Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é investigar perfis de expressão gênica subjacentes a vários fenótipos ou vias metabólicas. Isso é feito isolando primeiro o mRNA de duas cepas de nematóides contrastantes. A segunda etapa do procedimento é sintetizar o CD NA contendo sequências de captura S, SI três ou SFI e hibridizá-las em um microarray.

A terceira etapa do procedimento é hibridizar o microarray com sequências anti-captura contendo S SI três e SCIFI fluoro fours. A etapa final do procedimento é escanear o microarray e analisar os dados usando ferramentas de bioinformática, como o software Magic Tool. Em última análise, os genes candidatos que medeiam o fenômeno biológico sob investigação são identificados e podem ser validados e quantificados por técnicas alternativas, como PCR em tempo real.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os nucleotídeos manchados não são visíveis para o usuário, por isso é difícil sobrepor uma mistura de hibridização homogênea nos mais de 23.000. Nucleotídeos impressos exclusivamente Comece coletando RNA de nematóides sincronizados saudáveis. Primeiro, eles são lavados ressuspensos em tubos de 15 mililitros e pellets de minhoca peletizados são ressuspensos em sete mililitros de cloreto de sódio 0,1 molar e sete mililitros de gelado, 60% de peso por volume de sacarose.

Após uma incubação de 15 minutos no gelo, os vermes são peletizados novamente. Agora, os vermes livres de bactérias nadam, são coletados, lavados em RNAs, água livre e peletizados. Novamente, o pellet limpo e frouxamente compactado é transferido para um tubo de microcentrífuga girado na velocidade máxima por 30 segundos.

Aspirado e armazenado em 10 volumes de RNA posteriormente a quatro graus Celsius até que esteja pronto para prosseguir. Para preparar amostras totais de RNA, centrifugue os pellets preparados na velocidade máxima, descarte o supernat e adicione uma pitada de resina de moagem molecular ao pellet. Em seguida, congele a mistura usando nitrogênio líquido usando um pilão.

Moa a suspensão de minhoca congelada em um pó fino e nitrogênio líquido conforme necessário para manter o pó frio após a moagem. Coloque o extrato no gelo por cinco minutos. Após cinco minutos, misture o extrato com 700 microlitros de R-L-T-B-M-E e 472 microlitros de 100% de etanol total.

O RNA agora pode ser isolado usando um kit disponível comercialmente para um volume final de 60 microlitros de RNA isolado por amostra biológica. Antes de prosseguir, remova a contaminação potencial do DNA genômico tratando com DNAS um, seguido pelo uso de um kit de limpeza de RNA disponível comercialmente. Complete o kit aludindo a um volume de 60 microlitros.

Finalmente, determine a concentração de RNA e avalie a integridade do RNA por tratamento com carregamento de amostra de glioxal, análise de corante e gel antes da hibridização de microarray Usando métodos convencionais, o RNA purificado é transcrito revertido em DNA complementar, que é purificado do molde degradado com um kit disponível comercialmente e aludido a um volume de 60 microlitros. Comece a hibridização de microarray bloqueando a elegância do mar. Lâminas de microarray com DNA de esperma de salmão sonicado Após uma hora, despeje as lâminas bloqueadas em água destilada dupla e gire.

Seque as lâminas em tubos cônicos de 50 mililitros acolchoados com um lenço umedecido. Agora prepare um tampão de hibridização baseado em amida de duas formas x. Primeiro, aqueça-o a 55 graus Celsius por 10 minutos para dissolver completamente seus cristais.

Em seguida, centrifugar durante um minuto a 10 000 gs. Em seguida, misture 25 microlitros de CD NA com 25 microlitros de tampão de hibridização e agite a mistura suavemente. Agora faça uma rotação rápida da mistura e incube-a a 80 graus Celsius por 10 minutos.

Após a incubação, pipete cuidadosamente toda a amostra de CDNA na lâmina de microarray sem tocar na lâmina. Para espalhar uniformemente a amostra na lâmina de microarray. Abaixe suavemente uma lamínula na corrediça usando uma agulha de seringa antes que a lamínula esteja completamente abaixada, puxe para cima e abaixe novamente com a agulha, permitindo que a lamínula caia suavemente no lugar.

Esta técnica minimiza a formação de bolhas de ar. Agora coloque a lâmina horizontalmente em um tubo cônico de 50 mililitros abaixo da lâmina a 50 microlitros de água bidestilada e deixe-a incubar durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Uma segunda hibridização é realizada brevemente após a lavagem da lâmina.

