Name: Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a sintetizar, purificar e caracterizar complexos de lantanídeos para marcação de macromoléculas biológicas. Este método utiliza diálise e medidas de relaxometria para obter agentes de contraste para ressonância magnética.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos fundos de inicialização de Wayne State University (MJA), uma bolsa da Fundação Americana para Aging Research (SMV), e um Caminho para a Independência Award Transição de Carreira (R00EB007129) do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia do Instituto Nacional da Saúde (MJA).

1. Metalation usando LnCl três sais <ol><li> Dissolver o ligante na água para produzir uma solução de 30-265 mM. O ligante 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-ácido dietileno pentaacetic (p-SCN Bn-DTPA) foi usado neste vídeo a uma concentração de 73 mM. </li><li> Ajustar o pH da solução do ligante para entre 5,5 e 7,0 pela adição de 1 M NH 4 OH. Neste vídeo, 0,2 mL de NH M 1 4 OH solução foi usado. </li><li> Dissolver 02/01 equivalentes de LnCl 3 em água para produzir uma solução com uma concentração de 5000-1000 mM. Neste vídeo, EuCl 3 e GdCl 3 foram usados ​​em concentrações de 111 mM. Um excesso de metal é usado frequentemente para conduzir o metalation até a conclusão e, consequentemente, simplificar a purificação. </li><li> Adicionar a solução de LnCl 3 para a solução de ligante, agitando. </li><li> Após a adição de LnCl 3, ajustar o pH da mistura de reação resultante para entre 5,5 e 7,0 pela adição de 0,2 M NH 4 OH. Um total de 0,5 mL de NH 4 M 0,2 solução de OH foi usado neste vídeo. Se o seu ligante contém ácido-sensíveis grupos funcionais, ajustar o pH várias vezes durante esta etapa. ATENÇÃO - Se a solução torna-se demasiado básica, qualquer base sensível grupos funcionais, como o isotiocianato, serão inutilizados para a conjugação. </li><li> Monitorar a reação via medições de pH. A reação é completa quando o pH se mantém constante. </li></ol> 2. Workup pH Raising (não incluído neste vídeo, mas bom para ligantes sem base sensível grupos funcionais) <ol><li> Adicionar concentrada NH 4 OH à mistura de reação para ajustar o pH a ≥ 11. Esta etapa irá precipitar os metais não complexada como o hidróxido insolúvel. </li><li> Filtrar o sobrenadante através de um filtro M 0,2. Se a mistura de reação entope o filtro, centrifugação e decantação antes de filtragem é recomendado. </li><li> Se a diálise não será realizada, remover solvente sob pressão reduzida (evaporação rotativa ou liofilização é recomendado). </li><li> 2,1-2,3 passos podem ser repetidos se lantanídeos livre permanece. </li></ol> 3. Diálise workup <ol><li> Corte o tubo de diálise com um comprimento adequado (siga as orientações do fabricante) para manter o volume de amostra, deixando comprimento extra (aproximadamente 10% do volume da amostra). Neste vídeo, um 100-500 dalton de peso molecular de corte de membrana (MWCO) foi usado, mas maiores tubos MWCO pode ser usado como apropriado se conjugação é realizada antes da metalation. Além disso, cassetes de diálise pode ser usado como uma alternativa ao tubo de diálise, se desejar. </li><li> Se for o caso com base em orientações do fabricante, mergulhe o tubo de diálise corte em água por 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Encher um reservatório de diálise (um copo de L 1 foi usado neste vídeo) com água (efluente). O volume de dialisato deve ser de aproximadamente 100 vezes a da amostra. </li><li> Uma extremidade do tubo vezes duas vezes e garantir a porção dobrada do tubo com uma pinça de fechamento de diálise. Enrole a ponta do encerramento com um elástico para garantir que ele permanece fechado durante a diálise. </li><li> Filtrar a mistura de reação através de um filtro 0,2 m, e carregar o filtrado para a extremidade aberta do tubo com cuidado para não rasgar o tubo. Certifique-se de deixar espaço de cabeça o suficiente para fechar a tubulação. </li><li> Dobre a outra extremidade aberta do tubo de duas vezes, segura com um fechamento, e enrole o fechamento com um elástico como no passo 3.4. </li><li> Anexar um frasco de vidro contendo ar, ao grampo em uma extremidade do tubo de diálise utilizando um elástico. Anexar um frasco contendo areia para a braçadeira outros. Esses frascos garantir que a tubulação fica imerso no dialisado. </li><li> Coloque a tubulação cheia no reservatório de diálise que contém dialisado. </li><li> Agitar o dialisado usando uma placa de agitação magnética a uma velocidade lenta (sem vórtice) à temperatura ambiente. </li><li> Alterar o dialisato 3x ao longo de um dia (neste vídeo, o dialisato foi alterada de 2,5, 6,5 e 11,5 h), e então permitir que a diálise para continuar durante a noite (para um total de 20-28 h de diálise). </li><li> Remova o tubo de diálise do dialisato e abra cuidadosamente um fechamento para remover a amostra. Lave o tubo de diálise 3x com água e combinam as lavagens com a amostra. </li><li> Retire a água sob pressão reduzida. Liofilização é usada neste vídeo. </li></ol> 4. Avaliação da presença de metal livre <ol><li> Dissolver o complexo de metal em tampão acetato (preparação buffer: Dissolver 1,4 mL de ácido acético em 400 mL de água, ajustar o pH para 5,8 com 1 M NH 4 OH, e acrescentar água para produzir um volume total de 500 mL) e adicione o xilenol indicador de laranja (16 mM em tampão pH 5,8). Neste vídeo, 0,3 mg do complexo foi dissolvida em 0,3 mL de tampão e 3 mL da solução do indicador foi adicionado. </li><li>Detectar a presença de metal livre através de observação de uma mudança de cor do indicador de amarelo para violeta. </li><li> Se desejar, a quantidade de metal livre pode ser quantificado através da criação de