Name: Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a sintetizar, purificar e caracterizar complexos de lantanídeos para marcação de macromoléculas biológicas. Este método utiliza diálise e medidas de relaxometria para obter agentes de contraste para ressonância magnética.

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Agradecemos fundos de inicialização de Wayne State University (MJA), uma bolsa da Fundação Americana para Aging Research (SMV), e um Caminho para a Independência Award Transição de Carreira (R00EB007129) do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia do Instituto Nacional da Saúde (MJA).

1. Metalation usando LnCl três sais <ol><li> Dissolver o ligante na água para produzir uma solução de 30-265 mM. O ligante 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-ácido dietileno pentaacetic (p-SCN Bn-DTPA) foi usado neste vídeo a uma concentração de 73 mM. </li><li> Ajustar o pH da solução do ligante para entre 5,5 e 7,0 pela adição de 1 M NH 4 OH. Neste vídeo, 0,2 mL de NH M 1 4 OH solução foi usado. </li><li> Dissolver 02/01 equivalentes de LnCl 3 em água para produzir uma solução com uma concentração de 5000-1000 mM. Neste vídeo, EuCl 3 e GdCl 3 foram usados ​​em concentrações de 111 mM. Um excesso de metal é usado frequentemente para conduzir o metalation até a conclusão e, consequentemente, simplificar a purificação. </li><li> Adicionar a solução de LnCl 3 para a solução de ligante, agitando. </li><li> Após a adição de LnCl 3, ajustar o pH da mistura de reação resultante para entre 5,5 e 7,0 pela adição de 0,2 M NH 4 OH. Um total de 0,5 mL de NH 4 M 0,2 solução de OH foi usado neste vídeo. Se o seu ligante contém ácido-sensíveis grupos funcionais, ajustar o pH várias vezes durante esta etapa. ATENÇÃO - Se a solução torna-se demasiado básica, qualquer base sensível grupos funcionais, como o isotiocianato, serão inutilizados para a conjugação. </li><li> Monitorar a reação via medições de pH. A reação é completa quando o pH se mantém constante. </li></ol> 2. Workup pH Raising (não incluído neste vídeo, mas bom para ligantes sem base sensível grupos funcionais) <ol><li> Adicionar concentrada NH 4 OH à mistura de reação para ajustar o pH a ≥ 11. Esta etapa irá precipitar os metais não complexada como o hidróxido insolúvel. </li><li> Filtrar o sobrenadante através de um filtro M 0,2. Se a mistura de reação entope o filtro, centrifugação e decantação antes de filtragem é recomendado. </li><li> Se a diálise não será realizada, remover solvente sob pressão reduzida (evaporação rotativa ou liofilização é recomendado). </li><li> 2,1-2,3 passos podem ser repetidos se lantanídeos livre permanece. </li></ol> 3. Diálise workup <ol><li> Corte o tubo de diálise com um comprimento adequado (siga as orientações do fabricante) para manter o volume de amostra, deixando comprimento extra (aproximadamente 10% do volume da amostra). Neste vídeo, um 100-500 dalton de peso molecular de corte de membrana (MWCO) foi usado, mas maiores tubos MWCO pode ser usado como apropriado se conjugação é realizada antes da metalation. Além disso, cassetes de diálise pode ser usado como uma alternativa ao tubo de diálise, se desejar. </li><li> Se for o caso com base em orientações do fabricante, mergulhe o tubo de diálise corte em água por 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Encher um reservatório de diálise (um copo de L 1 foi usado neste vídeo) com água (efluente). O volume de dialisato deve ser de aproximadamente 100 vezes a da amostra. </li><li> Uma extremidade do tubo vezes duas vezes e garantir a porção dobrada do tubo com uma pinça de fechamento de diálise. Enrole a ponta do encerramento com um elástico para garantir que ele permanece fechado durante a diálise. </li><li> Filtrar a mistura de reação através de um filtro 0,2 m, e carregar o filtrado para a extremidade aberta do tubo com cuidado para não rasgar o tubo. Certifique-se de deixar espaço de cabeça o suficiente para fechar a tubulação. </li><li> Dobre a outra extremidade aberta do tubo de duas vezes, segura com um fechamento, e enrole o fechamento com um elástico como no passo 3.4. </li><li> Anexar um frasco de vidro contendo ar, ao grampo em uma extremidade do tubo de diálise utilizando um elástico. Anexar um frasco contendo areia para a braçadeira outros. Esses frascos garantir que a tubulação fica imerso no dialisado. </li><li> Coloque a tubulação cheia no reservatório de diálise que contém dialisado. </li><li> Agitar o dialisado usando uma placa de agitação magnética a uma velocidade lenta (sem vórtice) à temperatura ambiente. </li><li> Alterar o dialisato 3x ao longo de um dia (neste vídeo, o dialisato foi alterada de 2,5, 6,5 e 11,5 h), e então permitir que a diálise para continuar durante a noite (para um total de 20-28 h de diálise). </li><li> Remova o tubo de diálise do dialisato e abra cuidadosamente um fechamento para remover a amostra. Lave o tubo de diálise 3x com água e combinam as lavagens com a amostra. </li><li> Retire a água sob pressão reduzida. Liofilização é usada neste vídeo. </li></ol> 4. Avaliação da presença de metal livre <ol><li> Dissolver o complexo de metal em tampão acetato (preparação buffer: Dissolver 1,4 mL de ácido acético em 400 mL de água, ajustar o pH para 5,8 com 1 M NH 4 OH, e acrescentar água para produzir um volume total de 500 mL) e adicione o xilenol indicador de laranja (16 mM em tampão pH 5,8). Neste vídeo, 0,3 mg do complexo foi dissolvida em 0,3 mL de tampão e 3 mL da solução do indicador foi adicionado. </li><li>Detectar a presença de metal livre através de observação de uma mudança de cor do indicador de amarelo para violeta. </li><li> Se desejar, a quantidade de metal livre pode ser quantificado através da criação de uma curva de calibração 1. Alternativamente, o corante arsenazo III pode ser usado em vez de xilenol laranja 2. Se o metal livre permanece, a amostra deve ser purificado utilizando diálise, uma coluna de dessalinização, ou cromatografia líquida (HPLC), antes da caracterização. </li></ol> 5. Determinação de água coordenação-número (q) <ol><li> Prepare uma solução para o Eu-III contendo complexo (~ 1 mm), em H 2 O e outra solução de mesma concentração em D 2 O. Antes da análise, a solução de D 2 O deve ser evaporada e dissolvida em D 2 O três vezes para remover residual H 2 O. </li><li> Adicionar a solução de água para uma cuvete limpa, e coloque a cubeta em um espectrofluorímetro. </li><li> Realizar exames de excitação e emissão para determinar os máximos para cada (~ 395 nm e ~ 595 nm, respectivamente). </li><li> Realizar um experimento de tempo de decaimento-fosforescência