Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que podem ser usados para marcar macromoléculas biológicas. Isso é feito misturando primeiro o material de partida do metal e o ligante enquanto controla o pH da solução. A segunda etapa do procedimento é purificar o complexo resultante usando diálise.

Em seguida, a ausência de metal livre precisa ser verificada. A etapa final do procedimento é a caracterização das propriedades do complexo que são relevantes para a imagem. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que os complexos sintetizados se comportarão como agentes de contraste por meio de medições de atividade de relaxamento.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imagem, como se o número de coordenação da água de um agente de contraste muda ao se ligar a uma proteína. Geralmente, os indivíduos que precisam desse método terão dificuldades porque o controle cuidadoso do pH resultará em tornar o LI e inútil para a educação biológica. Demonstrando as medições de diálise e atividade estarão Buda e Sashi.

Alunos de pós-graduação do meu laboratório Para iniciar a metação usando sais de lantanídeos, primeiro dissolva um equivalente de ligante em água para produzir uma solução milimolar de 30 a 265 milimolares. O ligante Paraiso Benzyl DTPA é usado aqui em uma concentração de 73 milimolar. Em seguida, ajuste o pH da solução ligante entre 5,5 e sete, adicionando um hidróxido de amônio molar.

Neste vídeo, 0,2 mililitros da solução de hidróxido de amônio de um molar são usados agora para dissolver um a dois equivalentes de cloreto de lantanídeo em água para produzir uma solução com uma concentração de cinco a 1000 milimolares. Tanto o cloreto de euro quanto o cloreto de gadolínio podem ser usados em concentrações de 111 milimolares. Muitas vezes, um excesso de metal é usado para levar a ventilação até a conclusão e, consequentemente, simplificar a purificação.

Em seguida, adicione cada solução de sais de lathan à solução preparada de ligante enquanto mexe. Agora ajuste o pH das misturas de reação resultantes entre 5,5 e sete, adicionando hidróxido de amônio 0,2 molar. Aqui, um total de 0,5 mililitros da solução de hidróxido de amônio 0,2 molar é usado para ajustar a solução.

Se o ligante que está sendo usado contiver grupos funcionais sensíveis a ácidos, ajuste o pH várias vezes durante esta etapa. Certifique-se de ter cuidado ao ajustar o pH, pois se a solução se tornar muito básica, quaisquer grupos funcionais sensíveis à base, como o isotiocianato, ficarão inutilizáveis. Para conjugação, monitore de perto a reação por meio de medições de pH.

A reação é completa quando o pH permanece constante Para ligantes sem grupos funcionais sensíveis à base, uma investigação que envolve o aumento do pH também pode ser útil. Para iniciar a investigação de diálise, determine um comprimento apropriado de tubo de diálise para manter o volume da amostra mais o comprimento extra para conter 10% adicionais do volume da amostra. Em seguida, siga as diretrizes do fabricante para cortar a tubulação nesse comprimento.

Neste vídeo, uma membrana de corte de peso molecular de 100 a 500 Dalton foi usada, mas um tubo de corte de peso molecular maior pode ser usado conforme apropriado se a conjugação for realizada antes da medição, se apropriado, com base nas diretrizes do fabricante, mergulhe o tubo de diálise cortado e regue por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, encha um reservatório de diálise com água, que servirá como dialisato. Um copo de um litro é usado aqui.

O volume do dialisato deve ser aproximadamente 100 vezes maior que o da amostra. Agora dobre uma extremidade do tubo duas vezes e prenda a parte dobrada com o fecho de diálise clamp. Enrole a extremidade do fechamento com um elástico para garantir que ele permaneça fechado durante a diálise.

Filtre a mistura de reação previamente preparada através de um filtro de 0,2 mícron. Em seguida, carregue o filtrado na extremidade aberta do tubo. Tomando cuidado para não rasgar o tubo.

Certifique-se de deixar espaço suficiente para fechar a tubulação. Dobre a extremidade aberta restante do tubo duas vezes, prenda-a com uma tampa e enrole a tampa com um elástico. Em seguida, prenda um frasco de vidro contendo ar ao grampo em uma extremidade do tubo de diálise usando outro elástico.

Em seguida, coloque um frasco contendo areia na outra pinça. Esses frascos garantem que o tubo permaneça imerso no dialisato. Agora, coloque a tubulação completa no reservatório de diálise que contém dialisado.

Agite o dialisado usando uma placa de agitação magnética em velocidade lenta à temperatura ambiente. Certifique-se de que a velocidade de agitação permaneça lenta e a solução não. Vórtice. Troque o dialado três vezes ao longo de um dia.

Neste vídeo, o dialado é alterado em 2,5, 6,5 e 11,5 horas. Permita que a diálise continue durante a noite por um total de 20 a 28 horas. Quando a diálise estiver concluída, remova o tubo do dialado e abra cuidadosamente um fechamento para remover a amostra.