uma curva de calibração 1. Alternativamente, o corante arsenazo III pode ser usado em vez de xilenol laranja 2. Se o metal livre permanece, a amostra deve ser purificado utilizando diálise, uma coluna de dessalinização, ou cromatografia líquida (HPLC), antes da caracterização. </li></ol> 5. Determinação de água coordenação-número (q) <ol><li> Prepare uma solução para o Eu-III contendo complexo (~ 1 mm), em H 2 O e outra solução de mesma concentração em D 2 O. Antes da análise, a solução de D 2 O deve ser evaporada e dissolvida em D 2 O três vezes para remover residual H 2 O. </li><li> Adicionar a solução de água para uma cuvete limpa, e coloque a cubeta em um espectrofluorímetro. </li><li> Realizar exames de excitação e emissão para determinar os máximos para cada (~ 395 nm e ~ 595 nm, respectivamente). </li><li> Realizar um experimento de tempo de decaimento-fosforescência usando os seguintes parâmetros: excitação e emissão de comprimentos de onda determinado a partir do passo 5.3, de excitação e de emissão larguras de fenda (5 nm), flash count (100), atraso inicial (0,01 ms), prazo máximo (13 ms) e incremento de atraso (0,1 ms). Estas condições são apropriadas para a maioria dos complexos, mas o atraso máximo e os valores de incremento pode ser aumentada ou diminuída para espécies com tempos de decaimento muito longo ou muito curto. </li><li> Repita o passo 5,4 com a solução D O 2 preparada no passo 5.1. </li><li> A partir dos dados de luminescência de decaimento obtida em 5.4 e 5.5, o enredo do log natural de intensidade versus tempo. A inclinação dessas linhas são as taxas de decaimento (τ -1) (Figura 2). Neste vídeo, Microsoft Excel 2007 foi utilizado para gerar os gráficos log natural a partir dos dados brutos. Use as taxas de atenuação na equação desenvolvida por Horrocks e colegas de trabalho (eq 1) 3. Se o seu ligante contém OH ou NH grupos coordenados ao metal, então a equação deve ser modificada antes de utilizar 3. </li></ol> eq 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Equação 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"> 6. Medições de relaxação <ol><li> Selecione o modo de aplicação desejada no analisador tempo de relaxamento: T 1 (tempo de relaxamento longitudinal) ou T 2 (tempo de relaxamento transversal). </li><li> Preparar uma série de amostras que contêm diferentes concentrações de D-us III contendo complexos em um solvente aquoso. Neste vídeo, a água era utilizada como solvente e soluções de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 e 0 mM foram preparadas. Outros solventes aquosos ou buffers poderia ser usado, mas é importante usar o solvente como o branco. O volume final da amostra é específico para o instrumento que está sendo usado. </li><li> Colocar a amostra no instrumento e deixe descansar por 5 min para equilibrar a temperatura do instrumento (37 ° C neste vídeo). </li><li> Determinar o tempo de relaxamento (em unidades de s), ajustando os parâmetros do software para obter uma curva suave exponencial para T 1 ou T 2 (curvas representativas para T 1 e T 2 são mostrados na Figura 3). </li><li> Repita os passos 6.3 e 6.4 para todas as amostras, incluindo o espaço em branco. </li><li> Calcule o inverso da medida T 1 ou T 2 valores em unidades de s -1. </li><li> Plotar a T 1 -1 ou T 2 -1 contra D'us valores de concentração III (em unidades de mM). Devido à natureza de D'us III higroscópico contendo complexos, confirmar a concentração de D-us III usando espectrofotometria de absorção atômica ou indutivamente acoplado a espectrometria de massa de plasma. Fit a trama com uma linha reta. Uma parcela representativa é mostrado na Figura 4. </li><li> A inclinação da linha ajustada é a relaxação (r 1 ou r 2 para T 1 e T 2, respectivamente) e tem unidades de mM -1 s -1. </li></ol> 7. Resultados representante Dados representativos para as etapas deste protocolo foram incluídos na seção de tabelas e figuras. Além de o número de coordenação de água e caracterização relaxação descrito no protocolo, é importante para caracterizar produtos finais utilizando técnicas químicas padrão. A identidade do composto pode ser obtido por espectrometria de massa, e espectros de massa representante mostrando os padrões de isótopos de diagnóstico para D'us III - Eu e III contendo complexos são mostrados na Figura 5. Além disso, para não-Gd III <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Esquema geral para metalation e purificação:. Esquema representando o procedimento geral para metalation e razões para escolher rotas diferentes de purificação. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Luminescência intensidade parcela:. Enredo Representante do log natural de intensidade versus tempo da seção 5. As inclinações das linhas geradas a partir de curvas similares adquiridos para água e soluções de D 2 O são usados ​​com um eq para caracterizar o número de coordenação de água Eu III contendo complexos. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 curvas de relaxamento deterioração do tempo:. Dados Representante para (esquerda) e T 1 (direita) T 2 de aquisição. Desvios relativamente a estas formas de curva seria produzir dados confiáveis. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 determinação relaxação:. A parcela representativa de 1 / T 1 versus a concentração de D-us III. A inclinação da linha é equipada relaxação e tem unidades de mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5 espectros de massa:. Espectros Representante em massa, mostrando os padrões de isótopos de diagnóstico para (esquerda) Gd III contendo complexos e (direita) Eu III contendo complexos. Os picos preto Gaussian representam a distribuição dos isótopos teóricos e as linhas vermelhas são os dados reais.

