao microscópio, observando os poços nos quais os nematóides podem ser vistos para permitir a exclusão desses poços da estimativa de fundo fluorescente. Em seguida, leia a fluorescência finalmente para medir a bioluminescência de cada placa.

Por sua vez, dispense 50 microlitros de tampão de luminescência recém-preparado para cada um, coloque a placa em uma plataforma agitada e inicie o cronômetro após três minutos. Leia a luminescência em um segundo por medição. Neste primeiro experimento representativo, a podridão conhecida como um inibidor do complexo mitocondrial reduziu a produção de luz pelos nematóides após exposições relativamente curtas e mais longas em uma faixa de concentrações.

Neste experimento, o herbicida paraquat demonstrou diminuir significativamente a bioluminescência GFP, a fluorescência e a bioluminescência normalizada da cepa C PE 2 54. Além disso, o declínio da bioluminescência foi maior do que o da fluorescência, consistente com os efeitos conhecidos da diminuição da função mitocondrial e redução da produção de TP provocada pela droga. Este gráfico ilustra um exemplo de um composto que aumenta a bioluminescência do nematóide, o oxaloacetato intermediário do ciclo do ácido cítrico em uma única concentração de oito milimolares.

Observe que a variabilidade experimental observada entre essas réplicas não é incomum para experimentos baseados em Lúcifer. Aqui, observou-se que os compostos inibidores da luciferase do vaga-lume afetam a atividade dos lúciferes in vitro em 25 micromolares e 100 micromolares com uma atenuação quase completa da atividade pelo composto DDD. 1, 4 3 4, embora não seja diretamente comparável, um declínio significativo na bioluminescência foi observado após o tratamento com compostos inibitórios de Lúcifer in vivo também.

Demonstrando que mudanças na bioluminescência podem resultar da ação de inibidores da enzima Lúcifer e não de mudanças nos níveis de A TP in vivo. Ao realizar este procedimento, é importante considerar que os compostos podem afetar diretamente a atividade da enzima luciferase do vaga-lume, em vez de afetar o estado energético do verme. E, portanto, os subaquecimentos podem ser validados usando muitas técnicas para avaliar a função mitocondrial, como, por exemplo, determinação do consumo de oxigênio, determinação do potencial da membrana mitocondrial de espécies reativas de oxigênio ou visualização de mitocôndrias em cepas de elegância do mar.

Com etiqueta GFP, mitocôndrias.