Name: Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a analisar perfis de expressão genética em C. elegans usando microarray e PCR em tempo real. Este método computacional permite identificar genes candidatos e validar dados com ferramentas bioinformáticas.

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Este trabalho foi realizado pelos alunos de graduação em Southwestern Oklahoma State University, OK Weatherford. Este trabalho foi financiado pela NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT e OCAST HR09-137S. O vsm1 (ok1468) mutantes foi isolado pelo Consórcio Knockout Gene Oklahoma. Os autores agradecem Dan Stefanovic e Tanner Wheeler por sua valiosa ajuda durante a execução do projeto.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo nós desenvolvemos um protocolo de utilização fácil, amigável que pode ser usado para perfis gene determinada expressão subjacente vários fenômenos biológicos. Neste protocolo, o RNA total foi isolado pela primeira vez e tratados com DNase I. Nosso método de isolamento de RNA foi drasticamente simplificada omitindo extrações fenol e utilizam resinas afinidade para limpar 5,6. Resumidamente, C. membranas elegans cutícula e células estavam rachados aberto por nematóides congelamento com nitrogênio líquido e moagem com resina molecular. Em seguida, o RNA extraído foi tratado com DNase I antes da síntese de cDNA. A etapa posterior foi adicionado para minimizar hibridizações inespecíficas; amostras de RNA contaminados com DNA genômico poderia introduzir interferências e produzem muitos falsos positivos. Em seguida, digite, selvagem e vsm-1 (ok1468) cDNAs mutantes foram marcados com Cy3 e Cy5 seqüências de captura e hibridizado em C. microarrays elegans obtidas através do programa GCAT. Este sistema é mais sensível do que produtos similares, e seu design de duas cores diminui o número de matrizes necessários, resultando em maior tempo e eficiência de custos 7,8. Além disso, este sistema não requer o equipamento especializado de outros sistemas similares, portanto, este procedimento poderia ser realizado em qualquer configuração padrão de laboratório 7. Terceiro, imagens fluorescentes série hibridizadas foram analisados ​​utilizando o software open source MAGICTool, e perfis de expressão gênica foram criados. MAGICTool é um programa fácil de usar que pode ser facilmente utilizado por indivíduos de todos os níveis de experiência, a partir da graduação ao pós-doutorado. No entanto, o desempenho ideal requer disponibilidade de memória de grande porte. Por último, genes candidatos obtidos pela análise microarray foram validados com PCR em tempo real. Embora a abordagem genômica é um método eficiente para o estudo de fenômenos biológicos, existem algumas limitações deve-se levar em consideração. Primeiro, apesar da especificidade deste protocolo de microarray, transcrições dentro de uma família são indistinguíveis uma da outra se o oligonucleotídeo impresso é retirado de sequências conservadas. PCR em tempo real compensa semelhanças dentro de uma família de genes e pode até mesmo distinguir entre isoformas específicas do mesmo gene. No entanto, com PCR em tempo real é um desafio para encontrar controles verdade que são expressos igualmente em todo tempo de vida de um organismo. Devido a isso, os resultados serão relativos. Uma abordagem proteômica é uma alternativa para a nossa técnica. Proteínas individuais podem ser isoladas por meio de eletroforese em gel 2D e identificado com espectrometria de massa. Nossos estudos mostram que especificamente muitos membros da família de proteínas do esperma Major (MSP) são induzidos em vsm-1 nematóides mutantes com maior densidade sináptica. MSPs são exclusivas para C. elegans e são responsáveis ​​pela maturação do oócito ea ovulação. Chai 1 tem demonstrado que a regulação do número e tamanho bouton pré-sináptica na junção neuromuscular em moscas de frutas é provável controlado por moléculas contendo domínios principal proteína do esperma. Estudos realizados por Tsuda e seus colegas demonstraram dois domínios principal proteína do esperma pode servir como ligantes para receptores Ephrine, desencadeando cascatas de sinalização do receptor tirosina quinase. Além disso, análise em tempo real PCR validados e reduzida resultados microarray para um membro da família msp, msp-32. Tomados em conjunto, o trabalho