Name: A rastreï¿½el In Vivo Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprenda a rastrear moduladores mitocondriais in vivo usando Caenorhabditis elegans transgênico bioluminescente. Este ensaio permite triar bibliotecas de fármacos e identificar compostos que afetam a função mitocondrial em organismos vivos.

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Os autores gostariam de agradecer a David Gray, da unidade de descoberta de medicamentos de Dundee, por gentilmente doar compostos inibidores de luciferase de vaga-lumes DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047; Tibor Harkani (Universidade Médica de Viena) pela sugestão de oxaloacetato como composto de ensaio; e Charlie Dear (Universidade de Aberdeen) para ilustrações. Este trabalho foi financiado por um prêmio BBSRC Pathfinder (BB / FOF / PF / 4/11) e pela Universidade de Aberdeen.

NOTA: Realizar todas as etapas sob condições estéreis (laminar fluxo de gabinete) e com materiais pré-esterilizados em autoclave (126 ° C, 11 min). Uma placa de LB com estrias E. coli OP50 mantidas a 4 ° C é necessária, raia-se para placas de LB fresco e restreak cada mês. 1. Bacteriana Alimentos (Escherichia coli OP50) Preparação <ol><li> Dia 1. Inocular 2 x 5 ml de LB em duas garrafas universais com uma única colônia de E. coli e OP50 lugar em agitação incubadora a 37 ° C (220 rpm) durante 8 horas. </li><li> Após 8 horas de incubação, utilizar 2 ml de E. coli OP50 LB cultura para inocular cada um dos 3 x 200 ml de LB. Colocar em frascos de agitação incubadora (220 rpm) O / N (17 horas) a 37 ° C. </li><li> Pesar 20 x 50 ml de tubos de centrífuga e escrever o peso sobre o tubo. </li><li> Dia 2. Usando uma pipeta sorológica, alíquota de 30 ml de O / N E. coli em cultura OP50 a pré pesava tubos de centrífuga. Centrifugar a 7,741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Decantar o sobrenadante cuidadosamente, manter o tubo invertido com tampa e deixar repousar durante vários minutos. Usando uma pipeta de remover qualquer excesso de sobrenadante que pode ter recolhido na tampa. Pesa-se o tubo e calcular o peso do pelete. </li><li> Calcular o volume necessário para proporcionar uma suspensão de 30 g / L e marcar este volume no tubo. Data, etiqueta e colocar os tubos a -20 ° C para utilização no prazo de 1-3 meses ou a - 80 ° C, se o armazenamento por mais de 3 meses. </li><li> Prepare a suspensão bacteriana para o crescimento de nemátodos; permitir sedimento bacteriano para descongelar e adicionar o volume necessário de S 11,12 meio completo a cada tubo, de vórtice suavemente para ressuspender sedimento, conteúdo de piscina de tubos diferentes para se obter o volume requerido. Trabalhar sob condições estéreis. </li></ol> 2. Preparação de Padrões droga num formato de placa de 96 poços NOTA: Se estiver usando uma biblioteca de fármacos, placas de drogas são fornecidos em um únicoconcentração de composto em DMSO. Rastreio primário irá testar compostos a uma única operação de concentração. Instruções de seguir para a preparação de medicamentos para a placa de teste confirmativo composto numa gama de concentrações de entre 0-160 uM, seleccionada após significância estatística a 10 uM. Os passos que se seguem podem ser adaptadas para testar outras concentrações. CUIDADO! Siga as precauções necessárias para a manipulação de drogas (geralmente enfrentam máscara, óculos de segurança, luvas são obrigatórios). <ol><li> Prepare a placa de droga com as normas para o rastreio de confirmação de trabalho: pesar a quantidade necessária de composto em tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 ml e se preparar o composto 16 mM em DMSO (ou seja, em relação à concentração de 100x superior desejado para exposição concentrada). </li><li> Serialmente diluídas estoque 16 mM de 1: 2 em DMSO para se obter 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 mm (padrões condições estéreis). Estes são 100x concentrada e será diluído até concentrações finais de 0 (apenas veículo),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM (em DMSO a 1%) durante a exposição à droga. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, colocar 20-50 uL por poço de padrões compostos dentro de uma coluna de uma placa de 96 poços, por exemplo A1 posição da placa: 16 mm, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM de droga e H1: DMSO. Use diferentes colunas para a série de diluição de drogas diferentes. </li><li> Veículo alíquota para as cavidades da coluna 12 na placa de fármaco. NOTA: Este irá facilitar os testes de controlo do veículo para baixo colunas em adição ao teste ao longo fila H, assegurando desse veículo é testado em posições representativas de toda a placa. NOTA: Cada placa de drogas para o rastreio de confirmação contém uma série de diluição para um máximo de 11 diferentes drogas a serem testadas mais o controlo do veículo. </li><li> Rótulo e placa de vedação, cubra com papel alumínio e coloque a -20 ° C até serem necessárias. </li></ol> 3. Experimentos Nematóides NOTA: Realizar todas as etapas under condições estéreis, assepticamente e com pré esterilizado materiais e reagentes. Manter C. elegans estirpes rotineiramente em placas NGM com E. 12 coli OP50. timings sugerido para as diferentes etapas do protocolo são apresentados na Tabela 1. <ol><li> Dia 1 de tarefas: configurar cultura líquida de biossensor tensão para sincronização subseqüente. <ol><li> Tome-se nemátodes de uma placa NGM 6 centímetros (com abundância de larvas jovens onde a comida acaba de correr para fora) em 2 mL S completa e transferir para balão com 30 g / L E. coli OP50 em S completo (volume total de 30 ml em um balão de vidro cónico de 250 ml de capacidade). Incubar 3 dias a 20 ° C, 160 rpm. </li></ol></li><li> Dia 4 de tarefas (permitir que cerca de 30-35 min): cultura lixívia para colher os ovos e sincronizar população worm. Realizar todos os passos de centrifugação durante 1 min, 600 x g. <ol><li> Prepare solução de água sanitária imediatamente antes da utilização: para cada 16 ml de 0,156 M KOH / NaOH adicione 4 ml de lixívia. </li><li> Despeje 2 x 14 mlcultura verme em 15 ml tubos de centrifugação cónicos. Permitir vermes para resolver pela força da gravidade (3 min). Remova e descarte nematóides acima liquidados líquidos. Adicionar 5 ml de solução de água sanitária para cada tubo e iniciar o temporizador. Combine volumes em um tubo. </li><li> Inverta tubo suavemente durante 2 min, verificar sob estereoscópio para a quebra de vermes e a liberação de ovos em suspensão. Quando a maioria de ovos são liberados ou em um tempo máximo de 2 minutos na solução de água sanitária, centrífuga. </li><li> Remover o sobrenadante cuidadosamente. Lave 1x de pelotização com 14 ml S completa e centrifugar. </li><li> Elimine o sobrenadante, adicionar solução de água sanitária 10 ml e iniciar o temporizador (esta segunda etapa de branqueamento garante que a maior parte das carcaças do sem-fim se desintegrar e já não são vistos sob estereoscópio). Depois de um tempo máximo em solução de água sanitária de 2 min, centrífuga. </li><li> Lavar 3x pellet em S completa, decantar cuidadosamente sobrenadante e ressuspender sedimento em 14 ml S completos após cada centrifugação. Após lavagem final, ressuspender pellet ovo em 14 ml S complete. </li><li> Transferir o volume para um frasco de vidro cónico. Incubar 18-24 h a 20 ° C, 160 rpm. NOTA: Colhida ovos eclodem O / N e prender o desenvolvimento na primeira fase larval (L1) devido à falta de comida, portanto, todos eles vão estar no mesmo estágio de crescimento. </li></ol></li><li> Dia 5 de tarefas: configurar culturas vermes sincronizados para ensaios de drogas. NOTA: Worms suspensas em meio de privação tendem a aderir às superfícies plásticas hidrofóbicas, tais como as pontas das pipetas e tubos. 