usando os seguintes parâmetros: excitação e emissão de comprimentos de onda determinado a partir do passo 5.3, de excitação e de emissão larguras de fenda (5 nm), flash count (100), atraso inicial (0,01 ms), prazo máximo (13 ms) e incremento de atraso (0,1 ms). Estas condições são apropriadas para a maioria dos complexos, mas o atraso máximo e os valores de incremento pode ser aumentada ou diminuída para espécies com tempos de decaimento muito longo ou muito curto. </li><li> Repita o passo 5,4 com a solução D O 2 preparada no passo 5.1. </li><li> A partir dos dados de luminescência de decaimento obtida em 5.4 e 5.5, o enredo do log natural de intensidade versus tempo. A inclinação dessas linhas são as taxas de decaimento (τ -1) (Figura 2). Neste vídeo, Microsoft Excel 2007 foi utilizado para gerar os gráficos log natural a partir dos dados brutos. Use as taxas de atenuação na equação desenvolvida por Horrocks e colegas de trabalho (eq 1) 3. Se o seu ligante contém OH ou NH grupos coordenados ao metal, então a equação deve ser modificada antes de utilizar 3. </li></ol> eq 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Equação 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"> 6. Medições de relaxação <ol><li> Selecione o modo de aplicação desejada no analisador tempo de relaxamento: T 1 (tempo de relaxamento longitudinal) ou T 2 (tempo de relaxamento transversal). </li><li> Preparar uma série de amostras que contêm diferentes concentrações de D-us III contendo complexos em um solvente aquoso. Neste vídeo, a água era utilizada como solvente e soluções de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 e 0 mM foram preparadas. Outros solventes aquosos ou buffers poderia ser usado, mas é importante usar o solvente como o branco. O volume final da amostra é específico para o instrumento que está sendo usado. </li><li> Colocar a amostra no instrumento e deixe descansar por 5 min para equilibrar a temperatura do instrumento (37 ° C neste vídeo). </li><li> Determinar o tempo de relaxamento (em unidades de s), ajustando os parâmetros do software para obter uma curva suave exponencial para T 1 ou T 2 (curvas representativas para T 1 e T 2 são mostrados na Figura 3). </li><li> Repita os passos 6.3 e 6.4 para todas as amostras, incluindo o espaço em branco. </li><li> Calcule o inverso da medida T 1 ou T 2 valores em unidades de s -1. </li><li> Plotar a T 1 -1 ou T 2 -1 contra D'us valores de concentração III (em unidades de mM). Devido à natureza de D'us III higroscópico contendo complexos, confirmar a concentração de D-us III usando espectrofotometria de absorção atômica ou indutivamente acoplado a espectrometria de massa de plasma. Fit a trama com uma linha reta. Uma parcela representativa é mostrado na Figura 4. </li><li> A inclinação da linha ajustada é a relaxação (r 1 ou r 2 para T 1 e T 2, respectivamente) e tem unidades de mM -1 s -1. </li></ol> 7. Resultados representante Dados representativos para as etapas deste protocolo foram incluídos na seção de tabelas e figuras. Além de o número de coordenação de água e caracterização relaxação descrito no protocolo, é importante para caracterizar produtos finais utilizando técnicas químicas padrão. A identidade do composto pode ser obtido por espectrometria de massa, e espectros de massa representante mostrando os padrões de isótopos de diagnóstico para D'us III - Eu e III contendo complexos são mostrados na Figura 5. Além disso, para não-Gd III <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Esquema geral para metalation e purificação:. Esquema representando o procedimento geral para metalation e razões para escolher rotas diferentes de purificação. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Luminescência intensidade parcela:. Enredo Representante do log natural de intensidade versus tempo da seção 5. As inclinações das linhas geradas a partir de curvas similares adquiridos para água e soluções de D 2 O são usados ​​com um eq para caracterizar o número de coordenação de água Eu III contendo complexos. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 curvas de relaxamento deterioração do tempo:. Dados Representante para (esquerda) e T 1 (direita) T 2 de aquisição. Desvios relativamente a estas formas de curva seria produzir dados confiáveis. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 determinação relaxação:. A parcela representativa de 1 / T 1 versus a concentração de D-us III. A inclinação da linha é equipada relaxação e tem unidades de mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5 espectros de massa:. Espectros Representante em massa, mostrando os padrões de isótopos de diagnóstico para (esquerda) Gd III contendo complexos e (direita) Eu III contendo complexos. Os picos preto Gaussian representam a distribuição dos isótopos teóricos e as linhas vermelhas são os dados reais.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado o número crescente de publicações que incluem agentes de contraste à base de lantanídeos 14/04, é importante que seja tomado cuidado na preparação, purificação e caracterização de produtos para garantir resultados reprodutíveis e comparáveis. Estes complexos são muitas vezes considerados desafiadores para purificar e caracterizar moléculas orgânicas em relação ao devido à sua natureza paramagnética ea sensibilidade de qualquer grupo funcional que pode ser usado para bioconjugation. Nós descrevemos método...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagentes e Equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203254-5G </td></tr><tr><td> p SCN-Bn-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> hidróxido de amônio </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Celulose Ester (CE) Membrana de Diálise - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG Unidades Filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xilenol laranja tetrasodium sal </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> depurador de água </td><td> ELGA </td><td> PURELAB Ultra </td></tr><tr><td> cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analisador de tempo de relaxamento </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro UV-vis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> liofilizador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> medidor de pH </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> espectrofluorímetro </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Versão Calculadora Peso Molecular 6,46 por Matthew Monroe, baixado 17 out, 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculadora de Peso Molecular </td></tr></tbody></table>

