RT-PCR quantitativo de alta produtividade em amostras de elegans C. single e bulk usando tecnologia nanofluidica

Nosso protocolo melhorou a eficiência do rendimento e do tempo para obter dados de RT-qPCR diretamente de amostras únicas ou pequenas amostras sem a necessidade de isolamento de RNA. Usando este protocolo, mais de 9.000 resultados de RT-qPCR podem ser obtidos em apenas dois dias de trabalho de bancada, um processo que normalmente levaria cerca de cinco semanas usando qPCR padrão de 96 poços. Este protocolo fornece um ensaio RT-qPCR mais rápido, robusto e altamente sensível em C. elegans, ideal para monitorar a variabilidade interindividual na expressão gênica entre vermes isogênicos.

Comece pegando os vermes de seu gramado de bactérias em uma placa de meio de crescimento de nematóides sem sementes fresca e permitindo que os vermes se movam ao redor do prato por cinco minutos. Enquanto os vermes estão se aclimatando, em uma capa sem RNase, misture 10 microlitros de tampão de lise com um a 100 Dnase I por amostra e coloque a tampa de uma tira de PCR de cabeça para baixo na plataforma de um escopo de dissecação. Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura de lise às tampas dos tubos de PCR abobadados e retire os vermes da placa para evitar a transferência de bactérias para cada slot da tampa.

Quando todos os vermes tiverem sido transferidos, feche as tampas e gire os tubos por cinco segundos antes de colocá-los em um frasco Dewar de nitrogênio líquido. Após os últimos cinco segundos, descongele os tubos em banho-maria a 40 graus Celsius antes de repetir o procedimento de congelamento/descongelamento mais nove vezes. Após o último ciclo de congelamento/descongelamento, misture as amostras lisadas em um misturador térmico por 20 a 30 minutos a quatro graus Celsius e aproximadamente 1800 rotações por minuto.

No final da incubação de mistura, gire as amostras conforme demonstrado e adicione um microlitro de solução de parada recém-descongelada a cada tubo. Para a transcrição reversa de amostras quentes a granel, em uma coifa livre de RNase, prepare uma mistura mestre de tampão enzimático e adicione 14 microlitros de mistura principal a 11 microlitros de cada amostra. Passe as amostras por um termociclador usando o programa de transcrição reversa indicado e dilua o produto de cDNA resultante em uma proporção de um para quatro em água livre de nuclease.

Para pré-amplificação específica do alvo, adicione 3,75 microlitros de master mix de pré-amplificação em um poço por amostra em uma placa de 96 poços e adicione 1,25 microlitros de cada solução de cDNA a cada poço de master mix. Quando todas as amostras tiverem sido carregadas, cubra a placa com fita de vedação e faça um breve vórtice das amostras antes de girá-las por centrifugação, depois carregue a placa em um termociclador e execute o programa conforme indicado. Para remover os primers não incorporados da pré-amplificação, no final do termociclo, centrifugue a placa de amostra e remova cuidadosamente o selo.

Adicione dois microlitros de mistura mestre de exonuclease I a cada reação de pré-amplificação e feche novamente, centrifugue e carregue a placa de volta no termociclador. No final do ciclo, diluir as amostras com 18 microlitros de tampão Tris-EDTA. Para configurar um chip multi-array, adicione 3,6 microlitros de master mix de carregamento de ensaio e 0,4 microlitros de primer reverso direto de 50 micromolares em um poço por amostra em uma placa de 384 poços.

Em seguida, adicione 2,2 microlitros de mistura mestre de amostra e 1,8 microlitros de cada amostra pré-amplificada de exonuclease tratada I aos poços apropriados da placa. Para configurar um chip de matriz única, adicione 5,4 microlitros da mistura mestre de carregamento do ensaio e 0,6 microlitros do primer reverso direto a um poço por amostra de uma segunda placa de 384 poços e, em seguida, adicione 3,3 microlitros de mistura mestre de amostra e 2,7 microlitros de cada amostra pré-amplificada que tratei de exonuclease aos poços apropriados da placa de matriz única preparada. Para preparar o chip nanofluídico para a primeira execução, segurando o chip em um ângulo de 45 graus lenta e cuidadosamente injete 150 microlitros de fluido da linha de controle nos acumuladores do chip.

Quando todo o fluido tiver sido carregado, remova a película protetora azul da parte inferior do chip e coloque o chip na máquina de preparação de PCR nanofluídica com o código de barras voltado para fora. Em seguida, execute o script Prime(153x). Após o primer, coloque o chip em uma superfície escura e, à medida que cada ensaio ou mistura de amostra é carregado, remova os plugues de barreira correspondentes, se necessário, e adicione o volume apropriado de ensaio ou mistura de amostra às entradas correspondentes do chip nanofluídico de acordo com o plano experimental.

Após o carregamento, coloque o chip no termociclador nanofluídico e execute o protocolo apropriado no software de coleta de dados. Se todo o chip de várias matrizes não for usado, execute uma execução pós-script para permitir o uso downstream das matrizes de chips restantes. Para testar se o protocolo worm-to-Ct é um método válido de extração de cDNA, o método foi comparado aos métodos padrão de extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanídio.

Globalmente, os níveis de expressão de mRNA hsp-70 por 100 nanogramas de RNA total foram comparáveis usando os métodos de fenol-clorofórmio e worm-to-Ct. No entanto, nos casos de maior expressão de hsp-70, a expressão foi maior com o método worm-to-Ct, indicando uma sensibilidade melhorada. Para a extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanídio de amostras a granel, o hsp-70 diminuiu 82,7 nos mutantes hsf-1 em comparação com os controles e em 92,3% para o warm-to-Ct, indicando que a diminuição foi comparável entre os dois métodos.

Usando cDNA obtido de amostras a granel de 25 vermes ou de uma média de 36 amostras de vermes únicos, os métodos detectaram níveis de expressão comparáveis para todas as chaperonas testadas, indicando que os parâmetros obtidos de vermes únicos são confiáveis. Aqui, a expressão média de vários transcritos de hsp de vermes únicos após um curto choque térmico é mostrada. Como observado, a variabilidade na expressão dos transcritos difere drasticamente entre os diferentes genes.

Para cada transcrito testado usando amostras de vermes únicos, os coeficientes técnicos de variabilidade foram menores do que os coeficientes biológicos de variabilidade, indicando que triplicatas técnicos não foram necessários para a estimativa dos parâmetros quando a qPCR foi realizada em vermes únicos. Ao executar este protocolo, é essencial pipetar pequenos volumes com precisão e não pipetar reverter no chip nanofluídico. Este protocolo pode ser usado para obter grandes conjuntos de dados RT-qPCR, que podem ser exportados e processados conforme desejado usando scripts Excel ou R.