0,01% Tween-20, um agente tensioactivo é utilizado aqui para tornar as superfícies de plástico mais hidrofílico e permitir uma maior precisão na contagem (0,01% de Triton-X100 também pode ser utilizado). Quando nematóides estão no meio suplementado bacteriana, eles não tendem a ficar com plástico. <ol><li> Determinar o número de eclodidos L1 do em balão, balão de manter em plataforma de agitação (160 rpm). <ol><li> Tome 3x 100 amostras ul da garrafa (use uma ponta limpa de cada vez) em 1,7 ml separados microtubos com 900 ul líquido medium 0,01% de Tween-20. NOTA: Aspire amostra de 100 mL na ponta limpo apenas uma vez. Então, quando a distribuição, pipeta cima e para baixo algumas vezes para o meio tween suplementado para liberar quaisquer vermes que aderiram à ponta. </li><li> Conte os nematóides em 4x 10 gotas ul de cada tubo de diluição triplicado. Calcular o valor médio e estimar o número de vermes presentes no frasco de vidro cônico. </li></ol></li><li> Calcule o volume de suspensão de nematóides chocado necessário para configurar uma cultura ml 2 x 20 com 10 nemátodos por 10 jul. Aumentar o volume calculado em 10% a conta para alguma perda nematóide subsequente durante passos de centrifugação. </li><li> Decantar o volume necessário em 2 x 15 ml tubos de centrifugação (pré-pesado). Pesar os tubos para se obter o volume real dispensado, vortex suavemente e ajustar a meta de volume, removendo o excesso de volume com uma pipeta de 5 ml (apenas a ponta estéril deve entrar no tubo). </li><li> Faça o volume para 14 ml com S frescos completos a erah nematóides. Centrífuga (1 min, 600 g). Retire e elimine o sobrenadante com cuidado para não perturbar o pellet nematóide. </li><li> Adicionar 5 ml de S completo com 30 g / L de E. coli OP50 a nematóides peletizadas. Transferir os 5 ml em cada tubo para um frasco de vidro cónico contendo 15 ml S completo com 30 g / L de E. coli OP50. Anote nematóides tempo foram primeiro fornecidos com alimentos. </li><li> Agite suavemente frasco (160 rpm), tome 9 x 10 gotas ul em lâminas microscópicas (use dicas frescos cada vez) para contar nematóides e confirmar média de cerca de 10 (± 2) por 10 ul. </li><li> Coloque frascos de nematóides em agitação incubadora a 20 ° C, 160 rpm durante 42-44 horas. </li></ol></li><li> Dia 7 tarefa: nematóides de transferência para placas de 96 poços e iniciar a exposição ao medicamento. <ol><li> Combinar culturas de nematóides em um único frasco, manter rodando frasco delicadamente e coloque 3 x 4 ml de cultura nematóide em uma calha de 60 ml estéril. Coloque calha em uma plataforma de agitação (160 rpm). </li><li> Use 8 chanNel de pipeta 25 ul alíquota nemátodos suspensos por poço de placas de microtitulação de 96 poços pretas com fundo transparente plana (para tirar ambas as leituras de luminescência e de fluorescência, ou luminescência para placas brancas apenas). Cubra com placa da tampa e reserve. <ol><li> Depois de configurar a cada 2 placas, coloque mais 2 x 2,5 ml nematóides na calha para substituir o volume perdido (manter um &quot;volume morto&quot; na calha de aproximadamente 7 ml). </li><li> Configure 13/14 placas com nematóides. 11 placas de nematóides serão necessários para testar duas placas de drogas de 96 poços. A placa 12 de nemátodo será carregado exclusivamente com veículo como controlo. A 13 de placa será usado para estabelecer a fluorescência de fundo no dia 8 (ver abaixo). Uma placa extra pode ser preparado para uso deve ocorrer erros durante a configuração. </li></ol></li><li> Alíquota 74 ul de S completas a cada poço e colocar a placa em uma câmara úmida (ver lista de materiais) em uma incubadora de agitação (20 ° C, 160 rpm) untIL pronto para compostos de teste alíquota no tempo de desenvolvimento pré-seleccionada (por exemplo, 45 h 30 min após a alimentação fornecida). [Volume por poço é agora 99 ul]. </li><li> Descongelar placa (s) droga para teste. </li><li> Use pipeta multicanal para configurar placas de nematóides com drogas, trocando as pontas de cada vez. Permitir 5 minutos por placa de 96 poços de alíquotas de drogas. <ol><li> Tomar 1 ml de uma coluna st da placa de drogas e adicionar colunas 1-5 de uma placa contendo nematóides; repita a partir do 2 nd coluna na placa de droga em colunas 8-12 da placa contendo nematóides. Adicionar 1 ml de veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide. NOTA: O volume total por poço na placa de nemátodo é 100 ul resultando em uma diluição de 1: 100 de composto / veículo. </li><li> Repita processo por adição de 1 ul de o 3 rd / 4 th coluna da placa de fármaco às colunas 1-5 / 8-12 da segunda placa de nemátodos; adicionar veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide.</li><li> Continuar a testar colunas de pratos de drogas restantes. Configurar um mínimo de uma placa nematóide com o veículo em todos os poços, por amostragem, da coluna 12 da placa de drogas. Coloque placas traseiras em câmaras úmidas em agitação incubadora (20 ° C, 160 rpm) durante 20-22 horas (ver nota para o dia 8). </li></ol></li><li> Parte-se preparar o tampão de luminescência por dia seguinte: adiciona-se DMSO e 10% de Triton-X-100 para o volume necessário de S completa para se obter 1% de DMSO e 0,15% de Triton X-100. Permitir 5 ml por placa de leitura de luminescência, mais 1 ml para priming luminometer injector. </li></ol></li><li> Dia 8 de tarefas: Leia endpoints experimentais - fluorescência e bioluminescência. (Leituras de fluorescência de GFP são recomendadas como um meio para normalizar os dados de bioluminescência.) NOTA: Aponte para ler endpoints por 66-67 horas após a alimentação fornecida aos nematóides, a fim de evitar a produção de progênie significativa nas condições experimentais descritas. <ol><li> Configurar placa ao uso como controle de fundo para as leituras de GFP. Combine bem conteúdo dos 13 th placa em um tubo de 15 ml. Permitir nematóides para resolver (2-3 min). Use sobrenadante para carregar uma microplaca (preto com fundo transparente) com 100 suspensão bacteriana ul por poço. <ol><li> Observe fundo placa de controle sob o microscópio anotando poços onde os nematóides podem ser vistos. Excluir estes a partir da estimativa de fundo usada na análise de dados subsequente. </li></ol></li><li> Ler a fluorescência de cada placa de 96 poços, incluindo o controle de fundo. (Configurações: sistema ótico de fundo da placa; filtros 485/20 excitação; emissão 528/20). </li><li> Preparar tampão para leituras de luminescência: adiciona luciferina (20 mM) de co-preparado tampão (a partir do dia anterior), para se obter tampão de luminescência com 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 (3x) e 0,3 luciferina mM (3x ). Primeiro luminómetro injector 6x com 150 ul de tampão de luminescência. <ol><li> Etapa anterior assume 1% DMSO como veículo durante a exposição à droga. Quando o veículo é água, ajustar o concentration de DMSO em tampão de luminescência a 3% (isto é, 3x). </li></ol></li><li> Trabalhar com uma