aqui apresentado representa uma análise do genoma de um dilema neurociência central, bem como o poder de iniciação científica no esforço científico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Catalogo </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Mais tarde RNA </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Resina Grinding Molecular </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNase Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel buffer Prep / Execução </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium marcador </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glioxal Amostra Loading Dye </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzima e Tampão de reacção de 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Matriz 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick Kit de Purificação PCR </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> DNA de esperma de salmão cortado </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS Solution </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> TDT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript Kit Síntese de cDNA </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determinar perfis de expressão genética em c. elegans usando microarray e pcr em tempo real

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Sinapses são compostos de uma zona de pré-sináptica ativa na sinalização celular e um terminal pós-sináptico na célula-alvo. No caso de sinapses químicas, as mensagens são transportadas por neurotransmissores liberados a partir de terminais pré-sinápticos e recebidos por receptores nas células pós-sináptica. Nossa pesquisa anterior, em Caenorhabditis elegans tem mostrado que VSM-1 regula negativamente exocitose. Além disso, a análise das sinapses no VSM-1 mostraram que os animais mutantes faltando um completamente funcional conectividade VSM-1 aumentaram sináptica. Com base nestes resultados preliminares, que a hipótese de que C. elegans VSM-1 pode desempenhar um papel crucial na sinaptogênese. Para testar essa hipótese, duplo-rotulados análise microarray foi realizada, e os perfis de expressão gênica foram determinados. Primeiro, RNA total foi isolado, transcritas reversamente para cDNA e hibridizadas à microarrays de DNA. Então, em silico-análise de hibridização da sonda fluorescente revelou indução significativa de muitos genes que codificam membros da família maiores de esperma proteína (MSP) em mutantes com a sinaptogênese reforçada. MSPs são o principal componente do esperma em C. elegans e aparecem para sinalizar a maturação do oócito ea ovulação nematóide. Em moscas de frutas, Chai e seus colegas demonstraram que uma MSP-como moléculas regulam número bouton pré-sináptico e tamanho na junção neuromuscular. Além disso, a análise realizada por Tsuda e colegas de trabalho sugeriu que dois MSPs podem atuar como ligantes para os receptores e desencadear Ef receptor tirosina quinase cascatas de sinalização. Por último, análise em tempo real PCR confirmaram que o gene que codifica para a MSP-32 é induzida em vsm-1 (ok1468) mutantes. Tomados em conjunto, a pesquisa realizada por nosso laboratório demonstraram que vsm-1 mutantes têm um aumento significativo na densidade sináptica, o que poderia ser mediada por MSP-32 sinalização.

Análise de microarrays foi conduzido para determinar perfis de expressão genética em<em&gt; C. elegans</em&gt; E PCR em tempo real foi utilizada para validar e quantificar os dados microarray.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

As sinapses são compostas por uma zona ativa pré-sináptica na célula sinalizadora e por um terminal pós-sináptico na célula-alvo. No caso das sinapses químicas, ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar os perfis de expressão gênica subjacentes a diversas fenótipos ou vias metabólicas. Isso é realizado primeiramente isolando o mRNA de duas linhagens contrastantes de nematoides. O segundo passo do procedimento consiste em sintetizar CD NA contendo sequências de captura S SI três ou SFI e hibridizá-las a um microarranjo.O terceiro passo do procedimento é hibridizar a matriz microarranjo com sequências antiligantes contendo S SI três e SCIFI fluoro quatro. O passo final do procedimento é escanear a matriz microarranjo e analisar os dados utilizando ferramentas bioinformáticas, como o software magic tool. Em última instância, os genes candidatos que mediam o fenômeno biológico sob investigação são identificados e podem ser validados e quantificados por técnicas alternativas, como a PCR em tempo real.