purificação de preparação, e caracterização de complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para imagem por ressonância magnética

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate baseado ligantes são comumente usados ​​para quelar íons lantanídeos, e os complexos resultantes são úteis como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI). Muitos ligantes disponíveis comercialmente são especialmente úteis porque contêm grupos funcionais que permitem rápido, de alta pureza e alto rendimento conjugação de macromoléculas e biomoléculas através de amina-reativo ésteres ativados e grupos isotiocianato ou tiol-reativa Maleimidas. Enquanto metalation desses ligantes é considerada o conhecimento comum no campo da química bioconjugation, diferenças sutis em procedimentos metalation devem ser levados em consideração na seleção de materiais metálicos de partida. Além disso, várias opções para a purificação e caracterização de existir, e seleção do procedimento mais eficaz depende em parte da seleção de matérias-primas. Essas diferenças sutis são muitas vezes negligenciados nos protocolos publicados. Aqui, nosso objetivo é demonstrar os métodos comuns para metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos que podem ser usados ​​como agentes de contraste para ressonância magnética (Figura 1). Esperamos que esta publicação irá permitir que os cientistas biomédicos para incorporar as reações de complexação lantanídeos em seu repertório de reações comumente utilizados, facilitando a seleção de matérias-primas e métodos de purificação.