placa de cada vez. Dispensar tampão 50 ul por poço de luminescência. (150 mL de volume final em bem; 3x diluição de tampão luminescência: DMSO 1%, 0,05% Triton-X100 e 0,1 mM concentrações luciferina finais). Coloque imediatamente na plataforma de agitação e iniciar o temporizador. <ol><li> Após 3 min em plataforma de agitação (160 rpm), leia luminescência (1 seg por medição). </li></ol></li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Subtrair fundo GFP média dos resultados de leitura de fluorescência. Divida bioluminescência pela respectiva leitura GFP. <ol><li> Quando um valor elevado de GFP é detectado por nemátodos expostos a um composto, medir a fluorescência do composto por si próprio em conta qualquer fluorescência do composto. Se superior à média, usar isso como plano de fundo em vez disso. </li></ol></li><li> Bioluminescência expresso, um GFP normalizada bioluminescênciand dados de fluorescência de GFP como uma percentagem do valor médio de controlo de veículo em cada placa. </li><li> Traçar os valores médios e as barras de erro para cada concentração. </li><li> Teste de significância estatística usando 2-way análise de variância (ANOVA) com efeitos de &#39;concentração&#39;, &#39;Experiment&#39; e sua interação (cada ponto de dados refere-se a um único poço), e usar o teste de Dunnett como teste post-hoc (vs . controle do veículo). NOTA: Se o &quot;experimento&quot; ou os termos &quot;interação&quot; são significativos, novos experimentos podem ser necessárias para confirmar a resposta. Onde há variabilidade entre os experimentos resulta da observação dos gráficos de dados, um One-way ANOVA pode ser realizada em dados obtidos a partir de experimentos independentes. <ol><li> Para a análise estatística da placa (s) apenas com veículo, seleccione todos os poços em colunas 6 -7 e todos os poços na fila H como grupo controle (estas são as posições rotineiramente atribuídos ao veículo durante o teste composto). </li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

O organismo modelo C. elegans fornece um poderoso sistema experimental. É fácil de cultura abundante e produz progenia geneticamente idênticos, com um ciclo de vida do dia 3,5 de ovo a reprodução de adulto (através de estágios larvais juvenis através L1 a L4). Devido ao seu pequeno tamanho, pode ser convenientemente cultivadas em placas de 96 poços, o que facilita a triagem composto. Nós apresentamos um protocolo de triagem fenotípica com base em cepas de C. elegans que actuam como sensores in vivo dos níveis de energia 14 O protocolo. é aplicável a qualquer laboratório, embora seja necessário um luminómetro de placas de 96 poços e um armário estéril. É importante evitar a contaminação em ensaios usando boa técnica laboratorial. Se trabalhar manualmente, o número máximo de placas de nematóides atingível é de 13 por experimento permitindo o teste de 2 x placas de 96 poços e de drogas incluindo duas placas de veículos. Os resultados representativos são apresentados para o complexo mitocondrial I inibidor rotenone, o paraquat gerador de superóxido, o oxaloacetato intermediário ciclo de ácido cítrico e quatro compostos com conhecida atividade inibitória da luciferase do pirilampo. Os primeiros dois compostos conduziu a um decréscimo na bioluminescência como previsto oxaloacetato Considerando que conduziu a uma melhoria, podem resultar de uma maior geração de ATP. Os conjuntos de dados oxaloacetato também demonstram a variabilidade intrínseca em experiências com base na luciferase do pirilampo como um repórter. Um mínimo de três experiências independentes são aconselháveis ​​para determinar a robustez das respostas aos compostos desconhecidos. A inibição da actividade da luciferase do pirilampo foi identificável com um ensaio in vitro utilizando um kit comercial. 3 Um dos compostos resultou num aumento substancial da fluorescência da GFP consistente com o inibidor de aumentar os níveis de luciferase de pirilampo pela ligação à enzima luciferase do activo marcado com GFP local, e tornando-o mais estável. 15 Em alguns casos(não, neste caso particular), o que pode levar ao aumento dos níveis de bioluminescência quando o inibidor é deslocada por um excesso de substrato. 15 É, portanto, importante não interpretar os resultados erradamente a partir de compostos que interagem com a enzima de pirilampo como níveis de ATP diminuída ou aumentada / função mitocondrial. As alterações no sinal de luminescência muitas vezes se correlacionam com as medições adicionais de saúde, tais como movimento, crescimento e desenvolvimento. Como um exemplo, um composto é um inibidor da luciferase suspeito se um declínio dramático do sinal de bioluminescência é detectado mas os vermes são indistinguíveis dos controlos por observação microscópica. Um aumento na fluorescência da GFP, não explicado pelo crescimento ou autofluorescência composto, também pode apontar para um inibidor. Uma série de inibidores da luciferase 15 são conhecidos e foram celebrados PubChem. Portanto, em primeira instância, é uma boa prática de consultar informações sobre os inibidores da luciferase detidas por PubChem; seguido por tressante os efeitos de compostos em ensaios in vitro com a enzima purificada, 3 e / ou a confirmação de efeitos sobre a função mitocondrial por meios adicionais. 16,17 Medições de fluorescência da GFP permitir a detecção de níveis de luciferase de pirilampo (ea detecção potencial de alguns inibidores da enzima luciferase, como discutido acima) fazendo um forte argumento para a medição deste parâmetro ao lado de bioluminescência sempre que possível. A normalização das leituras bioluminescência a GFP é também um meio de contabilizar variações no número de vermes entre poços (embora isto também pode ser conseguido pela inclusão de múltiplas repetições técnicas). Para uma maior sensibilidade, é importante para subtrair a fluorescência de fundo de leitura. O protocolo avalia contribuição da suspensão bacteriana para a fluorescência de fundo, no entanto nemátodo autofluorescência não é contabilizada (uma limitação do ensaio corrente, particularmente crítico para qualquer Stu envelhecimentomorre dado que nematóide autofluorescência aumenta com a idade). Autofluorescência de compostos de teste também deve ser avaliada em paralelo. GFP normalização pareceria indispensável quando investigadores deseja adaptar o protocolo para comparar piscinas de ATP celular em diferentes mutantes genéticos ou após o silenciamento de genes diferentes, a fim de controlar para quaisquer diferenças de tensão ao nível de expressão do transgene bioluminescência. Os parâmetros críticos dentro do protocolo de incluir a fase de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição, e a obtenção de um número semelhante de nemátodos nos diferentes poços. A exposição pode começar em qualquer fase de desenvolvimento dos nematóides, no entanto fase L3 ou mais é preferível. A partir dessa etapa, nematóides depender de fosforilação oxidativa para o desenvolvimento até a idade adulta, como evidenciado por um aumento muito significativo no teor de mtDNA, consumo de oxigênio e níveis de ATP. 18,19,20 O presente protocolo inicia exposure no estádio L4. A razão para alíquotas nemátodos para placas de 96 poços apenas nesta fase (ao invés do que quando eles foram em primeiro lugar dotado de comida na fase L1), é que, embora as placas são colocadas em câmaras