<ol><li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li>
<li>Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+arsenazo+III+in+the+preparation+and+characterization+of+an+albumin-linked%2C+gadolinium-based+macromolecular+magnetic+resonance+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent.</a> J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).</li>
<li>Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+determination+of+the+number+of+water+molecules%2C+q%2C+coordinated+to+europium%28III%29+ions+in+solution+from+luminescence+decay+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes.</a> Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).</li>
<li>Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+drug+and+imaging+conjugates%3A+design+considerations+for+nanomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.</a> Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).</li>
<li>Que, E. L., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+as+chemical+sensors+for+metals+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).</li>
<li>Uppal, R., Caravan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+probes+for+cardiovascular+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeted probes for cardiovascular MR imaging.</a> Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).</li>
<li>Major, J. L., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresponsive%2C+cell-penetrating%2C+and+multimeric+MR+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).</li>
<li>Datta, A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gd-hydroxypyridinone+%28HOPO%29-based+high-relaxivity+magnetic+resonance+imaging+%28MRI%29+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).</li>
<li>León-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsive+MRI+agents+for+sensing+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo.</a> Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).</li>
<li>Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li>
<li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gadolinium%28III%29+chelates+as+MRI+contrast+agents%3A+structure%2C+dynamics%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li>
<li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging%3A+theory+and+design%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li>
<li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li>
<li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li>
<li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+in+the+preparation+of+dendrimer-based+bifunctional+diethylenetriaminepentaacetic+acid+MR+contrast+agent+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives.</a> Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).</li>
<li>Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+MRI+properties+between+derivatized+DTPA+and+DOTA+gadolinium-dendrimer+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).</li>
<li>Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li>
<li>León-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li>
<li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+biological+evaluation+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23-targeted+PAMAM+dendrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado o número crescente de publicações que incluem agentes de contraste à base de lantanídeos 14/04, é importante que seja tomado cuidado na preparação, purificação e caracterização de produtos para garantir resultados reprodutíveis e comparáveis. Estes complexos são muitas vezes considerados desafiadores para purificar e caracterizar moléculas orgânicas em relação ao devido à sua natureza paramagnética ea sensibilidade de qualquer grupo funcional que pode ser usado para bioconjugation. Nós descrevemos método...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagentes e Equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203254-5G </td></tr><tr><td> p SCN-Bn-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> hidróxido de amônio </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Celulose Ester (CE) Membrana de Diálise - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG Unidades Filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xilenol laranja tetrasodium sal </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> depurador de água </td><td> ELGA </td><td> PURELAB Ultra </td></tr><tr><td> cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analisador de tempo de relaxamento </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro UV-vis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> liofilizador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> medidor de pH </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> espectrofluorímetro </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Versão Calculadora Peso Molecular 6,46 por Matthew Monroe, baixado 17 out, 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculadora de Peso Molecular </td></tr></tbody></table>