Demonstramos a metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos. Os complexos descrito aqui pode ser conjugado com macromoléculas para habilitar o rastreamento destas moléculas usando ressonância magnética.

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

Ligantes baseados em poliaminopolicarboxilatos são comumente usados para quelar íons lantanídeos, e os complexos resultantes são úteis como agentes de contraste para...

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que possam ser utilizados para marcar macromoléculas biológicas. Isso é realizado primeiramente misturando o material metálico inicial e o ligante, controlando ao mesmo tempo o pH da solução. O segundo passo do procedimento consiste em purificar o complexo resultante utilizando diálise.Em seguida, é necessário verificar a ausência de metal livre. O passo final do procedimento é a caracterização das propriedades do complexo relevantes para a imagem. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram que os complexos sintetizados atuarão como agentes de contraste por meio de medições de atividade de relaxação.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imagem, como se o número de coordenação da água de um agente de contraste muda ao se ligar a uma proteína. Geralmente, indivíduos que necessitam deste método enfrentarão dificuldades, pois não controlar cuidadosamente o pH tornará o LI inútil para a educação em biociências. A demonstração das medidas de diálise e atividade será realizada por Buda e Sashi.Estudantes de pós-graduação do meu laboratório: pa

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Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês...

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um...

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Para demonstrar imagem molecular do câncer MR com um pequeno peptídeo alvo MRI agente de contraste específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral em um modelo de câncer de próstata do rato.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Este protocolo descreve a síntese de nanopartículas biofuncionalizadas de azul da Prússia e seu uso como agentes de imagem molecular multimodais. As nanopartículas têm um design de núcleo-casca onde os íons de gadolínio ou manganês dentro do núcleo da nanopartícula geram contraste de ressonância magnética. O invólucro biofuncional contém fluoróforos para imagens de fluorescência e ligantes de direcionamento para direcionamento molecular.

Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

Este protocolo descreve a preparação e caracterização de um agente de contraste dendrimérico ressonância magnética (MRI), que transporta os quelatos macrocíclicos baseados-ciclen coordenação iões paramagnéticos gadolínio. Numa série de experiências de ressonância magnética in vitro, este agente produzido um sinal de ressonância magnética amplificado quando em comparação com o análogo monomérico comercialmente disponível.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de agentes de contraste à base de dendrímeros para Ressonância Magnética

Aqui, descrevemos um protocolo para radiomarcação e teste in vivo de derivados tridentados de quelato de 99mTc(I) e tetrazina para pré-direcionamento e química bio-ortogonal.

Preparação e Avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

O uso de moléculas de polidesoxinucleotídeo (aptâmero de 44 meros) para detectar o íon gadolínio (III) não quelado em uma solução aquosa é descrito. A presença do íon é detectada por meio de um aumento na emissão de fluorescência do sensor.

Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

Um protocolo é apresentado para a síntese de nanocristais de núcleo-casca dopado com lantanídeos upconversion (UCNs) e seus aplicativos de celulares para regulamento de proteína canal sobre iluminação de infravermelho próximo (NIR).

Síntese de Core-shell Lanthanide dopados com nanocristais de Upconversion para aplicativos de celulares

Processos de fabricação de iões lantanídeos magneticamente altamente responsivo quelantes polymolecular assemblies são apresentados. A resposta magnética é ditada pelo tamanho montagem, que é adaptado por extrusão através de membranas nanopore. As assembleias alignability magnética e temperatura induzido por alterações estruturais são monitoradas por medições de birrefringência, uma técnica complementar de ressonância magnética nuclear e a dispersão de nêutrons de ângulo pequeno.

Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias

Aqui, apresentamos um protocolo para obter68Ga núcleo dopado com óxido de ferro nanopartículas através de rápido orientado para o microondas síntese. A metodologia processa PET/nanopartículas de MRI (T1) com eficiência superior a 90% e a pureza radioquímica de 99% em uma síntese de 20 min de radioativos.

Síntese de nanopartículas de núcleo dopado com óxido de ferro Ga 68para tomografia por emissão de pósitrons Dual/imagem latente de ressonância magnética de (T1)

Aprenda a sintetizar, purificar e caracterizar complexos de lantanídeos para marcação de macromoléculas biológicas. Este método utiliza diálise e medidas de relaxometria para obter agentes de contraste para ressonância magnética.

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética (Vídeo) | JoVE Journal

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

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