húmidas para minimizar a evaporação, um grau de evaporação ainda ocorre em nossa incubadora de agitação, vista como muito pequenas gotículas que formam nas tampas (isto pode não ser um problema com outras incubadoras agitação). Por nemátodos alíquotas para placas imediatamente antes da adição de padrões de droga, a concentração efectiva da droga não é afectada por qualquer variação pequena no volume devido a evaporação. Carregando uma placa com nematóide veículo só é útil para verificar se os nematóides foram distribuídos uniformemente entre os poços. Não existem diferenças significativas para o veículo só placa seria indicativo de má técnica na distribuição dos nematóides aos poços. A duração da exposição é um fator importante a considerar. Se os efeitos sobre o estado de energia de forma independente do crescimento são de interesse, o proprotocolo pode ser modificado para acomodar exposições mais curtas (de respostas quase imediatos para, por exemplo, 2 horas). Por outro lado, a entrada de compostos em C. tecidos elegans pode levar algum tempo. Por exemplo são necessárias 12-24 horas para atingir as concentrações máximas internas do resveratrol e 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (FUdR). 21 Por conseguinte, uma exposição mais longa (18 a 24 horas) pode ser justificada para maximizar os níveis de exposição. O tempo de exposição deve ser limitado aos tempos que não permitem níveis significativos de reprodução para tomar lugar no poço. Recomendamos que o tempo total de desenvolvimento de nematóides é mantida sob 66-67 h. Embora conveniente, nematóides estão grávidas até lá e deram início a oviposição. No entanto descobrimos leituras bioluminescência preparações de ovo a ser insignificante (não mostrado). O sur-5 promotor impulsionado expressão do transgene é primeiro detectada apenas 2-2 horas e meia após a fertilização na fase 100 célula 22 e a ccasca de ovo hitinous é susceptível de limitar a entrada de luciferina. Outros descobriram que os ovos embrionados não contribuem significativamente para o metabolismo dos adultos grávidos. 23 No entanto, as condições que permitem a produção de descendência significativo, devem ser evitados. Se preferir, a escala de tempo experimental pode ser deslocado de volta: nós já iniciou a exposição a uma toxina ambiental na tarde L3 fase larval (36 h) e realizado bioluminescência e GFP medições a 55 hr 2 fundos alternativa, genéticas que são condicionalmente estéril. pode ser usado para evitar a produção de descendência, como por exemplo o fer-15 (B16) II; Fem-1 (hc17) IV mutante duplo que pode ser mantida a 15 ° C, mas é estéril a 25 ° C. 24 A utilização de FUDR para induzir a esterilidade não é recomendada como este pode, por si só afecta o metabolismo de nemátodos. 25 O ensaio pode também ser realizada em estirpes com cutículas mais permeáveis, tais como perda parcial-do-functião barramento-8 mutantes que são devidos a aumento da permeabilidade de drogas sensíveis a fármacos múltiplos. 26 Isto irá facilitar a exposições mais curtas e baixas concentrações de composto. As condições para a adição de luciferina a estes nemátodos podem também precisam de ajuste ou seja, 1% DMSO e 0,05% de Triton-X100 no buffer de luminescência pode não ser necessária para aumentar a disponibilidade luciferina. O protocolo usa 1% de DMSO como veículo para a entrega do composto. Embora não letal, esta concentração de DMSO tem alguns efeitos biológicos como já discutido na publicação anterior. 3 Muitas das bibliotecas de medicamentos disponíveis são preparadas em 100% de DMSO, em concentrações que serão adequados para os ensaios baseados em células, após a diluição de veículo a 0,1%. Concentrações de composto mais elevados são necessários para induzir respostas em C. elegans quando comparado com células de origem humana, de tal modo que muitas vezes não é possível realizar ensaios em menor do que 1% de DMSO. Mais uma vez, a utilização de estirpes comcutículas mais permeáveis ​​podem levar a testes com concentrações mais baixas de veículo. As concentrações de DMSO de 1% mais elevada do que não são recomendados. Um tempo de incubação conjunto com luciferina antes de leituras devem ser respeitados. Como foi mostrado anteriormente, luminescência atinge seus níveis máximos no segundo minuto após a adição de luciferina, permanecendo relativamente estável para o primeiro 5 min, seguido por uma diminuição gradual lento na luminescência ao longo do próximo 30 min 1. Respostas cinéticas para uma determinada substância química pode ser levada a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos após a distribuição inicial da luciferina. O protocolo envolve um passo de fome após a coleta de ovos para conseguir a sincronização da população do nematóide. Recomendamos sincronização de populações de nemátodos de teste uma vez que diferentes estágios de desenvolvimento diferem nos níveis de ATP celular e pode responder de forma diferente para os compostos de teste. Ao realizar a fome no S completomédio, por oposição a M9, os nemátodos incubação são fornecidos com uma fonte de carbono (etanol), de modo que as larvas não se desenvolvem, mas não são completamente fome 27,28. Também tem sido demonstrado que são presos L1 do preparado de resposta rápida ao alimento e L1 taxa de crescimento normal é alcançado dentro de 3 h após o alimento fique disponível. 29 No entanto, a possibilidade de que o passo de jejum pode alterar o metabolismo de C. elegans não pode ser excluída. 30 Por esta razão, o comprimento de fome não deve ser superior a 24 horas (18 horas é suficiente para sincronização). Alguns laboratórios podem ter a possibilidade de utilizar uma Copas Biosorter para sincronização de idade ignorando o passo fome completamente. Outros laboratórios podem ter uma preferência para a expansão da população de nematóides em meio sólido (placas NGM com OP50) antes do branqueamento (passo 3.1) e isso vai funcionar muito bem. Nós usamos meio S durante a exposição composto como um meio padrão para nematóide cultura, however outros meios de comunicação pode ser seleccionado, por exemplo K médio ou EPA moderadamente água dura são frequentemente utilizados para estudos ecotoxicológicos 31,32. O protocolo proporciona um meio para rastrear e identificar candidatos para análises adicionais em termos dos efeitos sobre a função mitocondrial. Na fase de rastreio primário, é provável que alguns compostos que foram perdidas devido a uma única concentração a ser testada, por conseguinte, telas de drogas não deve ser considerada exaustiva. Visitas podem ser validados pelo uso de técnicas para avaliar diferentes aspectos da função mitocondrial por exemplo o consumo de oxigénio, C. elegans com estirpes expressando GFP mitocôndrias, manchas de potencial de membrana mitocondrial e / ou medições de ROS. 16,33,34 A maior importância da metodologia é ter um meio para o rastreio de grande número de compostos e / ou condições ao nível do organismo multicelular, e mais importante, de ser capaz de tirar vantagem do the tratabilidade genética de C. elegans para investigar os mecanismos de ação. A técnica pode ajudar a acelerar e encontrar novos caminhos para a descoberta de compostos e alvos interessantes. Prevê-se que a combinação do sensor com fundos genéticos associados à doença humana para o rastreio de bibliotecas de compostos, num contexto em causa doença terá muito a oferecer.