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os nucleotídeos marcados não são visíveis ao usuário, tornando difícil sobrepor uma mistura homogênea de hibridização aos mais de 23.000 nucleotídeos impressos de forma exclusiva. Comece coletando RNA de nematoides saudáveis e sincronizados. Primeiro, eles são lavados e re-suspensos em tubos de 15 mililitros, e os pellets de vermes são re-suspensos em sete mililitros de cloreto de sódio 0,1 molar e sete mililitros de sacarose a 60% peso por volume, gelada.Após uma incubação de 15 minutos no gelo, os vermes são novamente centrifugados para formar o pellet. Agora, os vermes livres de bactérias sobrenadam, são coletados, lavados em água livre de RNAses e centrifugados novamente. Novamente, o pellet limpo e fracamente compactado é transferido para um tubo de microcentrífuga e centrifugado na velocidade máxima por 30 segundos.Aspirar e armazenar em 10 volumes de RNA later a quatro graus Celsius até o momento do uso. Para preparar amostras de RNA total, centrifugar os pellets preparados em velocidade máxima, descartar o sobrenadante e adicionar uma pitada de resina molecular de moagem ao pellet. Em seguida, congelar a mistura usando nitrogênio líquido com um pistilo.Triture a suspensão congelada de vermes em um pó fino, adicionando nitrogênio líquido conforme necessário para manter o pó frio após a trituração. Coloque o extrato no gelo por cinco minutos. Após cinco minutos, misture o extrato com 700 microlitros de R-L-T-B-M-E e 472 microlitros de etanol a 100% no total.O RNA agora pode ser isolado utilizando um kit comercialmente disponível, obtendo um volume final de 60 microlitros de RNA isolado por amostra biológica. Antes de prosseguir, remova possíveis contaminações por DNA genômico tratando com DNAS one, seguido pelo uso de um kit de purificação de RNA comercialmente disponível. Complete o procedimento do kit referindo-se a um volume de 60 microlitros.Por fim, determine a concentração de RNA e avalie a integridade do RNA mediante tratamento com carga da amostra de glioxal, corante e análise em gel antes da hibridização em microarranjo. O RNA purificado por métodos convencionais é transcrito reversamente em DNA complementar, que é purificado a partir do molde degradado com um kit comercialmente disponível e ajustado para um volume de 60 microlitros. Inicie a hibridização em microarranjo bloqueando a elegância marinha. Lâminas de microarranjo com DNA de esperma de salmão sonicado. Após uma hora, mergulhe as lâminas bloqueadas em água destilada duplamente e centrifugue.Seque as lâminas em tubos cónicos de 50 mililitros forrados com uma toalha de papel absorvente. Agora, prepare um tampão de hibridização à base de formamida 2x. Primeiro, aqueça-o a 55 graus Celsius durante 10 minutos para dissolver completamente seus cristais.Em seguida, centrifugue por um minuto a 10.000 ×g. Depois, misture 25 microlitros de CD NA com 25 microlitros de tampão de hibridização e agite suavemente a mistura. Agora, realize uma centrifugação rápida da mistura e incube-a a 80 graus Celsius por 10 minutos.Após a incubação, pipete cuidadosamente toda a amostra de cDNA sobre a lâmina de microarranjo sem tocar a lâmina. Para espalhar uniformemente a amostra sobre a lâmina de microarranjo, abaixe suavemente uma lamínula sobre a lâmina utilizando uma agulha de seringa; antes que a lamínula seja completamente abaixada, levante-a novamente e abaixe com a agulha, permitindo que a lamínula caia suavemente no lugar.Essa técnica minimiza a formação de bolhas de ar. Agora, posicione a lâmina horizontalmente em um tubo cônico de 50 mililitros abaixo da lâmina com 50 microlitros de água bidestilada e deixe incubando durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Uma segunda hibridização é realizada brevemente após a lavagem da lâmina.Várias vezes no SSC, o segundo tampão, que contém reagentes de captura sensíveis à luz e um reagente Antifa, é aplicado usando a mesma técnica, seguido por uma breve incubação, mais lavagens e secagem. A lâmina pode então ser escaneada. As imagens podem ser analisadas usando o software gratuito com a