Transformação gênica baseada em vetor cromossômico artificial bacteriano binário em plantas de Arabidopsis: uma técnica para gerar plantas transgênicas com inserção de cópia única

Comece com plantas Arabidopsis com cabeças de flores imaturas. Mergulhe as cabeças das flores em suspensão de células Agrobacterium carregando T-DNA clonado com cromossomo artificial bacteriano binário ou BIBAC, um vetor que se replica nos sistemas E. coli e Agrobacterium. Este vetor binário de T-DNA pode fornecer grandes transgenes, como gene de resistência a herbicidas e marcadores selecionáveis fluorescentes ao longo de um promotor específico de sementes.

Enquanto as cabeças das flores ainda estão imersas, agite suavemente as plantas para aumentar seu contato com a Agrobacterium. Com sua capacidade inerente de infectar plantas, o Agrobacterium transfere o transgene para a célula floral. À medida que o transgene entra na célula, ele se move para o núcleo e se funde com o genoma da planta.

Agora, embrulhe a planta em filme plástico e incube no escuro para reter a umidade para melhorar a transformação. Remova o filme e cultive as plantas em condições fisiológicas até que produzam sementes.

Em seguida, colha as sementes e observe ao microscópio de fluorescência para selecionar os transformantes. Agora, cultive as sementes transformadas em condições adequadas até a germinação. Pulverize as plantas com herbicida e incuba.

Plantas com inserção de múltiplos transgenes experimentam silenciamento e murchamento de genes, enquanto plantas com inserção de cópia única expressam uma enzima metabolizadora de herbicida ativa e sobrevivem ao tratamento. Extraia o DNA genômico dos transformantes sobreviventes e realize PCR para calcular a eficiência da inserção de cópia única.

Para preparar as plantas de Arabidopsis para a transformação, cultive as plantas de Arabidopsis em uma estufa ou câmara de crescimento climatizada, até que estejam florescendo. Prenda os primeiros parafusos para permitir que mais parafusos secundários surjam. As plantas estão prontas para mergulhar quatro a seis dias após o corte, quando as plantas têm muitas cabeças de flores imaturas e não muitas sílicas fertilizadas.

Para realizar a imersão floral, mergulhe as inflorescências por 5 a 10 segundos em suspensão de Agrobacterium. Use agitação suave. Enrole as partes acima do solo das plantas em filme plástico para manter a umidade alta e cubra os vasos com uma caixa para manter as plantas no escuro.

Incube as plantas por dois dias em uma estufa ou câmara de crescimento. Após dois dias, remova a caixa e o filme plástico e cultive as plantas até a maturidade em uma estufa ou câmara de crescimento. Para aumentar a eficiência da transformação, as mesmas plantas podem ser mergulhadas novamente sete dias após a primeira imersão.

Em seguida, quando as plantas transformadas estiverem maduras e secas, colha as sementes. Agrupe e analise as sementes de plantas transformadas com a mesma construção de um único conjunto. Caso as plantas sejam transformadas com um derivado de plasmídeo BIBAC-RFP-Gateway, identifique as plantas transgênicas analisando as sementes usando microscopia de fluorescência.

Para detectar a expressão de DsRed em tegumentos, obtenha imagens das sementes com uma excitação de 560 nanômetros e emissão de 600 a 650 nanômetros. Separe as sementes fluorescentes das não fluorescentes usando uma pinça.

Para rastrear plantas transgênicas transformadas com um derivado de plasmídeo BIBAC-BAR-Gateway, semeie as sementes em bandejas cheias de terra. Garanta uma distribuição uniforme das sementes em bandejas, suspendendo as sementes em ágar 0,1% em meio MS 0,5X, e espalhe as sementes usando uma pipeta de 1 mililitro.

Estimule as sementes a germinar de maneira síncrona, incubando as sementes por pelo menos dois dias a 4 graus Celsius. Isso pode ser feito antes ou depois de semear as sementes. Duas e três semanas após a semeadura, pulverize as mudas com solução de glufosinato-amônio a 0,5%. Use 500 mililitros de solução de glufosinato-amônio por 1 metro quadrado. Transfira as mudas sobreviventes para vasos. Analisar as plantas resistentes ao glufosinato-amônio, por PCR, para a presença do construto de interesse.