O objetivo geral deste procedimento é a rápida quantificação do status de energia do C. elegans in vivo, com vista a utilizar este como um ponto final na triagem composto. A base racional é com base na expressão transgénica da luciferase de pirilampo, no nemátodo C. elegans 1-3 através do plasmídeo pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> A enzima luciferase é fundida com a proteína fluorescente verde GFP e é expressa constitutivamente e ubiquamente no citoplasma (o sinal de direccionamento de peroxissoma luciferase foi removido). Isto conduz a emissão de luz, quando o substrato luciferina é fornecido exogenamente. À medida que o sem-fim é transparente, a luz pode ser medida num luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustíveis de ATP celular a reacção de bioluminescência e a sua disponibilidade determina os níveis de luz produzidos. Consequentemente, luminometria oferece uma convenient meios de avaliar os níveis relativos de ATP e função mitocondrial por extensão, uma vez que a produção de ATP ocorre principalmente nas mitocôndrias. A relação entre os níveis de função e bioluminescência mitocondriais tem sido demonstrada previamente através do silenciamento dos genes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e concomitante redução da produção de luz. 1 As cepas bioluminescência gerados foram designados PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) 1 (ver lista de materiais) e podem ser utilizados indiferentemente. 3 Um número de estudos foram utilizadas essas estirpes de sensores para informar sobre os níveis de ATP celular in vivo a seguir a exposição a vários produtos químicos xenobióticos tais como azida de sódio 1, cádmio 2, esgoto extracto de lamas 3, 5&#39;-f luoro-2-desoxiuridina 6, e uma nitrosamina específica do tabaco 7. As cepas também têm sido úteis para monitorizar os efeitos da exposição à radiação ultravioleta C <saté&gt; 8 e efeitos de perturbar a função da cadeia respiratória mitocondrial. 1,9 Uma primeira versão do sensor de luminescência que expressa o gene da luciferase sem uma fusão GFP (PE39) também tem sido utilizada na investigação dos efeitos de metais pesados ​​e de um respiratória . 10 Cepas PE254 PE255 e desacoplador levar a luciferase: GFP fusão e fluorescência da GFP foi mostrado para aumentar proporcionalmente com massa nematóide, oferecendo um meio conveniente para a normalização dos valores de luminescência 6,9 Os efeitos do montante diferencial de vermes por poço também pode ser. tidas em conta, incluindo várias repetições técnicas no ensaio (um mínimo de 5 poços por condição). 3 O protocolo oferece a possibilidade de monitorização in vivo dos níveis de energia (em oposição a mais tecnicamente laboriosa determinações in vitro de ATP), que permite rastreio de compostos e reposicionamento no contexto fisiológico de um mu inteirolticellular organismo. O procedimento pode ser estendido para uma variedade de origens genéticas, atravessando o transgene cromossomicamente integrados em cepas mutantes disponíveis e / ou por silenciar genes por RNA de interferência; Assim, aproveitando ao máximo C. elegans como organismo modelo. O método deve ajudar a reduzir a falta de fase tardia de candidatos a medicamentos devido à toxicidade mitocondrial e fazer uma contribuição para a redução de maior experimentação animal.

<table><tbody><tr><td>Luminômetro de Microplacas Orion II</td> Sistemas <td></td><td>de Detecção Berthold</td><td>com injetor e o Software Simplicity 4.2; transfira dados para o Excel no final da medição da placa</td></tr><tr><td>Fluorímetro FLx800&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>com Software Gen5; transferir dados para o Excel no final da medição da placa</td></tr><tr><td>Plataforma básica de agitação Ks 130</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Agitador de incubadora refrigerado</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>com rotor eppendorf A-4-44&nbsp; (para 50/15&#160; tubos de ml)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Pipeta sorológica</td></tr><tr><td>Cellstar tubos de 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tubos de 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos Cellstar de 60 mm&nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td> <td># 628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost lâminas de microscópio</td><td>VWR</td> <td># 631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Espátula estéril</td><td>Corning</td> <td># 3007; # 3004</td><td>para pesagem de produtos químicos</td></tr><tr><td>0,22 mM Millex GP filtros</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf tubos 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 placa de ensaio de poço</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Placa preta de fundo transparente com tampa</td></tr><tr><td>Nunc 96 placa de ensaio de poço</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>Placa branca com tampa</td></tr><tr><td>Reagente reservatório 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipeta</td><td>#9510027</td><td>utilizada como calha para nemátodos na secção do protocolo 4.4.1</td></tr><tr><td>Caixa de armazenamento/câmara húmida</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56,6 mm, usado como câmara úmida com toalhas de papel molhadas; 2x placas de 96 poços com tampas podem caber em uma, a parte inferior assentada em cima de uma tampa de microplaca</td></tr><tr><td>Alvejante: Solução de hipoclorito de sódio 4-4,99% de teor de cloro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Armazene em alíquotas em 4&#160; &deg; C,&nbsp; selar com Parafilm para evitar perda de cloro e cobrir em folha</td></tr><tr><td>D-Luciferina, sal de potássio</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Sondas Moleculares também podem ser usadas como fornecedor; preparar um estoque de 20 mM em ddH2O, manter em -20 &deg; C em alíquotas</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Pureza 99,99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute a 10% em ddH2O</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans cepas bioluminescentes</td><td>O laboratório do próprio autor</td><td>PE254, PE255</td><td>contém matrizes integradas feIs4 e feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectivamente no cromossomo V e X; selecione para expressão homogênea e forte de luc::GFP por microscopia de fluorescência (e.g. escolha 15 vermes) de vez em quando.</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Produtos químicos gerais</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rastreï¿½el<em&gt; in vivo</em&gt; ensaio para mitocondrial modulators usando transgenic bioluminescent<em&gt; caenorhabditis elegans</em

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

O organismo modelo multicelular Caenorhabditis elegans é um pequeno nematóide de aproximadamente 1 mm de tamanho na idade adulta que é genética e experimentalmente tratável. É econômico e fácil de cultivar e dispensar em meio líquido, o que o torna adequado para triagem de médio rendimento. Anteriormente, validamos o uso de cepas transgênicas de C. elegans que expressam luciferase para fornecer uma avaliação rápida in vivo dos níveis de ATP do nematóide. 1-3 Aqui apresentamos os materiais e procedimentos necessários para realizar bioensaios com as cepas bioluminescentes de C. elegans PE254 ou PE255 (ou qualquer uma de suas cepas derivadas). O protocolo permite a detecção in vivo de efeitos subletais de drogas que podem identificar toxicidade mitocondrial, bem como a detecção in vivo de potenciais efeitos benéficos de drogas. Resultados representativos são fornecidos para os produtos químicos paraquat, rotenona, oxaloacetato e para quatro compostos inibidores da luciferase de vaga-lumes. A metodologia pode ser ampliada para fornecer uma plataforma para triagem de bibliotecas de medicamentos para compostos capazes de modular a função mitocondrial. A avaliação pré-clínica da toxicidade do medicamento é frequentemente realizada em linhagens de células humanas cancerígenas imortalizadas que derivam ATP principalmente da glicólise e são frequentemente tolerantes a tóxicos mitocondriais. 4,5 Em contraste, C. elegans depende da fosforilação oxidativa para sustentar o desenvolvimento na idade adulta, traçando um paralelo com os humanos e proporcionando uma oportunidade única para a avaliação de compostos no contexto fisiológico de um organismo multicelular vivo inteiro.