ferramenta aberta magic tool.Resumidamente, na guia projeto, crie e salve um novo projeto na guia criar perfil de expressão, selecione carregar par de imagens e escolha o arquivo de imagem vermelha como vermelho e o arquivo de imagem verde como verde. Em seguida, selecione a guia criar perfil de expressão. Escolha carregar lista de genes para enviar um arquivo de lista de genes de C. elegans obtido do site do GCAT para endereçar e alinhar a imagem da microarranjo.Selecione a guia perfil de expressão de construção e a opção criar grade de edição. Agora edite a grade. Configure a caixa de diálogo usando 48 para o número de grades, 22 linhas e 22 colunas para cada grade e escolhendo numerar os pontos da esquerda para a direita e de cima para baixo.Aumente a porcentagem de alteração de contraste e aproxime a imagem da grade até que os pontos individuais sejam facilmente distinguíveis. Crie as grades selecionando o ponto superior esquerdo definido no painel esquerdo e, em seguida, clicando no centro do ponto superior esquerdo, seguido pelo ponto superior direito e pela linha inferior na grade um. Repita este procedimento de gradeamento para cada uma das 48 grades, prosseguindo da esquerda para a direita e de cima para baixo.Em seguida, salve selecionando a guia arquivo e salve a grade atual como uma vez salva. Selecione a guia finalizada para eliminar quaisquer pontos não relacionados da análise. Abra a guia criar perfil de expressão e, na opção de endereçamento da grade, selecione sinalização de pontos.Agora marque quaisquer manchas de estria ou fluorescência de fundo e salve selecionando salvar marcadores atuais. Como na guia arquivo, os arquivos marcados devem ser segmentados. Por fim, analise os genes induzidos ou reprimidos por um fator especificado selecionando explorar na guia expressão.Na caixa de diálogo de exploração, defina os critérios de correspondência para os genes. O número de aumentos ou diminuições duplos na expressão. A intensidade é conhecida como x e o valor de X é o critério para a alteração da expressão.X é inserido com valor máximo maior que X para genes induzidos e valor mínimo menor que x para genes reprimidos. Neste experimento, é realizado um controle de troca de corante: duas isolamentos independentes de RNA total de larvas em estágio três e estágio quatro são hibridizados como mutante verde versus selvagem vermelho, enquanto mutante vermelho versus selvagem verde, para confirmar as alterações na expressão gênica. Faça três isolamentos independentes de RNA total utilizando o mesmo procedimento, sintetize cDNA com um kit comercialmente disponível e, para cada amostra de cDNA, realize PCR em tempo real em triplicata, utilizando três genes de referência como controles. Para demonstração, os seguintes resultados examinam a expressão gênica induzida em VSM um.Mutantes AK 1468 são uma linhagem de nematódeo caracterizada por sinapses aprimoradas; antes de realizar a análise por microarranjo, a qualidade do RNA extraído é verificada por eletroforese em gel. A presença de dois subunidades ribossômicas intactas antes e após o tratamento com RNase I é indicativa de uma boa amostra de RNA no microarranjo; o DNAc do tipo selvagem é marcado em vermelho e o DNAc do mutante VSM I é marcado em verde. Neste, um dos 48 grids analisados por microarranjo, cada quadrado pequeno representa um oligonucleotídeo impresso individualmente; em cada arranjo, cada oligonucleotídeo único é representado.Uma vez que a análise de microarranjo de transcritos isolados de larvas na fase quatro mostra que os genes que codificam as proteínas maiores de espermatozoides ou MSP são induzidos em mutantes VSM um, a análise de microarranjo de larvas na fase três também revela alterações na expressão dentro da mesma família gênica no mutante. Testes. As previsões provenientes do microarranjo por meio de análise de PCR em tempo real revelam que um membro da família gênica M ms P, MS P 32, é induzido nos mutantes VSM um. Os dados representam a média de três réplicas de PCR em tempo real a partir da mesma coleta de RNA.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar ferramentas bioinformáticas para análise em todo o genoma, especialmente considerando que existem muitos programas bioinformáticos de código aberto disponíveis para a comunidade científica.

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