purificação de preparação, e caracterização de complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para imagem por ressonância magnética

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate baseado ligantes são comumente usados ​​para quelar íons lantanídeos, e os complexos resultantes são úteis como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI). Muitos ligantes disponíveis comercialmente são especialmente úteis porque contêm grupos funcionais que permitem rápido, de alta pureza e alto rendimento conjugação de macromoléculas e biomoléculas através de amina-reativo ésteres ativados e grupos isotiocianato ou tiol-reativa Maleimidas. Enquanto metalation desses ligantes é considerada o conhecimento comum no campo da química bioconjugation, diferenças sutis em procedimentos metalation devem ser levados em consideração na seleção de materiais metálicos de partida. Além disso, várias opções para a purificação e caracterização de existir, e seleção do procedimento mais eficaz depende em parte da seleção de matérias-primas. Essas diferenças sutis são muitas vezes negligenciados nos protocolos publicados. Aqui, nosso objetivo é demonstrar os métodos comuns para metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos que podem ser usados ​​como agentes de contraste para ressonância magnética (Figura 1). Esperamos que esta publicação irá permitir que os cientistas biomédicos para incorporar as reações de complexação lantanídeos em seu repertório de reações comumente utilizados, facilitando a seleção de matérias-primas e métodos de purificação.

Demonstramos a metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos. Os complexos descrito aqui pode ser conjugado com macromoléculas para habilitar o rastreamento destas moléculas usando ressonância magnética.

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

Ligantes baseados em poliaminopolicarboxilatos são comumente usados para quelar íons lantanídeos, e os complexos resultantes são úteis como agentes de contraste para...