Os resultados representativos para ilustrar o método foram obtidos para rotenona (Figura 1), o paraquat (Figura 2), o oxaloacetato (Figura 3), e 4 compostos que foram apanhados inibidores como luciferase de pirilampo durante o rastreio de uma biblioteca de medicamentos 13 (Figura 4). A exposição da droga foi iniciada na fase de L4 em todos os casos, mas os experimentos de exposição paraquat foram iniciadas em 41 horas após a primeira comida fornecida aos nematóides em comparação com 45-46 horas para os outros compostos. O protocolo permite um grau de flexibilidade na selecção de tempo para o início da exposição ao fármaco e a duração da exposição. No entanto, para fins de rastreio, definir horários devem ser respeitados, uma vez selecionados, para a reprodutibilidade entre os experimentos. Endpoints deve ser medido por 66-67 hr tempo de desenvolvimento, a fim de evitar extensa postura de ovos para incubação e de progênie em poços. Diretrizes para horários são fornecidos em Tcapaz 1. Rotenona, um complexo mitocondrial I de inibidor, reduzida bioluminescência após ambas as exposições relativamente curtas (2 horas) e mais longo (24 horas) para uma gama de concentrações (Figura 1). Neste exemplo, as medições foram levadas GFP, mas o número de repetições técnicos utilizados (n = 6) é suficiente para uniformizar quaisquer diferenças nos números de vermes entre 3 poços. A exposição de 24 horas é uma janela de tempo durante o qual os nemátodos crescer, e desenvolvimento mais lento, como resultado da complexa inibição eu era esperado para contribuir para o declínio da bioluminescência. Isto foi confirmado por observação visual sob estereoscópio com desenvolvimento retardado visto, particularmente em concentrações de 20 ^ M e acima; Além disso, alguns letalidade foi observada a partir de 40? M (observações qualitativas não quantificada). Sem letalidade foi observada após a exposição 2 hr, mas efeitos sobre o movimento sem-fim foram vistos. Um declínio acentuado na bioluminescência em relação aos controles ocurred na concentração mais baixa testada de rotenona 2,5 uM, para os quais os efeitos não foram facilmente detectadas por observação visual rápida em 2 horas de exposição. Este declínio da bioluminescência é consistente com a redução do ATP celular. A inibição máxima foi alcançada com a concentração mais baixa de rotenona utilizado (2,5 uM), indicando que todas as experiências subsequentes destinadas especificamente às rotenona deve ser realizada entre 0 e 5 uM [na gama de concentrações 0-160 uM foi seleccionado como parte de uma comparação com outras drogas inicialmente identificado como tendo efeitos significativos em 10 mM (a ser publicado em outro lugar)]. O herbicida paraquat afeta a função mitocondrial por meio de aumento de espécies reativas de oxigênio. Aqui, demonstramos o seu efeito sobre a bioluminescência de C. elegans estirpe PE254 após exposição a uma gama de concentrações de 24 h (Figura 2). À medida que a tensão carrega uma luc :: fusão GFP, fluorescência da GFP foi alsO medidos como um meio de normalização. paraquat 6,9 diminuiu a bioluminescência, fluorescência da GFP e bioluminescência normalizada significativamente. O teste post-hoc Dunnet indicaram que as concentrações de paraquat com diferenças significativas em relação ao controlo do veículo foram 4 e 8 mm para a bioluminescência e bioluminescência normalizado, bem como 2 mM para bioluminescência normalizado. A única concentração reduzindo significativamente fluorescência da GFP foi 8 mm, uma concentração em que os efeitos do crescimento e do verme morto ocasionais foram vistos (observações qualitativas). O declínio na bioluminescência (e bioluminescência normalizado) foi maior do que a de fluorescência, consistente com uma diminuição da função mitocondrial e os efeitos sobre a produção de ATP. O oxaloacetato intermediário do ciclo do ácido cítrico testado em C. elegans estirpe PE254 numa concentração única de 8 mM, levou a um aumento da bioluminescência (Figura 3). Sem fluorescência da GFPNCE medições foram obtidas ou observação visual adicional realizado; no entanto, tais resposta a uma única operação de concentração merecem uma exposição de confirmação para uma gama de concentrações, e observações mais detalhadas sobre os efeitos. Um acessório de bioluminescência por este composto não é surpreendente, uma vez que pode ser postulada para levar a uma maior actividade do ciclo do ácido cítrico, com última análise, uma maior produção de ATP (no entanto, seria aconselhável controlar a quaisquer efeitos sobre os níveis de luciferase por meio da avaliação fluorescência da GFP em experiências subsequentes). Os conjuntos de dados oxaloacetato mostrado revelam o grau de variabilidade na resposta vista com base em experiências de luciferase. Em nossa experiência esta variabilidade é uma característica do sistema de teste particularmente para as condições de exposição menos prejudiciais. O compostos inibidores da luciferase do pirilampo DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047 foram testadas in vitro vendo os efeitos sobre a puenzima rified e in vivo usando o C. elegans luc: GFP expressando tensão. Não houve evidências de que qualquer um dos compostos testados causou a morte de nemátodos sob as condições de exposição. Todos os 4 compostos afectou a actividade de luciferase in vitro para as concentrações testadas 2 25 e 100 uM (Figura 4A). DDD00001434 matou a actividade da luciferase purificada quase completamente, o que proporcionou uma justificação credível para o grande decréscimo na bioluminescência in vivo (Figura 4B). Embora, in vitro e in vivo em ensaios não são directamente comparáveis, a resposta a DDD00023047 foi semelhante em ambos os ensaios. DDD0001477 e DDD00000635 causou um declínio maior in vivo do que in vitro. Estes compostos foram fornecidos para os vermes vivos 22 h antes de o substrato luciferina, e os resultados podem reflectir que eles não eram facilmente deslocado do local activo de luciferase luciferina quando se tornou pilable. Alternativamente, DDD0001477 e DDD00000635 pode ter um efeito adicional sobre os níveis de ATP celular. Isso teria de ser avaliado por meio que não envolvem a luciferase de vaga-lume. De destacar a forte valorização do sinal GFP em vermes vivos expostos ao composto DDD00000635. Isto será discutido a seguir. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Figura 1. O complexo mitocondrial I inibidor rotenone diminuiu o estado de energia de C. elegans como medido por bioluminescência de estirpe PE254. Sincronizada L4 vermes estágio (45-46 h após o alimento fornecido a larvas L1) expostas a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM em rotenona 1% de DMSO durante 2 hr (short) ou 24 horas (exposição longa) leituras anteriores de bioluminescência, respectivamente, em 48 e 69 h de desenvolvimento verme após o alimento fornecido. Bioluminescência (unidade relativa Unidades de luz, RLU) foi expressa como uma percentagem do veículo (1% DMS) Os valores de S. As barras de erro representam SEM de réplicas para cada concentração de técnicas rotenona (n = 6). Todas as concentrações testadas resultou em uma diferença altamente estatisticamente significante em relação ao controle de veículo (p &lt;0,001). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Figura 2. O paraquat estressor oxidativo diminuiu o estado de energia de C. elegans PE254 estirpe de um modo dependente da concentração (medida por bioluminescência). vermes fase sincronizada L4 (por conveniência, neste caso a 41 horas após o alimento fornecido a larvas L1) foram expostas a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 paraquat mM durante 24 h. A fluorescência de GFP (unidades de fluorescência relativa unitários, RFU) foi usado para normalizar os dados de bioluminescência (unidade RLU), ambos os pontos finais obtidos em 65 h de desenvolvimento. Os dados são expressos como uma percentagem de controlo (DMSO a 1%). As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas(n = 5 para diferentes concentrações; n = 18 para os controlos). One-way ANOVA: *** p &lt;0,001 em relação ao veículo de controlo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Figura 3. O intermediário oxaloacetato ciclo do ácido cítrico (8 mM) aumentaram a bioluminescência de C. elegans PE254 tensão. Synchronized L4 vermes estágio (45-46 horas após a refeição fornecida às larvas L1) foram expostos a recém-preparados 8 oxaloacetate mM durante 18 horas ± 30 min. A bioluminescência (unidade RLU) foi lida a um período de desenvolvimento de HR 63,5 ± 1 h e esta foi expressa como uma percentagem do controlo de veículo (ddH2O). Diferentes colunas representam diferentes conjuntos de 8 repetições técnicas atribuídas a diferentes placas de 96 cavidades dentro da mesma experiência de dados. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). 2 way-ANOVA com &#39;set&#39; e &#39;concentração&#39; como fatores: ̵6; Definir &#39;p&gt; 0,05&#39; &#39;, p concentração &lt;0,001 e termo de interação p&gt; 0,05. UMA <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Figura 4. Teste de respostas a 4 compostos da biblioteca Dundee descoberta da droga composto 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 e C4: DDD00023047) com atividade inibitória conhecida em vaga-lume luminescência da luciferase. (A) Efeito dos compostos sobre a actividade de luciferase de pirilampo purificada (medido como unidades de luz, RLU), expresso como uma percentagem do controlo de veículo. O kit de bioluminescência de ATP CLSII (Roche, Manheim, Alemanha) foi usada de acordo com instruções fornecidas com a mesma quantidade de enzima luciferase aliquotadas para poços de branco (96-Well placas de microtitulação). ATP foi fornecido a uma concentração final de 10 uM e 1 ul de composto (concentração final indicada) ou DMSO (1%) foi adicionado. Sinal de luminescência foi integrado durante 10 segundos. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 4). Análise: One-way ANOVA; * p &lt;0,05 ou *** p &lt;0,001 em relação ao veículo de controlo. Diferenças entre 25 e 100 uM altamente significativas para C1 (DDD00001434; p &lt;0,001), e significativo para C2 e C3 (respectivamente DDD0001477 e DDD00000635; p &lt;0,05). (B) in vivo medições de bioluminescência, bioluminescência normalizado a fluorescência da GFP e fluorescência da GFP de C. elegans PE254 estirpe em 67 hr tempo de desenvolvimento após a exposição a compostos de teste durante 22 h. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). A análise estatística (one-way-ANOVA) realizada em dados agrupados de 3 conjuntos de dados (3 xn = 8). * p &lt;0,05 ou *** p &lt;0,001 em relação ao controlo de veículo respectivo. Diferenciadaces entre 25 e 100 mm única estatisticamente significativa (p &lt;0,05) para a bioluminescência normalizado após a exposição a C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hora do dia </td><td> Dia 1 </td><td> Dia 2 </td><td> Dia 3 </td><td> Dia 4 </td><td> Dia 5 </td><td> Dia 6 </td><td> Dia 7 </td><td> Dia 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 4 </td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Passo 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Visão geral das etapas do protocolo a ser realizado em cada dia de experimentos de nematóides (Seção 3) e sugeriu timings.

