Fabricação de Matriz Extracelular a partir de Modelo de Camundongo: Um Procedimento Eficaz para Preparar Matriz Extracelular de Língua Descelularizada a partir de Língua Murina

A matriz extracelular ou ECM - o componente não celular do ambiente tecidual - consiste em uma rede complexa de proteínas estruturais e reguladoras e polissacarídeos secretados pelas células. A ECM fornece suporte estrutural e bioquímico às células e regula seu crescimento.

Para preparar a matriz extracelular da língua, comece pegando uma língua de camundongo recém-colhida. Lave-o com etanol para remover sua camada lipídica.

Em seguida, sujeite-o a ciclos alternados de congelamento e descongelamento. O congelamento promove a formação de cristais de gelo intracelulares, enquanto o descongelamento derrete os cristais de gelo, resultando na ruptura da membrana celular.

Agora, suspenda a língua em uma solução antibiótica para inibir o crescimento bacteriano. Posteriormente, trate o órgão com uma solução salina hipertônica. Na presença de uma alta concentração de soluto, a água flui para fora das células, fazendo com que elas encolham. Esta etapa auxilia na morte celular e no desprendimento da matriz extracelular.

Incubar a língua num tensioactivo não iónico. O surfactante solubiliza completamente as membranas celular e nuclear, facilitando a liberação do conteúdo intracelular na solução.

Por fim, suspenda a língua em uma solução contendo íons cálcio e magnésio, seguido de tratamento com nucleases. Os íons cálcio e magnésio aumentam a atividade das nucleases para degradar quaisquer ácidos nucléicos livres na solução.

Armazene o tecido descelularizado da língua em um tampão adequado até o processamento posterior.

Depois de isolar as línguas dos camundongos sacrificados de acordo com o protocolo de texto, mergulhe o tecido em etanol a 75% por 3 minutos. Em seguida, transfira cada língua para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 1 mililitro de PBS estéril de 10 milimolares. Para realizar a lise celular, congele as línguas a menos 80 graus Celsius por 1 hora. Em seguida, descongele o tecido em temperatura ambiente por 45 minutos. Repita o congelamento e descongelamento mais duas vezes.

Em seguida, em uma placa de cultura de 3,5 ou 6 centímetros contendo etanol a 75%, use uma agulha cirúrgica para carregar cada língua em um pedaço de sutura cirúrgica e, com um pequeno pedaço de papel alumínio estéril, enrole a extremidade da sutura. Em uma placa de cultura de 3,5 ou 6 centímetros, use 3 mililitros de PBS para enxaguar cada língua por 30 segundos. Em seguida, em uma garrafa de boca larga, prepare 90 microgramas por mililitro de ampicilina em 250 mililitros de água ultrapura estéril e adicione uma barra de agitação.

Abaixe até 5 línguas no frasco até que estejam a aproximadamente 2 centímetros do fundo e aperte a tampa com parte da sutura permanecendo fora do frasco. Coloque a garrafa em um agitador magnético por 12 horas. Em seguida, após a incubação, prepare 250 mililitros de 90 microgramas por mililitro de ampicilina em cloreto de sódio 1 molar estéril. Transfira as línguas e mexa para dentro da garrafa e enrosque a tampa. Coloque a garrafa no agitador magnético por 24 horas.

Para realizar a lise celular, prepare 90 microgramas por mililitro de ampicilina em 250 mililitros de Triton X-100 estéril a 2% em PBS. Transfira as línguas e a barra de agitação para o frasco e aperte a tampa. Em seguida, mexa a garrafa por 48 horas. Depois de preparar o cloreto de cálcio e o cloreto de magnésio com ampicilina, mova o lenço de papel e mexa a barra para dentro da garrafa e mexa a garrafa por 24 horas.

Prepare 1 mililitro de 300 DNase micromolar em HBSS em um tubo de microcentrífuga para cada amostra de língua. Transfira as línguas para os tubos com a mesma porção de sutura pendurada do lado de fora. Em seguida, incube o tecido a 37 graus Celsius por 24 horas. Transfira as amostras de volta para um frasco de boca larga de PBS estéril com ampicilina e coloque-o no agitador por 24 horas. Após a incubação, armazene a matriz extracelular da língua preparada, ou TEM, em PBS estéril a 4 graus Celsius até o uso.