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que possam ser utilizados para marcar macromoléculas biológicas. Isso é realizado primeiramente misturando o material metálico inicial e o ligante, controlando ao mesmo tempo o pH da solução. O segundo passo do procedimento consiste em purificar o complexo resultante utilizando diálise.Em seguida, é necessário verificar a ausência de metal livre. O passo final do procedimento é a caracterização das propriedades do complexo relevantes para a imagem. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram que os complexos sintetizados atuarão como agentes de contraste por meio de medições de atividade de relaxação.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imagem, como se o número de coordenação da água de um agente de contraste muda ao se ligar a uma proteína. Geralmente, indivíduos que necessitam deste método enfrentarão dificuldades, pois não controlar cuidadosamente o pH tornará o LI inútil para a educação em biociências. A demonstração das medidas de diálise e atividade será realizada por Buda e Sashi.Estudantes de pós-graduação do meu laboratório: para iniciar a metalação utilizando sais de lantanídeo, primeiro dissolva uma equivalência de ligante em água para produzir uma solução entre 30 e 265 milimolares. O ligante Paraiso Benzyl DTPA é usado aqui numa concentração de 73 milimolares. Em seguida, ajuste o pH da solução do ligante entre 5,5 e sete adicionando hidróxido de amônio 1 molar.Neste vídeo, 0,2 mililitros da solução um molar de hidróxido de amônio são usados para dissolver de um a duas equivalentes de cloreto de lantanídeo em água, produzindo uma solução com concentração de cinco a 1000 milimolares. Pode-se usar cloreto de európio ou cloreto de gadolínio em concentrações de 111 milimolares. Frequentemente, utiliza-se um excesso de metal para levar a reação à conclusão e, consequentemente, simplificar a purificação.Em seguida, adicione cada solução de sais de lantânio à solução preparada do ligante sob agitação. Ajuste agora o pH das misturas reacionais resultantes entre 5,5 e sete mediante a adição de hidróxido de amônio 0,2 molar. Aqui, um volume total de 0,5 mililitro da solução de hidróxido de amônio 0,2 molar é utilizado para ajustar a solução.Se o ligante utilizado contiver grupos funcionais sensíveis a ácido, ajuste o pH várias vezes durante esta etapa. Tenha cuidado ao ajustar o pH, pois se a solução tornar-se muito básica, quaisquer grupos funcionais sensíveis à base, como isotiocianato, tornar-se-ão inutilizáveis. Para a conjugação, monitore atentamente a reação por meio de medições de pH.A reação está completa quando o pH permanece constante. Para ligantes sem grupos funcionais sensíveis à base, um tratamento que envolva o aumento do pH também pode ser útil. Para iniciar o tratamento por diálise, determine um comprimento apropriado de tubo de diálise para conter o volume da amostra mais um comprimento adicional para acomodar 10% a mais do volume da amostra. Em seguida, siga as orientações do fabricante para cortar o tubo nesse comprimento.Neste vídeo, foi utilizada uma membrana com corte de peso molecular de 100 a 500 Daltons, mas pode-se usar tubos com corte de peso molecular maior, conforme apropriado, se a conjugação for realizada antes da metilação, se adequado. Com base nas orientações do fabricante, mergulhe o tubo de diálise cortado em água por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, encha um reservatório de diálise com água, que servirá como diafiltrante. Um béquer de um litro é usado aqui.O volume do dializado deve ser aproximadamente 100 vezes maior que o do amostra. Dobre agora uma extremidade do tubo duas vezes e fixe a parte dobrada com o grampo de fechamento para diálise. Enrole a extremidade do grampo com uma borracha para garantir que permaneça fechada durante a diálise.Filtre a mistura de reação previamente preparada através de um filtro de 0,2 mícrons. Em seguida, carregue o filtrado na extremidade aberta da tubulação, tomando cuidado para não rasgar a tubulação.Certifique-se de deixar espaço suficiente para fechar o tubo. Dobre duas vezes a extremidade aberta restante do tubo, depois fixe-a com um fecho e enrole o fecho com um elástico. Em seguida, prenda um frasco de vidro contendo ar à pinça em uma das extremidades do tubo de diálise usando outro elástico.Em seguida, prenda um frasco contendo areia ao outro grampo. Esses frascos garantem que o tubo permaneça imerso no dialisato. Agora, coloque o tubo inteiro no reservatório de diálise que contém o dialisato.Agite o dializado usando uma placa de agitação magnética em velocidade baixa à temperatura ambiente. Certifique-se de que a velocidade de agitação permaneça baixa e que a solução não vorte. Troque o dializado três vezes ao longo de um dia.Neste vídeo, o dializado é trocado às 2,5, 6,5 e 11,5 horas. Deixe a diálise prosseguir durante a noite, por um tempo total de 20 a 28 horas. Após a conclusão da diálise, remova o tubo do dializado e abra cuidadosamente um fechamento para retirar a amostra.Lave o tubo de diálise três vezes com água e combine as lavagens com a amostra. Por fim, remova a água da amostra sob pressão reduzida aqui. Isso é realizado por