Um protocolo é descrito para detecção in vivo de efeitos de inibidores mitocondriais no organismo modelo Caenorhabditis elegans e para identificação de potenciais compostos potenciadores. Este protocolo pode ser usado para rastrear bibliotecas de medicamentos em busca de compostos que modulam a função mitocondrial.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

O objetivo geral do seguinte experimento é identificar a toxicidade mitocondrial ou os efeitos benéficos de fármacos utilizando o organismo modelo C. elegans. Isso é alcançado pela quantificação in vivo dos níveis de ATP em linhagens transgênicas de C. elegans que expressam a enzima luciferase de vagalume fundida à proteína fluorescente verde.O gene de fusão confere duas propriedades distintas aos nematodos. A primeira é que, quando fornecido o substrato Luciferina, os nematodos emitem luz na faixa visível em proporção às suas reservas celulares de ATP. E a segunda é que, quando iluminados com o comprimento de onda apropriado, eles exibirão forte fluorescência verde.A fluorescência é independente dos níveis de TP nos nematoides e é proporcional à sua massa ou número. Portanto, pode ser utilizada para normalizar as medidas de bioluminescência. Durante um ensaio típico, uma população de vermes desenvolvimentalmente sincronizados é cultivada até o estágio larval L4.Os nematodos são então tratados com os compostos medicamentosos em teste por um determinado período antes da medição da fluorescência e da bioluminescência. Os resultados indicam potencial toxicidade medicamentosa. Quando a bioluminescência é reduzida, um sinal aumentado indica um acerto para testes adicionais quanto a efeitos benéficos na função mitocondrial.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como triagem de fármacos em células cultivadas, é que a triagem é realizada no contexto fisiológico de um organismo multicelular vivo inteiro, com cerca de 50% de genética compartilhada com os humanos. E, como nos humanos, o organismo requer fosforilação oxidativa mitocondrial para se desenvolver até a fase adulta, e suas mitocôndrias também compartilham com as mitocôndrias de mamíferos muitas características em termos de estrutura, função e bioenergética. Parâmetros críticos dentro do protocolo incluem o estágio de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição do nematódeo ao fármaco de interesse, o semeamento de um número semelhante de nematódeos em cada poço e, naturalmente, a prevenção de contaminação. No dia um, sob condições estéreis, transfira nematódeos de uma placa de meio de crescimento para nematódeos de seis centímetros, em dois mililitros de meio S completo, para um frasco contendo 30 gramas por litro de E. coli.OP 50 em meio S completo, então incubar o frasco com agitação no quarto dia, branquear o cultivo de nematoides GR para colher os ovos e sincronizar a população de vermes. Em seguida, incubar os ovos durante a noite em um frasco de vidro contendo 15 mililitros de meio S completo com agitação; no dia seguinte, dia cinco, os nematoides estarão no mesmo estágio de crescimento. Para determinar o número de vermes eclodidos, utilizando uma ponteira limpa cada vez, transferir três alíquotas de 100 microlitros de nematoides para tubos microcentrífugos separados contendo 900 microlitros de meio, suplementado com 0,01% de tween 20, pipetando para cima e para baixo algumas vezes para liberar quaisquer vermes aderidos à ponteira.Em seguida, conte os nematoides em quatro gotas separadas de 10 microlitros de cada um dos tubos de diluição em triplicata e calcule o volume da suspensão de nematoides necessário para preparar dois cultivos de 20 mililitros com 10 nematoides por 10 microlitros; decante volumes aproximados em dois tubos cónicos de 15 mililitros previamente pesados. Pese os tubos para determinar o volume exato dispensado. Em seguida, para ajustar os volumes-alvo, agite suavemente em vórtex e remova o excesso de volume.Agora, lave os nematódeos com um volume total de 14 mililitros de meio S completo fresco por tubo e re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio S completo com 30 gramas por litro de OP 50. Transfira os nematódeos para frascos cónicos de vidro contendo 15 mililitros de meio S completo com 30 gramas por litro de OP 50.Complete com OP 50 até um volume total de 20 mililitros por frasco e registre o horário da alimentação. Calcule a média do número de nematoides em nove gotas de 10 microlitros para confirmar que os cultivos foram diluídos a 10 nematoides por 10 microlitros. Coloque os cultivos no incubador por 42 a 44 horas.No sétimo dia, transfira as culturas de nematoides para um único frasco com agitação suave contínua. Em seguida, transfira três alíquotas de quatro mililitros de nematoides para um único recipiente estéril de 60 mililitros. Utilize uma pipeta de oito canais para distribuir, em um poço de 96, 25 microlitros de nematoides em suspensão por poço.Placas microtituladoras pretas com fundos planos e transparentes. Em seguida, recoloque as tampas nas placas e reserve-as. Cada vez que duas placas tiverem sido semeadas, transfira outros dois alíquotas de 2,5 mililitros de nematoides para o recipiente, a fim de repor o volume perdido.Após semear 13 a 14 placas com nematodos, adicione 74 microlitros de meio completo S a cada poço e transfira as placas para uma câmara úmida e para um incubador com agitação até a administração do fármaco, enquanto as placas estão sob agitação. Descongele 2 placas de solda de 96 poços contendo fármacos para teste. Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal e trocando as ponteiras a cada vez.Transfira um microlitro da primeira coluna da primeira placa de fármaco para as colunas um a cinco de uma placa de nematódeos. Transfira outro microlitro da segunda coluna da placa de fármaco para as colunas oito a 12 da placa de nematódeos. Em seguida, adicione um microlitro de veículo às colunas seis e sete da placa de nematódeos.Utilize as colunas restantes na placa de fármacos para tratar o restante das placas de nematódeos da mesma maneira, certificando-se de incluir também duas placas tratadas apenas com veículo. Em seguida, devolva todas as placas às câmaras úmidas no incubador com agitação por mais 20 a 22 horas no oitavo dia. Para preparar uma placa controle de fundo para leituras de fluorescência, combine o conteúdo dos poços de uma placa de nematódeos tratada apenas com veículo e deixe os nematódeos sedimentarem por dois a três minutos.Em seguida, colete as bactérias contendo snat e carregue amostras de 100 microlitros em cada poço de uma microplaca preta com fundo transparente. Observe a placa ao microscópio, anotando os poços nos quais os nematoides podem ser vistos, para permitir a exclusão desses poços da estimativa de fundo fluorescente. Em seguida, leia a fluorescência finalmente para medir a bioluminescência de cada placa.Em seguida, distribua 50 microlitros de tampão de luminescência recém-preparado para cada poço, coloque a placa em uma plataforma agitadora e inicie o cronômetro após três minutos. Leia a luminescência a uma taxa de um segundo por medição. Neste primeiro experimento representativo, rot, um inibidor do complexo mitocondrial um, reduziu a emissão de luz pelos nematoides após exposições tanto curtas quanto mais longas, em uma faixa de concentrações.Neste experimento, demonstrou-se que o herbicida paraquat reduz significativamente a fluorescência da GFP e a bioluminescência normalizada da linhagem C PE 2 54. Além disso, a diminuição da bioluminescência foi maior do que a da fluorescência, o que está de acordo com os efeitos conhecidos de diminuição da função mitocondrial e redução da produção de ATP induzidos pela droga. Este gráfico ilustra um exemplo de um composto que potencializa a bioluminescência do nematodo, o intermediário do ciclo ácido cítrico oxaloacetato, em uma única concentração de oito milimolares.Observe que a variabilidade experimental observada entre essas execuções replicadas não é incomum em experimentos baseados em Lucifer. Aqui, compostos inibidores da luciferase de Firefly foram observados afetar a atividade de luciferases in vitro em 25 micromolar e 100 micromolar, com uma atenuação quase completa da atividade pelo composto DDD. 1, 4 3 4, embora não diretamente comparável, uma diminuição significativa na bioluminescência foi observada após o tratamento com compostos inibidores de Lucifer também in vivo.Demonstrando que as alterações na bioluminescência podem resultar da ação de inibidores da enzima luciferase ao invés de mudanças nos níveis in vivo de ATP. Ao realizar este procedimento, é importante considerar que compostos podem afetar diretamente a atividade da enzima luciferase de vagalume, ao invés de afetar o estado energético do verme. Assim, as alterações podem ser validadas utilizando diversas técnicas para avaliação da função mitocondrial, como, por exemplo, a determinação do consumo de oxigênio, a determinação do potencial da membrana mitocondrial, a detecção de espécies reativas de oxigênio ou a visualização das mitocôndrias em linhagens de C. elegans.Com marcação GFP, mitocôndrias.

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