Lave o tubo de diálise três vezes com água e combine as lavagens com a amostra. Finalmente, remova a água da amostra sob pressão reduzida aqui. Isso é feito por liofilização.

A amostra é congelada e depois colocada em um aparelho de liofilização. Para avaliar a presença de metal livre na amostra, primeiro prepare o tampão de acetato dissolvendo 1,4 mililitros de ácido acético em 400 mililitros de água e ajuste o pH para 5,8 com um hidróxido de amônio molar e adicione água para produzir um volume total de 500 mililitros. Em seguida, dissolva 0,3 miligramas de cada complexo em 0,3 mililitros de tampão.

Agora prepare o indicador laranja xol, que deve ser 16 micromolar no tampão de pH 5,8. Adicione três mililitros desta solução indicadora aos complexos metálicos previamente dissolvidos. Detecte a presença de metal livre através da observação de uma mudança de cor do indicador de amarelo para violeta.

Se desejado, a quantidade de metal livre pode ser quantificada criando uma curva de calibração. Se houver metal livre, a amostra deve ser purificada por diálise ou cromatografia líquida de alta resolução antes da caracterização. Em seguida, para determinar o número de coordenação da água para uma amostra de ópio, prepare uma solução de cerca de um milimolar do complexo contendo ópio em água e, em seguida, outra solução da mesma concentração em óxido de deutério.

Antes da análise, a solução de óxido de deutério deve ser evaporada e dissolvida em óxido de deutério três vezes para remover a água residual, ligar o espectrofluorímetro, adicionar a solução aquosa a um espectrofluorímetro limpo e colocar o veterinário no espectrofluorímetro. Agora execute excitação e emissões para determinar os máximos para cada um em aproximadamente 395 nanômetros, 595 nanômetros, respectivamente. Em seguida, execute um experimento de decaimento do tempo de fosforescência usando os comprimentos de onda de excitação e emissão que acabamos de determinar e os parâmetros exibidos aqui.

Repita esta etapa com uma solução preparada de óxido de deutério a partir do gráfico de dados de decaimento de luminescência recém-obtidos, o log natural de intensidade versus tempo. A inclinação dessas linhas são as taxas de decaimento. Neste vídeo, o Microsoft Excel 2007 foi usado para gerar os gráficos de log natural a partir dos dados brutos.

Use as taxas de decaimento na equação desenvolvida por hors e colegas de trabalho vistos aqui. Se o seu ligante contiver grupos OH ou NH coordenados ao metal, a equação deve ser modificada antes do uso. Para determinar primeiro as medições da relatividade da amostra, selecione o modo de aplicação desejado no analisador de tempo de relaxamento, T um ou T dois.

Aqui, a configuração T um é selecionada. Em seguida, prepare uma série de amostras que contenham diferentes concentrações do complexo contendo lantanídeos em um solvente aquiescente. Aqui, a água é usada como solvente e soluções de dez cinco, dois, 0,5, 1,25, 0,625 e zero.

Millimolar são preparados. Outros solventes ou tampões aquiescentes podem ser usados, mas é importante usar o solvente como branco. O volume final da amostra é específico para o instrumento que está sendo usado.

Coloque uma amostra no instrumento e deixe-a descansar por cinco minutos para equilibrar a temperatura do instrumento, que é de 37 graus Celsius para a unidade usada neste vídeo. Agora determine o tempo de relaxamento em unidades de segundos ajustando os parâmetros do software para obter uma curva exponencial suave para T um ou T dois. Repita isso para todas as amostras, incluindo o branco.

Agora, calcule o inverso dos valores de relaxamento medidos de T um ou T dois e plote. Esses valores versus concentração de Lathan e unidades de milimolar se ajustam ao gráfico com uma linha reta. A inclinação da linha ajustada é a atividade de relaxamento sendo R um ou R dois para T um e T dois, respectivamente.

Aqui vemos o esquema geral de mediação e purificação. Este esquema descreve o procedimento geral de metação e as razões para a escolha de diferentes raízes de purificação. Aqui vemos um gráfico de decaimento de luminescência representativo no qual o log natural de decaimento é plotado em função do tempo, as inclinações das linhas geradas a partir de curvas semelhantes necessárias para soluções de água e óxido de deutério são usadas com a equação um para determinar o número de coordenação da água de complexos contendo ópio.

Um exemplo representativo de medições de liquidez pode ser visto aqui com uma inclinação da linha ajustada sendo a lividade T um da amostra. Além do número de coordenação da água e da caracterização da vida descritos no protocolo, também é importante caracterizar os produtos finais usando técnicas químicas padrão. A identidade do composto pode ser obtida usando espectrometria de massa espectros de massa representativos, mostrando que os padrões de isótopos diagnósticos para complexos contendo gadolínio e ópio são mostrados aqui.

Após este procedimento, outros métodos como espectroscopia endr HPLC e análise elementar podem ser realizados para caracterizar ainda mais os complexos resultantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que podem ser usados para marcar macromoléculas biológicas.