liofilização.A amostra é congelada e, em seguida, colocada em um aparelho de liofilização. Para avaliar a presença de metal livre na amostra, prepare primeiro o tampão acetato dissolvendo 1,4 mililitros de ácido acético em 400 mililitros de água, ajuste o pH para 5,8 com hidróxido de amônio 1 molar e adicione água para obter um volume total de 500 mililitros. Em seguida, dissolva 0,3 miligramas de cada complexo em 0,3 mililitros de tampão.Agora prepare o indicador xol laranja, que deve ter concentração de 16 micromolar no tampão pH 5,8. Adicione três mililitros dessa solução indicadora aos complexos metálicos previamente dissolvidos. Detecte a presença de metal livre pela observação da mudança de cor do indicador, de amarelo para violeta.Se desejar, a quantidade de metal livre pode ser quantificada mediante a criação de uma curva de calibração. Se restar metal livre, a amostra deve ser purificada adicionalmente utilizando diálise ou cromatografia líquida de alta eficiência antes da caracterização. Em seguida, para determinar o número de coordenação com água de uma amostra de ópio, prepare uma solução de cerca de um milimolar do complexo contendo ópio em água e, depois, outra solução da mesma concentração em óxido de deutério.Antes da análise, a solução de óxido de deutério deve ser evaporada e dissolvida em óxido de deutério três vezes para remover a água residual, ligue o espectrofluorímetro, adicione a solução aquosa a uma cubeta limpa e coloque a cubeta no espectrofluorímetro. Em seguida, realize as excitações e emissões para determinar os máximos para cada uma em aproximadamente 395 nanômetros, 595 nanômetros, respectivamente. A seguir, realize um experimento de decaimento temporal de fosforescência utilizando os comprimentos de onda de excitação e emissão recém-determinados e os parâmetros exibidos aqui.Repita este passo com uma solução preparada de óxido de deutério a partir dos dados de decaimento da luminescência obtidos recentemente; plote o logaritmo natural da intensidade versus tempo. Os coeficientes angulares dessas retas são as taxas de decaimento. Neste vídeo, o Microsoft Excel 2007 foi utilizado para gerar os gráficos de logaritmo natural a partir dos dados brutos.Utilize as taxas de decaimento na equação desenvolvida por Hors e colaboradores mostrada aqui. Se o seu ligante contiver grupos OH ou NH coordenados ao metal, então a equação deve ser modificada antes do uso. Para determinar as medidas de relaxividade da amostra, primeiro selecione o modo de aplicação desejado no analisador de tempo de relaxação, seja T um ou T dois.Aqui, a configuração T um é selecionada. Em seguida, prepare uma série de amostras que contenham diferentes concentrações do complexo contendo lantanídeo em um solvente apropriado. Aqui, a água é usada como solvente e soluções de dez cinco dois 0,5, 1,25, 0,625 e zero.São preparados em milimolar. Outros solventes ou tampões podem ser usados, mas é importante utilizar o solvente como branco. O volume final da amostra é específico para o instrumento que está sendo utilizado.Coloque uma amostra no instrumento e deixe repousar por cinco minutos para equilibrar à temperatura do instrumento, que é de 37 graus Celsius para a unidade utilizada neste vídeo. Agora, determine o tempo de relaxação em unidades de segundos ajustando os parâmetros do software para obter uma curva exponencial suave para T um ou T dois. Repita isso para todas as amostras, incluindo a amostra em branco.Agora, calcule o inverso dos valores medidos de T um ou T dois de relaxação e faça o gráfico. Esses valores em função da concentração de Lantan, em unidades de milimolar, devem ser ajustados com uma linha reta. A inclinação da linha ajustada é a atividade de relaxação, sendo R um ou R dois para T um e T dois, respectivamente.Aqui observamos o esquema geral para mediação e purificação. Este esquema descreve o procedimento geral para metação e os motivos para escolher diferentes rotas de purificação. Aqui vemos um gráfico representativo de decaimento da luminescência no qual o logaritmo natural do decaimento é plotado em função do tempo; os coeficientes angulares das retas obtidas a partir de curvas semelhantes para soluções aquosas e de óxido de deutério são utilizados com a equação um para determinar o número de coordenação de água em complexos contendo ópio.Um exemplo representativo de medições de livilidade pode ser visto aqui, com a inclinação da linha ajustada correspondendo à livilidade T1 da amostra. Além do número de coordenação da água e da caracterização da livilidade descritos no protocolo, também é importante caracterizar os produtos finais utilizando técnicas químicas padrão. A identidade do composto pode ser obtida por espectrometria de massas; espectros de massa representativos, mostrando os padrões isotópicos diagnósticos para complexos contendo gadolínio e ópio, são apresentados aqui.Após este procedimento, outros métodos como espectroscopia ENDOR, HPLC e análise elementar podem ser realizados para caracterizar mais completamente os complexos obtidos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar, purificar e caracterizar complexos contendo lantanídeos que podem ser usados para marcar macromoléculas biológicas.