Várias vezes no SSC, o segundo tampão, que contém reagentes de captura sensíveis à luz e um reagente Antifa, é aplicado usando a mesma técnica seguida de uma incubação curta, mais lavagens e secagem. O slide pode então ser digitalizado. As imagens podem ser analisadas usando o software livre com ferramenta mágica de código aberto.

Resumidamente, na guia do projeto, crie e salve um novo projeto na guia de perfil de expressão de build, selecione carregar par de imagens e selecione o arquivo de imagem vermelho como vermelho e o arquivo de imagem verde como verde. Em seguida, selecione a guia de perfil de expressão de compilação. Escolha a lista de genes de carga para fazer upload de um arquivo de lista de genes C elegance obtido no site do GCAT para endereçar e gradear a imagem do microarray.

Selecione a guia criar perfil de expressão e criar a opção de edição de grade. Agora edite a grade. Configure a caixa de diálogo usando 48 para o número de grades, 22 linhas e 22 colunas para cada grade e escolhendo numerar os pontos da esquerda para a direita e de cima para baixo.

Aumente a variação percentual de contraste e amplie a grade até que os pontos individuais sejam facilmente distinguíveis. Crie as grades selecionando definir ponto superior esquerdo no painel esquerdo e clicando no centro do ponto superior esquerdo, seguido pelo ponto superior direito e pela linha inferior na grade um. Repita este procedimento de grade para cada uma das 48 grades, prosseguindo da esquerda para a direita e de cima para baixo.

Em seguida, salve selecionando a guia do arquivo e salve a grade atual como uma vez salva. Selecione a guia concluída para eliminar quaisquer pontos não relacionados da análise. Abra a guia de perfil de expressão de build e, na opção de grade de endereçamento, selecione sinalização de ponto.

Agora sinalize quaisquer pontos de listras ou fluorescência de fundo e salve selecionando salvar sinalizadores atuais. Como na guia de arquivo, os arquivos sinalizados devem ser segmentados. Por fim, analise os genes induzidos ou reprimidos por um fator especificado, selecionando explorar na guia de expressão.

Na caixa de diálogo de exploração, defina os critérios de correspondência de genes finos. O número de aumentos ou diminuições duplas na expressão. A intensidade é conhecida como x e o valor de X é o critério para a mudança de expressão.

X é a entrada abaixo do valor máximo maior que X para genes induzidos e valor mínimo menor que x para genes reprimidos. Neste experimento, um controle de troca de corante é realizado nos dois isolamentos independentes de RNA total das larvas do estágio três e do estágio quatro são hibridizados como mutante verde versus tipo selvagem vermelho, enquanto mutante vermelho versus tipo selvagem verde para confirmar as alterações na expressão gênica fazem três isolamentos independentes de RNA total usando o mesmo procedimento sintetizar CDNA com um kit disponível comercialmente, e para cada amostra de CD NA realizar PCR em tempo real e triplicar usando três genes de manutenção como controles. Para demonstração, os resultados a seguir examinam a expressão gênica induzida no VSM um.

Mutantes AK 1468 uma cepa de nematóide caracterizada por sináptica aprimorada Antes de realizar a análise de microarray, a qualidade do RNA extraído é verificada usando eletroforese em gel. A presença de duas subunidades ribossômicas intactas antes e depois do tratamento com dase one é indicativa de uma boa amostra de RNA no microarray CDNA do tipo selvagem é rotulado em vermelho e VSM um CD NA mutante é rotulado em verde. Nesta das 48 grades analisadas por microarray, cada pequeno quadrado representa um único oligonucleotídeo impresso em cada array, cada oligonucleotídeo único é representado.

Uma vez que a análise de microarray de transcritos isolados de larvas de estágio quatro mostra que os genes que codificam as principais proteínas de esperma ou MSP são induzidos em mutantes VSM um, a análise de microarray de larvas de estágio três também revela mudanças de expressão dentro da mesma família de genes no mutante. Teste. As previsões do microarray por análise de PCR em tempo real revelam que um membro da família de genes M ms P MS 32 é induzido no VSM um mutante. Os dados representam a média de três réplicas de PCR em tempo real da mesma coleção de RNA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como lidar com ferramentas de bioinformática para análise de todo o genoma, especialmente considerando que existem muitos programas de software de bioinformática de código aberto disponíveis para a comunidade científica.