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês...

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Para demonstrar imagem molecular do câncer MR com um pequeno peptídeo alvo MRI agente de contraste específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral em um modelo de câncer de próstata do rato.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Este protocolo descreve a síntese de nanopartículas biofuncionalizadas de azul da Prússia e seu uso como agentes de imagem molecular multimodais. As nanopartículas têm um design de núcleo-casca onde os íons de gadolínio ou manganês dentro do núcleo da nanopartícula geram contraste de ressonância magnética. O invólucro biofuncional contém fluoróforos para imagens de fluorescência e ligantes de direcionamento para direcionamento molecular.

Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

Este protocolo descreve a preparação e caracterização de um agente de contraste dendrimérico ressonância magnética (MRI), que transporta os quelatos macrocíclicos baseados-ciclen coordenação iões paramagnéticos gadolínio. Numa série de experiências de ressonância magnética in vitro, este agente produzido um sinal de ressonância magnética amplificado quando em comparação com o análogo monomérico comercialmente disponível.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de agentes de contraste à base de dendrímeros para Ressonância Magnética

Aqui, descrevemos um protocolo para radiomarcação e teste in vivo de derivados tridentados de quelato de 99mTc(I) e tetrazina para pré-direcionamento e química bio-ortogonal.

Preparação e Avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

O uso de moléculas de polidesoxinucleotídeo (aptâmero de 44 meros) para detectar o íon gadolínio (III) não quelado em uma solução aquosa é descrito. A presença do íon é detectada por meio de um aumento na emissão de fluorescência do sensor.

Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

Um protocolo é apresentado para a síntese de nanocristais de núcleo-casca dopado com lantanídeos upconversion (UCNs) e seus aplicativos de celulares para regulamento de proteína canal sobre iluminação de infravermelho próximo (NIR).

Síntese de Core-shell Lanthanide dopados com nanocristais de Upconversion para aplicativos de celulares

Processos de fabricação de iões lantanídeos magneticamente altamente responsivo quelantes polymolecular assemblies são apresentados. A resposta magnética é ditada pelo tamanho montagem, que é adaptado por extrusão através de membranas nanopore. As assembleias alignability magnética e temperatura induzido por alterações estruturais são monitoradas por medições de birrefringência, uma técnica complementar de ressonância magnética nuclear e a dispersão de nêutrons de ângulo pequeno.

Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias

Aqui, apresentamos um protocolo para obter68Ga núcleo dopado com óxido de ferro nanopartículas através de rápido orientado para o microondas síntese. A metodologia processa PET/nanopartículas de MRI (T1) com eficiência superior a 90% e a pureza radioquímica de 99% em uma síntese de 20 min de radioativos.

Síntese de nanopartículas de núcleo dopado com óxido de ferro Ga 68para tomografia por emissão de pósitrons Dual/imagem latente de ressonância magnética de (T1)

Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

Aprenda a sintetizar, purificar e caracterizar complexos de lantanídeos para marcação de macromoléculas biológicas. Este método utiliza diálise e medidas de relaxometria para obter agentes de contraste para ressonância magnética.

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética (Vídeo) | JoVE Journal

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

Explorar mais vídeos